TWI786424B - 一種中草藥組合物用於製備預防或治療皮膚病癥的外用藥物的用途 - Google Patents

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姜智釗
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汪依璿
張祐嘉
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本發明提供一種中草藥組合物用於製備預防或治療皮膚病癥的外用藥物的用途，其中該中草藥組合物係包含：6-7重量份的滑石，4-6重量份的茵陳蒿，4-5重量份的黃芩，2-3重量份的石菖蒲，2-3重量份的木通，2-3重量份的川貝母，1-2重量份的藿香，1-2重量份的連翹，1-2重量份的白荳蔻，1-2重量份的薄荷，1-2重量份的射干。

Description

一種中草藥組合物用於製備預防或治療皮膚病癥的外用藥物的用途
本發明係有關於一種中草藥組合物用於製備預防或治療皮膚病癥的外用藥物的用途，其中該中草藥組合物係包含：6-7重量份的滑石，4-6重量份的茵陳蒿，4-5重量份的黃芩，2-3重量份的石菖蒲，2-3重量份的木通，2-3重量份的川貝母，1-2重量份的藿香，1-2重量份的連翹，1-2重量份的白荳蔻，1-2重量份的薄荷，1-2重量份的射干。
牛皮癬是一種慢性免疫介導的皮膚病，影響了全球約2%的人口(大於1.25億人)。男女在所有年齡段均受到同等影響。牛皮癬表現為可出現在身體任何部位的增厚，紅斑和鱗片狀斑塊。它的特徵是角質細胞(keratinocytes)過度增殖和異常分化，以及包括嗜中性球，T細胞和樹突狀細胞在內的各種先天性和適應性免疫細胞的浸潤。嗜中性球的積累是牛皮癬的組織學標誌。已經發現嗜中性球在牛皮癬的維持階段(maintenance stage)參與擴增反饋(amplification feedback)，導致許多趨化因子(chemokines)從角質細胞中釋放出來。此外，NET的形成與牛皮癬的嚴重程度有關。研究表明，患有頑固性牛皮癬的患者在嗜中性球耗竭後會顯著改善。因此，嗜中 性球及其相關的ROS和NET在牛皮癬中起重要作用。
嗜中性球(Neutrophils)是循環中最豐富的白血球，其透過吞噬作用(phagocytosis)，超氧陰離子(superoxide anion)產生的呼吸爆發(respiratory bursts)，伴隨彈性蛋白酶(elastase)釋放的脫粒(degranulation)，細胞激素(cytokine)的產生，以及嗜中性球胞外網狀結構(neutrophil extracellular trap，NET)的形成等多種機制來調節先天性免疫。嗜中性球還調節適應性免疫。然而，過量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，蛋白水解酶(proteolytic enzymes)和NETs有害並可能導致各種病理狀況，包括感染性疾病如敗血症，慢性炎性疾病如動脈粥樣硬化和慢性阻塞性肺疾病，自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡和牛皮癬，以及其他疾病如癌症和糖尿病。
IMQ是一種TLR-7/8促效劑(agonist)，外部施用後可導致牛皮癬樣皮膚發炎。皮膚症狀包括發紅，脫屑和增厚。顯微鏡下可觀察到的特徵包括嗜中性白細胞浸潤，微膿腫(micro-abscess)形成，棘皮症(acanthosis)和角化過度(hyperkeratosis)。
甘露消毒丹(Kan-Lu-Hsiao-Tu-Tan，KLHTT)是中藥治療“溫病”的著名配方。葉桂首先在中國清代《續名醫類案》中開立了處方。KLHTT由11種草藥組成：滑石(Soapstone，[Mg3Si4O10(OH)2])，茵陳蒿(Artemisia capillaris Thunb.)，黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)，石菖蒲(Acorus gramineus Soland.)，木通(Clematis armandii Franch.)，川貝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)，藿香(Pogostemon cablin(Blanco)Benth.)，連翹 (Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl)，白豆蔻(Amomum kravanh Pierre ex Gagnep.)，薄荷(Mentha haplocalyx Briq)和射干(Belamcanda chinensis(L.).DC.)。
本發明中調查了KLHTT對人類嗜中性球的抗炎作用及其在治療以咪喹莫特(imiquimod，IMQ)誘導的牛皮癬樣皮膚炎症中的治療潛力。
本發明呈現了無論在IMQ誘導之前或之後施用KLHTT，外用KLHTT均可顯著提高單獨(individual)和累積(cumulative)乾癬面積暨嚴重度指數(psoriasis area and severity index，PASI)評分。在IMQ誘導的牛皮癬樣皮膚炎症中，外用KLHTT並可以減少嗜中性球浸潤並使表皮變薄。
本發明呈現了KLHTT抑制了由不同刺激所活化的人類嗜中性球中超氧陰離子的產生及相關的ROS釋放。KLHTT在AAPH分析中發揮了清除ROS的作用。但是，KLHTT不直接清除無細胞(cell-free)黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶系統中產生的超氧陰離子。這顯示了KLHTT透過直接清除和間接調節細胞應答(cell responses)來減少嗜中性球ROS的形成。此外，本發明並揭露了KLHTT減弱了由PMA所活化的人類嗜中性球的NET形成。NETs是由上面塗佈有許多中性成分，例如彈性蛋白酶和MPO，的濃縮染色質組成的類網狀結構。NETs導致了高度免疫原性的環境。NETs的形成主要透過ROS依賴機制(ROS-dependent mechanisms)進行。ROS刺激MPO和彈性蛋白酶使染色質去濃縮，隨後導致NET形成。本發明數據表明，KLHTT透過抑制ROS依賴性途徑來抑制NET的形成。KLHTT還降低了活化的人類嗜中性球中CD11b的表達和細胞粘附(cell adhesion)。在牛皮癬患者中，嗜中性球呼吸爆 發的發生與ROS的過量產生有關。此外，牛皮癬中NET的形成增加，並且NET的數量與嚴重程度相關。綜上所述，KLHTT透過抑制嗜中性球活化來改善IMQ誘導的小鼠牛皮癬樣皮膚炎症，這可能是由於ROS衰減，抑制CD11b表達和粘附以及限制NET形成而發生的。
本發明揭露了KLHTT對人的嗜中性球具有有效的抗炎作用。本發明並揭露了KLHTT是治療牛皮癬樣皮膚炎症的有效中藥。因此，KLHTT的外部施用可做為改善牛皮癬患者治療的有效方式。
本發明係有關於一種中草藥組合物用於製備預防或治療皮膚病癥的外用藥物的用途，其中該中草藥組合物係包含：6-7重量份的滑石，4-6重量份的茵陳蒿，4-5重量份的黃芩，2-3重量份的石菖蒲，2-3重量份的木通，2-3重量份的川貝母，1-2重量份的藿香，1-2重量份的連翹，1-2重量份的白荳蔻，1-2重量份的薄荷，1-2重量份的射干。
於一實施例中，該皮膚病癥係為紅斑，脫屑，皮膚增厚，角化過度，微膿腫的形成，或嗜中性球的累積。
於一實施例中，該皮膚病癥係為皮膚炎症。
於一實施例中，該皮膚病癥係為牛皮癬。
於一實施例中，該外用藥物改善了患部脫屑的情形。
於一實施例中，該外用藥物改善了患部紅斑的情形。
於一實施例中，該外用藥物減少了患部表皮厚度。
於一實施例中，該外用藥物減輕了患部嗜中性球的浸潤。
於一實施例中，該外用藥物減輕了患部嗜中性球的募集。
圖1、甘露消毒丹(KLHTT)的化學指紋圖譜。由HPLC-UV在272奈米處獲得的色譜圖。(A)六種標準參考，包括：1：綠原酸(Chlorogenic acid)；2：貝加靈(Baicalin)；3：連翹苷(Forsythin)；4：漢黃岑苷(Wogonoside)；5：貝加因(Baicalein)；6：漢黃岑素(Wogonin)。(B)KLHTT的HPLC-UV指紋圖譜。
圖2、KLHTT抑制活化的人類嗜中性球中細胞外超氧陰離子的生成。將人類嗜中性球與二次水(ddH2O，0.1%，作為對照)或KLHTT(1、3或10微克/毫升)培養5分鐘，並以(A)fMLF，(C)MMK-1或(D)m-3M3FBS活化10分鐘，(B)PMA活化5分鐘，或(E)NaF活化30分鐘。超氧化物陰離子的生成係以鐵細胞色素c(ferricytochrome c)在550奈米處的還原監測。(F)將人類嗜中性球以ddH2O或KLHTT培養15分鐘。細胞毒性以無細胞培養基中LDH釋放佔總LDH釋放的百分比表示。從在37℃下以0.1%Triton X-100裂解30分鐘的細胞中測定LDH的總釋放量。所有數據均表示為平均值±S.E.M.(n=3或4)。與單獨的不同興奮劑相比，* p<0.05，** p<0.01，*** p<0.001。
圖3、KLHTT抑制活化的人類嗜中性球中細胞內的超氧陰離子的生成。將人類嗜中性球與ddH2O或KLHTT(3和10微克/毫升)培養5分鐘，並透過fMLF活化。使用HE螢光的減少來測量超氧陰離子的產生。所有數據均表示為平均值±S.E.M.(n=3)。與單獨的fMLF相比，*** p<0.001。
圖4、KLHTT在活化的人類嗜中性球中不抑制彈性蛋白酶的釋放。將人類嗜中性球與ddH2O或KLHTT(1、3或10微克/毫升)培養5分鐘，並使用(A)fMLF，(B)MMK-1，(C)LTB4，(D)m-3M3FBS，(E)IL-8 或(F)PAF活化10分鐘。彈性蛋白酶的釋放是在405奈米處用分光光度法測量的。所有數據均表示為平均值±S.E.M.(n=3)。
圖5、KLHTT抑制活化的人類嗜中性球中ROS的產生。(A)將人類嗜中性球(7×105細胞/毫升)與ddH2O或KLHTT(1、3和10微克/毫升)培養5分鐘，並用fMLF刺激6分鐘。(B)化學發光峰表示為平均值±S.E.M。(n=6)。與單獨的fMLF相比，*** p<0.001。與基準相比，# p<0.001。
圖6、KLHTT具有ROS清除作用。(A)將黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase)與ddH2O，KLHTT(1、3和10微克/毫升)或20U/毫升超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，作為陽性對照)培養3分鐘，然後將黃嘌呤(0.1毫莫耳濃度)添加10分鐘。黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶(xanthine/xanthine oxidase)誘導的超氧陰離子對WST-1的還原是在450奈米處用分光光度法測量的。(B，C)在KLHTT和Trolox存在下AAPH的螢光衰減曲線(D)曲線下面積(area under the curye，AUC)(E)ABTS與ddH2O，KLHTT(1、3和10微克/毫升)培養，或維生素C(10、15和30微莫耳濃度)。分光光度法在734奈米下測量ABTS的減少。(F)將DPPH與ddH2O，KLHTT(1、3和10微克/毫升)或維生素E(3、15和30微莫耳濃度)培養。DPPH的減少係以分光光度法在517奈米處測量。所有數據均表示為平均值±S.E.M.(n=3)。與對照相比，* p<0.05，** p<0.01和*** p<0.001。
圖7、KLHTT減少了NET的形成。(A)將人類嗜中性球(2.5×105細胞/毫升)在帶有ddH2O或KLHTT(10微克/毫升)的聚L-賴氨酸(poly-L-lysine)塗被的玻璃上培養。使用10奈莫耳濃度PMA刺激嗜中性球3分鐘，並在多聚甲醛(paraformaldehyde)中手工固定10分鐘。使用0.5%(v/v) 抗人類彈性蛋白酶(human elastase)抗體(MABS461)和0.5%(v/v)抗MPO抗體(ab9535)和1奈克/毫升Hoechst 33342抗體對NET染色。比例尺=50微米。(B)將人類嗜中性球與ddH2O或KLHTT(10微克/毫升)培養10分鐘，並用10奈莫耳濃度PMA活化3小時。添加SYTOX Green核酸染色劑以定量NET的形成。(C)將人類嗜中性球與ddH2O或KLHTT(1、3和10微克/毫升)培養3小時。細胞毒性以無細胞培養基中LDH釋放佔總LDH釋放的百分比表示。在37℃下從以0.1%Triton X-100裂解30分鐘的細胞中測定LDH的總釋放量。所有數據均表示為平均值±S.E.M.(n=3)。與單獨的PMA相比，** p<0.01。
圖8、KLHTT抑制活化的人類嗜中性球中CD11b的表達。將人類嗜中性球(2.5×106細胞/毫升)與ddH2O或KLHTT(3和10微克/毫升)培養5分鐘，並用fMLF活化5分鐘。使用流式細胞儀測量FITC標記的抗CD11b的螢光強度。平均螢光強度表示為平均值±S.E.M(n=3)。與單獨的fMLF相比，** p<0.01。
圖9、KLHTT抑制活化的人類嗜中性球對內皮細胞的粘附。(A)將Hoechest 3342標記的人類嗜中性球(4×106細胞/毫升)與ddH2O或KLHTT(10微克/毫升)培養5分鐘，將fMLF(0.1微莫耳濃度)用作刺激物。將已刺激的人類嗜中性球添加到bEND 3細胞中15分鐘。使用螢光顯微鏡評價嗜中性球對bEND 3細胞的粘附。比例尺=200微米。(B)在對粘附的人類嗜中性球進行計數和定量後，製成用於螢光顯微鏡的代表性直方圖。所有數據均表示為平均值±S.E.M.(n=3)。與單獨的fMLF相比，** p<0.01。
圖10、KLHTT改善了IMQ誘導的牛皮癬樣皮膚炎症的嚴重 性。(A)使用數位照相機和手持式數位顯微鏡觀察到IMQ誘導的牛皮癬樣皮膚炎症。比例尺=1毫米。治療五天後，在IMQ誘導前後，外用KLHTT(10毫克/毫升)改善了紅斑，厚度和脫屑。(B)在兩個KLHTT治療組中，KLHTT(10毫克/毫升)均顯著改善了紅斑評分(erythema score)，厚度評分(thickness score)，脫屑評分(scaling score)和累積評分(cumulative score)。所有數據均表示為平均值±S.E.M.(n=5)。與僅IMQ組相比，* p<0.05，** p<0.01和*** p<0.001。
圖11、KLHTT降低了IMQ誘導的小鼠牛皮癬樣皮膚炎症中的表皮厚度和嗜中性球浸潤。在第6天對小鼠實施安樂死，並收集背部皮膚並進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色和Ly6G，MPO(嗜中性球浸潤標誌物)和Ki67(表皮增殖標誌物)的免疫組織化學染色。在顯微鏡下觀察樣品。在兩個KLHTT治療組中，KLHTT(10毫克/毫升)均可顯著改善IMQ誘導的小鼠牛皮癬樣皮膚炎症中的表皮厚度和嗜中性球浸潤。比例尺=100微米。
材料與方法
試劑
貝加靈(Baicalin)，貝加因(Baicalein)，漢黃岑苷(Wogonoside)以及漢黃岑素(Wogonin)由台灣長庚大學的提供。綠原酸(chlorogenic acid)以及連翹苷(forsythin)購自Tauto(中國上海)。漢克斯平衡鹽溶液(Hanks’ balanced salt solution，HBSS)購自GIBCO(美國紐約州格蘭德島)。白三烯B4(Leukotriene B4，LTB4)和 H-Leu-Glu-Ser-Ile-Phe-Arg-Ser-Leu-Leu-Phe-Arg-Val-Met-CONH2(MMK-1)購自Tocris Bioscience(埃利斯維爾，密蘇里州，美國)。乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)分析試劑盒購自Promega(麥迪遜，威斯康辛州)。黃嘌呤獲自Santa Cruz Biotechnology(聖塔克魯茲，加州，美國)。水溶性四唑-1(Water-soluble tetrazolium-1，WST-1)購自Dojindo Laboratories(熊本市，日本)。FITC標記的分化分子抗簇(CD11b)，抗淋巴細胞抗原6複雜基因座G6D(Ly6G)和抗髓過氧化物酶(anti-myeloperoxidase，MPO)抗體購自eBioscience(聖地牙哥，加州，美國)。其他生物測定試劑從Sigma-Aldrich(聖路易斯，密蘇里州，美國)訂購。
樣品製備
KLHTT水提取物由順天堂藥廠股份有限公司(新北市，台灣)提供。簡而言之，在100℃下用ddH2O(335.16毫升)提取總共11種草藥(27.93公克)1小時(表一)。使用冷凍乾燥機(LABCONCO，美國)濃縮KLHTT水提取物。憑證標本(CGU_KLHTT-01)存放在長庚大學天然藥物研究所。將KLHTT粉末溶解在ddH2O中，透過0.45微米過濾器過濾，並在生物測定之前存儲在-20℃下。
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Figure 109126810-A0101-12-0010-2
由順天堂藥廠股份有限公司在100℃下用二次水(335.16毫升)提取總共11種草藥(27.93公克)1小時。批號為0503-2-403-01。
KLHTT的高效能液相層析(High-performance liquid chromatography，HPLC)
相關方法，包括所用的機器設備，所用的標準溶液和樣品HPLC溶液的製備已描述於先前文獻中(Hsieh,Y.J.,Yen,M.H.,Chiang,Y.W.,Yeh,C.F.,Chiang,L.C.,Shieh,D.E.,Yeh,I.,Chang,J.S.Gan-Lu-Siao-Du-yin,a prescription of traditional Chinese medicine,inhibited enterovirus 71 replication,translation,and virus-induced cell apoptosis.J.Ethnopharmacol.185,132-139,2016)。將Baicalin，Baicalein，Wogonoside，Wogonin，chlorogenic acid，以及forsythin用作標準參照物。隨後，使用日立色譜系統(日立，東京，日本)在272奈米處進行KLHTT指紋識別。
人類嗜中性球分離
長庚紀念醫院的機構審查委員會批准了這項研究。所有志願者(20-32歲)均健康，並在捐贈血液前簽署了知情同意書。使用標準規程進行人類嗜中性球製備，包括葡聚醣沉澱，Ficoll-Hypaque梯度離心和紅細胞低滲裂解。在分析之前，將分離出的人類嗜中性球在4℃的溫度下懸浮於不含Ca2+的漢克斯平衡鹽溶液(Hanks’ balanced salt solution，HBSS)中。
活性氧(Reactive oxygen species，ROS)
細胞外超氧陰離子產生的測定
在37℃下，將補充1毫莫耳濃度的氯化鈣(CaCl2)和0.5毫克/毫升鐵細胞色素c的人類嗜中性球(3×105或6×105細胞/毫升)與ddH2O(0.1%，作為對照)或KLHTT(1，3，或10微克/毫升)培養5分鐘。然後，將細胞以N-甲酰基-L-甲硫酰基-L-亮氨酰-L苯丙氨酸(N-formyl-L-methionyl-L-leucyl-Lphenylalanine，fMLF；0.1微莫耳濃度持續10分鐘)，MMK-1(0.1微莫耳濃度持續10分鐘)，2,4,6-三甲基-N-(間-3-三氟甲基-苯基)-苯磺酰胺(2,4,6-trimethyl-N-(meta-3-trifluoromethyl-phenyl)-benzenesulfonamide，m-3M3FBS；15微莫耳濃度持續10分鐘)，或氟化鈉(sodium fluoride，NaF；20毫莫耳濃度持續30分鐘)，於以細胞鬆弛素B(cytochalasin B，CB；對於fMLF，MMK，和m-3M3FBS為1微克/毫升；對於NaF為2微克/毫升)或以佛波醇12-肉荳蔻酸酯13-乙酸鹽(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA；10奈莫耳濃度持續5分鐘)做預處理下進行活化。以分光光度法在550奈米處檢測到吸光度變化。
細胞內超氧陰離子生成的測定
人類嗜中性球(1×106個細胞/毫升)在37℃下用溴化乙啶(hydroethidine bromide，HE)標記10分鐘，然後加入ddH2O或KLHTT(3和10微克/毫升)，5分鐘後用fCML(0.1微莫耳濃度)在以CB(0.5微克/毫升)進行預處理下再活化5分鐘，接著使用流式細胞儀分析細胞內超氧陰離子的產生。
總ROS釋放分析
使用發光增強化學發光法(luminolenhanced chemiluminescence)檢測細胞內和細胞外ROS。將人類嗜中性球(7×105細胞/毫升)與6U/毫升辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)和37.5微莫耳濃度魯米諾混合5分鐘，然後在以fMLF(0.1微莫耳濃度)活化前的5分鐘添加ddH2O或KLHTT(1、3和10微克/毫升)。使用96孔化學發光儀(Tecan，Infinite F200 Pro；Tecan Group，Männedorf，Switzerland)觀察化學發光反應。
彈性蛋白酶釋放的測定
先前文獻已經描述了用於檢測彈性蛋白酶釋放的方法，其代表嗜酸性顆粒的脫粒(Lee,C.L.,Hwang,T.L.,He,W.J.,Tsai,Y.H.,Yen,C.T.,Yen,H.F.,Chen,C.J.,Chang,W.Y.,Wu,Y.C.Anti-neutrophilic inflammatory steroidal glycosides from Solanum torvum.Phytochemistry 95,315-321,2013)。
Meo-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-對硝基苯胺(Meo-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide)是彈性蛋白酶特異性受質。將在37℃下與0.1毫莫耳濃度受質混合的人類嗜中性球(6×105或1×106細胞/毫升) 與ddH2O或KLHTT(1、3或10微克/毫升)培養5分鐘。在以CB(0.5或2微克/毫升)預處理3分鐘下將人類嗜中性球使用包括0.1微莫耳濃度fMLF，0.1微莫耳濃度MMK-1、15微莫耳濃度m-3M3FBS，100奈克/毫升白介素8(IL-8)，0.1微莫耳濃度LTB4或1微莫耳濃度血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)的不同的刺激物活化。在405奈米處用分光光度法檢測吸光度變化。
LDH釋放
可市售的方案(Promega，麥迪遜，威斯康辛州，美國)先前已經在Chang等人2008的文獻中描述(Chang,H.L.,Chang,F.R.,Chen,J.S.,Wang,H.P.,Wu,Y.H.,Wang,C.C.,Wu,Y.C.,Hwang,T.L.Inhibitory effects of 16-hydroxycleroda-3,13(14)E-dien-15-oic acid on superoxide anion and elastase release in human neutrophils through multiple mechanisms.Eur.J.Pharmacol.586,332-339,2008)。將人類嗜中性球與ddH2O或KLHTT培養15分鐘或3小時。使用總LDH釋放的百分比評估細胞毒性，這是透過在37℃下用0.1%Triton X-100裂解細胞30分鐘來確定的。
清除ROS的活性
超氧陰離子清除分析
使用黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶無細胞系統來測定KLHTT的超氧陰離子清除能力，在30℃下將0.1毫莫耳濃度黃嘌呤添加到含有Tris(pH 7.4)，0.3毫莫耳濃度WST-1和0.02U/毫升黃嘌呤氧化酶的緩衝液中10分鐘後，在450奈米處用分光光度法檢測吸光度變化。
2,2′-偶氮二(2-ami基丙烷)二鹽酸鹽(2,2′ -Azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride(AAPH)-scavenging analysis，AAPH)清除分析
將KLHTT(1、3和10微克/毫升)或Trolox(12.5-100微莫耳濃度)與溶於75毫莫耳濃度磷酸鈉緩衝液(pH=7.4)中的螢光素(fluorescein，80奈莫耳濃度)在37℃培養5分鐘。加入AAPH(25毫莫耳濃度)後，每3分鐘檢測一次螢光變化，持續2h。激發波長為485奈米，發射波長為535奈米。
活性氮(Reactive nitrogen species，RNS)的清除活性
1，1-二苯基-2-吡啶並肼基(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)清除試驗
DPPH是穩定的氮中心自由基。將KLHTT(1、3和10微克/毫升)或維生素E(3、15和30微莫耳濃度)加入DPPH(100微莫耳濃度的甲醇溶液)後，15分鐘後在517奈米處測定吸光度。
2,2′-疊氮雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt，ABTS)清除分析
ABTS是另一種以氮為中心的自由基。將KLHTT(1、3和10微克/毫升)或維生素C(10、15和30微莫耳濃度/毫升)加入ABTS(過硫酸鉀中為2.45毫莫耳濃度)後，15分鐘後在734奈米處檢測到吸光度。
CD11b表達分析
將嗜中性球(2.5×106個細胞/毫升)與ddH2O或KLHTT(3和10微克/毫升)培養5分鐘，然後用fMLF(0.1微莫耳濃度)/CB(1微克/ 毫升)活化再5分鐘。在200xg離心8分鐘後，將細胞重新懸浮於含有0.5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的HBSS中。在黑暗中於4℃下添加FITC標記的抗CD11b(1微克)90分鐘，並立即使用流式細胞儀檢測免疫螢光。
附著力研究
將人類嗜中性球(4×106個細胞/毫升)與1奈克/毫升Hoechest 3342在37℃下混合10分鐘。透過離心(200×g，8分鐘)清除上清液。將細胞重新懸浮並透過添加fMLF(0.1微莫耳濃度)/CB(1微克/毫升)活化10分鐘，然後轉移至含有bEND 3細胞的孔中。共培養15分鐘後，將細胞用HBSS洗滌並用4%多聚甲醛固定。使用螢光顯微鏡對粘附的嗜中性球進行計數。
NET形成分析
NET的量化
將人類嗜中性球(1×106個細胞/毫升)與ddH2O或KLHTT(10微克/毫升)培養10分鐘，然後用PMA(10奈莫耳濃度)活化3小時。添加SYTOX Green核酸染色劑(2.5微莫耳濃度)15分鐘，並在485-535奈米處檢測到螢光。
NETs攝影
將含有0.05%BSA(w/v)的人類嗜中性球(2.5×105細胞/毫升)置於聚-L-賴氨酸包被的玻璃上，並在37℃下培養30分鐘。加入KLHTT(10微克/毫升)10分鐘後用PMA(10奈莫耳濃度)刺激3小時。加入4%多聚甲醛溶液以固定細胞，並用0.05%(v/v)Triton X-100裂解細胞。之後， 將0.5%(v/v)抗人彈性蛋白酶抗體(MABS461)，0.5%(v/v)抗MPO抗體(ab9535)和1奈克/毫升Hoechst 33342用於NET染色以攝影。
抗牛皮癬活性
咪喹莫特誘導的牛皮癬動物模型
本實驗使用重約20克的8週齡雄性小鼠。該研究得到台灣長庚大學機構動物護理和使用委員會的批准。將小鼠分為以下五組：第1組，用媒介物(40%乙醇和60%ddH2O，100微升)處理的假手術小鼠；第2組，用KLHTT(10毫克/毫升，100微升)治療的假手術小鼠；第3組，用媒介物和IMQ治療的小鼠；第4組，IMQ前用KLHTT(10毫克/毫升，100微升)處理的小鼠；第5組，IMQ後用KLHTT(10毫克/毫升，100微升)處理的小鼠。使用脫毛機和霜將小鼠的背部剃毛。從第1天到第5天，以每日劑量62.5毫克的含有5%咪喹莫特(IQM)的Aldara(英國3M Health Care Limited，英國)誘發牛皮癬樣皮膚炎症。將KLHTT(10毫克/毫升)溶解在含有40%乙醇和60%ddH2O的媒介物中。從第1天到第5天，每天用KLHTT(10毫克/毫升，100微升)局部治療預處理組。從第2天到第5天，用KLHTT(10毫克/毫升，100微升)局部治療後處理組。在第6天從小鼠背部分離皮膚樣品，固定在10%多聚甲醛中，並根據標準規程(El Malki,K.,Karbach,S.H.,Huppert,J.,Zayoud,M.,Reissig,S.,Schuler,R.,Nikolaev,A.,Karram,K.,Munzel,T.,Kuhlmann,C.R.,Luhmann,H.J.,von Stebut,E.,Wortge,S.,Kurschus,F.C.,Waisman,A.An alternative pathway of imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in the absence of interleukin-17 receptor a signaling.J.Investig.Dermatol.133,441-451,2013)用蘇木精-曙紅(hematoxylin-eosin，HE)， ki67，Ly6G和MPO染色。
牛皮癬皮損評分
在第6天，使用牛皮癬面積和嚴重程度指數(psoriasis area and severity index，PASI)以基於人類PASI評分來評估牛皮癬病變的嚴重性。紅斑，脫屑和厚度分別分配為0到4之間的分數。0為無影響；1為輕微影響；2為中度影響；3表示重度影響；4表示非常重度的影響。
統計分析
統計學上的顯著性是使用Sigma-Plot的學生T檢驗(美國加利福尼亞州聖何西的Systat軟體公司)計算的。所有數據均表示為平均值±S.E.M。P<0.05的P值被認為具有統計學意義。
結果
KLHTT的高效能液相層析(High-performance liquid chromatography，HPLC)分析
以Chlorogenic acid，baicalin，forsythin，wogonoside，baicalein，以及wogonin為標準品，滯留時間分別為13.393分鐘，39.120分鐘，39.877分鐘，48.877分鐘，56.630分鐘和66.530分鐘(圖1)。發現標準參考的百分組成為：baicalin 1.03%；wogonoside 0.39%；chlorogenic acid 0.035%；baicalein，0.03%；forsythin，0.025%；wogonin，0.02%(表2)。
Figure 109126810-A0101-12-0017-3
Figure 109126810-A0101-12-0018-4
使用Chlorogenic acid，baicalin，forsythin，wogonoside，baicalein，wogonin作為標準溶液，透過HPLC-UV在272奈米下檢測KLHTT。觀察並計算滯留時間和含量。
KLHTT在活化的人類嗜中性球中減弱ROS的產生，但不降低彈性蛋白酶的釋放。
嗜中性球透過在稱為呼吸爆發的過程中活化NADPH氧化酶而產生大量ROS，包括主要的超氧陰離子。KLHTT(10微克/毫升)顯著減弱了fMLF-，PMA-，MMK-1-，m-3M3FBS-和NaF活化的人類嗜中性球中細胞外超氧陰離子的生成。KLHTT在靜息(resting)的人類嗜中性球中不會改變超氧陰離子的生成，並且在實驗條件下也不會誘導LDH釋放(圖2)。
KLHTT(10微克/毫升)並降低了HE所標記的人類嗜中性球的細胞內超氧化物生成(圖3)。此外，使用不同的興奮劑來活化人類嗜中性球以研究脫粒作用，從而釋放出許多含有蛋白水解酶(如彈性蛋白酶)的顆粒。即使在高濃度(10微克/毫升)下，KLHTT也不能影響彈性蛋白酶的釋放(圖4)。這些數據表明KLHTT選擇性抑制了活化的人類嗜中性球引起的氧化壓力(oxidative stress)。驗證這一個假設，KLHTT(1、3和10微克/毫升)以濃度依賴性方式顯著抑制了fMLF活化的人類嗜中性球的總ROS生 成(圖5)。
KLHTT透過直接和間接作用降低嗜中性球依賴性氧化壓力
為了理解KLHTT的ROS清除作用，在無細胞系統中使用了ROS生成測定法(ROS generation assays)。KLHTT(1、3和10微克/毫升)在無細胞之黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶系統中不會抑制超氧陰離子的生成(圖6A)，這表明KLHTT透過調節細胞活化來抑制活化的人類嗜中性球中超氧陰離子的產生。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，20U/毫升)用以作為陽性對照。使用氧自由基吸收能力測定法進一步評估KLHTT的抗氧化能力。圖6B-D顯示KLHTT和Trolox具有有效的抗氧化作用，可防止螢光變性。反之，KLHTT在ABTS和DPPH自由基測定中僅顯示較小的影響。維生素C和維生素E用以作為陽性對照(圖6E和F)。這些數據表明，KLHTT比RNS對清除ROS更敏感。
KLHTT抑制NET的形成
NETs為網狀結構，含有脫色的染色質，具有許多顆粒和胞質蛋白如彈性蛋白酶，MPO。人類嗜中性球釋放NETs響應PMA 3小時。KLHTT(10微克/毫升)抑制了PMA活化的人類嗜中性球的NET釋放(圖7A和B)。即使以10微克/毫升的高濃度與KLHTT一起培養3小時也不會導致LDH釋放(圖7C)。這表明KLHTT對NET形成的抑製作用不是由於細胞毒性。
KLHTT抑制活化的嗜中性球中CD11b的表達和細胞粘附
循環中的嗜中性球感覺到炎症信號並表達各種細胞表面受體，例如CD11b，用於粘附。接下來，人類嗜中性球遷移並積聚在炎症部位 (Futosi和Mocsai，2016)。人類嗜中性球CD11b的表現響應fMLF而增加(圖8)，並且還觀察到對bEND 3細胞的粘附性增強(圖9A)。我們的數據表明，KLHTT降低了活化的人類嗜中性球中CD11b的表達(圖8)，並減弱了嗜中性球與bEND 3細胞的粘附(圖9A和B)。
KLHTT改善IMQ誘導的小鼠牛皮癬樣皮膚炎症
在小鼠皮膚上外部施用IMR，一種Toll樣受體(TLR)-7/8促效劑，引起類似於人類牛皮癬的症狀，包括紅斑，脫屑，皮膚增厚，角化過度，微膿腫的形成，以及嗜中性球的累積。
基於使用數位相機和手持式數位顯微鏡觀察到的總體外觀，可以得出結論，IMQ乳膏的施用引起了牛皮癬樣皮膚炎症。KLHTT用於緩解這種IMQ誘導的牛皮癬樣皮膚炎症。假手術組和KLHTT無IMQ誘導組均具有正常的皮膚外觀(圖10A)。此外，外用KLHTT(10毫克/毫升)顯著改善了IMQ誘導的牛皮癬樣皮膚炎症，並根據脫屑，紅斑和厚度降低PASI評分。在假手術組和未經IMQ的KLHTT治療組中，PASI評分均為0(圖10B)。
在IMQ誘導組中，Ki67(表皮增生標記)的HE染色和IHC染色顯示表皮增厚(棘皮症)。IHC對MPO和Ly6G的染色發現真皮和表皮中的嗜中性球募集的增加和嚴重的嗜中性球浸潤(孟洛微膿瘍(Munro's micro-abscesses))。在KLHTT預處理組(在IMQ誘導前應用KLHTT)和後處理組(在IMQ誘導後應用KLHTT)中，KLHTT減少了表皮厚度並顯著減輕了嗜中性球的浸潤和募集。假手術組和無IMQ誘導的KLHTT組均具有正常的表皮，並且沒有嗜中性球浸潤(圖11)。

Claims (6)

  1. 一種中草藥組合物用於製備預防或治療皮膚病癥的外用藥物的用途，其中該中草藥組合物係指甘露消毒丹，該甘露消毒丹由以下成分所組成：6-7重量份的滑石，4-6重量份的茵陳蒿，4-5重量份的黃芩，2-3重量份的石菖蒲，2-3重量份的木通，2-3重量份的川貝母，1-2重量份的藿香，1-2重量份的連翹，1-2重量份的白荳蔻，1-2重量份的薄荷，1-2重量份的射干，其中，該皮膚病癥為牛皮癬，且其中該外用藥物為局部外用藥物。
  2. 如請求項1之用途，其中該外用藥物改善了患部脫屑的情形。
  3. 如請求項1之用途，其中該外用藥物改善了患部紅斑的情形。
  4. 如請求項1之用途，其中該外用藥物減少了患部表皮厚度。
  5. 如請求項1之用途，其中該外用藥物減輕了患部嗜中性球的浸潤。
  6. 如請求項1之用途，其中該外用藥物減輕了患部嗜中性球的募集。
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