CN106068269A

CN106068269A - 氨基噻嗪化合物

Info

Publication number: CN106068269A
Application number: CN201580012436.5A
Authority: CN
Inventors: F·M·马丁
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2014-03-14
Filing date: 2015-03-05
Publication date: 2016-11-02
Anticipated expiration: 2035-03-05
Also published as: JP6185192B2; EP3116881B1; TWI684452B; CA2938616A1; TW201622729A; TR201809609T4; CN106068269B; ES2681285T3; CA2938616C; JP2017506658A; US9708345B1; WO2015138208A1; EP3116881A1

Abstract

本发明提供了式(I)化合物或其可药用盐。

Description

氨基噻嗪化合物

本发明涉及新的氨基噻嗪化合物、包含该化合物的药物组合物、使用该化合物治疗生理障碍的方法以及用于合成该化合物的中间体和方法。

本发明属于治疗阿尔茨海默氏病和其它涉及淀粉样β(Aβ)肽的疾病和病症的领域，所述Aβ肽是一种神经毒性并且高度聚集性的淀粉样前体蛋白(APP)的肽片段。阿尔茨海默氏病是一种影响世界范围内数百万患者的破坏性神经变性病症。目前已批准上市的活性剂仅能为患者提供短暂的、对症的益处，鉴于此，在阿尔茨海默氏病的治疗中仍存在大量尚未满足的需求。

阿尔茨海默氏病的特征在于脑中Aβ的产生、聚集和沉积。已证实，完全或部分抑制β-分泌酶(β-位淀粉样蛋白前体蛋白裂解酶；BACE)对小鼠模型中的斑块相关性和斑块依赖性病变有显著作用，这表明即使是Aβ肽水平的少量减少也可能引起斑块负荷和突触缺陷的长期显著减轻，由此提供显著的治疗益处，尤其是在阿尔茨海默氏病的治疗中。

WO 2014/013076公开了异硫脲衍生物，其是可用于治疗由Aβ肽引起的神经变性疾病、例如阿尔茨海默氏型痴呆的BACE抑制剂。US 8,158,620公开了具有BACE抑制活性的稠合的氨基二氢噻嗪衍生物，并且这些衍生物进一步被公开可用作由Aβ肽引起的神经变性疾病、例如阿尔茨海默氏型痴呆的有用治疗剂。

需要具有中枢神经系统(CNS)渗透性的BACE抑制剂以提供用于Aβ肽介导的病症例如阿尔茨海默氏病的治疗。本发明提供了一些新的化合物，这些化合物是BACE的抑制剂。另外，本发明还提供了一些具有CNS渗透性、具有改善的副反应特性和改进的物理化学性质例如提高的溶解度的新化合物。

因此，本发明提供了式I化合物或其可药用盐:

本发明还提供了治疗阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括向需要所述治疗的患者施用有效量的式I化合物或其可药用盐。

本发明进一步提供了预防患者的轻度认知损伤向阿尔茨海默氏病进展的方法，该方法包括向需要所述治疗的患者施用有效量的式I化合物或其可药用盐。

本发明还提供了在患者中抑制BACE的方法，该方法包括向需要所述治疗的患者施用有效量的式I化合物或其可药用盐。

本发明还提供了抑制BACE-介导的淀粉样前体蛋白裂解的方法，该方法包括向需要所述治疗的患者施用有效量的式I化合物或其可药用盐。

本发明进一步提供了抑制Aβ肽的生成的方法，该方法包括向需要所述治疗的患者施用有效量的式I化合物或其可药用盐。

此外，本发明还提供了用于治疗的式I化合物或其可药用盐。此外，本发明还提供了用于治疗阿尔茨海默氏病的式I化合物或其可药用盐。本发明还提供了用于预防轻度认知损伤向阿尔茨海默氏病进展的式I化合物或其可药用盐。此外，本发明还提供了式I化合物或其可药用盐在制备用于治疗阿尔茨海默氏病的药物中的用途。本发明还提供了式I化合物或其可药用盐在制备用于预防轻度认知损伤向阿尔茨海默氏病进展的药物中的用途。

本发明进一步提供了包含式I化合物或其可药用盐和一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。在一个特定的实施方案中，该组合物还包含一种或多种其它治疗剂。本发明还包括用于合成式I化合物的新中间体和工艺。

术语“预防轻度认知损伤向阿尔茨海默氏病进展”包括减缓、阻碍或逆转患者由轻度认知损伤向阿尔茨海默氏病的进展。

本文所用的术语“治疗”包括制止、减缓、停止或逆转现有症状或病症的进展或严重程度。

本文所用的术语“患者”是指人。

术语“抑制Aβ肽的产生”是指在患者中降低Aβ肽的体内水平。

本文所用的术语“有效量”是指在以单一或多剂量施用给患者时，在接受诊断或治疗的患者中提供所需效果的本发明化合物或其可药用盐的量或剂量。

有效量可由作为本领域技术人员的主治诊断医师通过利用已知的技术以及观察在类似情况下所得到的结果来容易地确定。在确定对于患者的有效量中，主治诊断医师要考虑许多因素，包括但不限于:患者的种类；体格大小、年龄和一般健康状况；所涉及的具体疾病或病症；疾病或病症的程度或复杂情况或严重程度；个体患者的反应；所施用的具体化合物；给药方式；所施用的制剂的生物利用度特性；所选择的剂量方案；共同使用的药物和其它相关的情况。

本发明化合物通常在宽的剂量范围内是有效的。例如，每天的剂量通常在约0.01至约20mg/kg/体重的范围内。在某些情况下，低于上述范围的下限的剂量水平可能是更适当的，而在其它情况下则可使用更大的剂量而具有可接受的副作用，因此，上述剂量范围绝非想要限制本发明的范围。

优选将本发明化合物配制成药物组合物的形式通过任何使该化合物可被生物利用的途径给药，包括口服和胃肠外途径。最优选所述组合物是用于口服给药的组合物。该药物组合物及其制备方法是本领域已知的(参见例如Remington:The Science and Practiceof Pharmacy(D.B.Troy编,21版,Lippincott,Williams&Wilkins,2006)。

式I化合物在本发明的治疗方法中是特别有用的，但是某些基团、取代基和构型对于式I化合物是优选的。以下段落描述了该优选的基团、取代基和构型。应理解，这些优选的选项同时适用于本发明的治疗方法和新化合物。

优选以顺式构型存在的下式化合物或其可药用盐：

进一步优选N-[2-[(4aR,7aR)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-吡啶基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺或其可药用盐。

特别优选N-[2-[(4aR,7aR)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-吡啶基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺。

本领域普通技术人员将会意识到本发明化合物由含有两个手性中心的核所组成，如以下流程A所示:

流程A

尽管本发明包括所述化合物的所有单独的对映体和非对映体，以及所述化合物的对映体的混合物、包括外消旋体，但是，在标记为1和2的碳原子处具有如流程A所示的绝对构型的化合物是优选的本发明化合物。

本领域普通技术人员将会意识到，本发明化合物可以以互变异构体的形式存在，如流程B所述。在本申请中，任何提及本发明化合物的一种具体互变异构体时，均应理解成包括两种互变异构形式及其所有混合物。

流程B

为了清楚的原因，某些立体化学中心未进行指定，并且不打算以任何方式限制制备例和实施例的教导。此外，单独的异构体、对映体或非对映体可由本领域普通技术人员通过例如选择性结晶技术或手性色谱等方法在式I化合物合成中的任何方便的点进行分离或拆分(参见例如J.Jacques等人,“对映体、外消旋体和拆分”,John Wiley和Sons,Inc.,1981和E.L.Eliel和S.H.Wilen,“有机化合物的立体化学”,Wiley-Interscience,1994)。指定“异构体1”和“异构体2”分别是指从手性色谱中首先和第二洗脱出来的化合物，并且如果在合成的早期开始进行手性色谱，则相同的指定应用于随后的中间体和实施例。

另外，以下制备例中所述的某些中间体可含有一个或多个氮保护基。可变的保护基在每次出现时可相同或不同，这取决于待进行的特定反应条件和特定的转化反应。保护和脱保护条件是本领域技术人员已知的，并且记载于文献中(参见例如“Greene’sProtective Groups in Organic Synthesis”,第4版,Peter G.M.Wuts和TheodoraW.Greene,John Wiley和Sons,Inc.2007)。

某些缩写词如以下所定义:“APP”是指淀粉样前体蛋白；“DMEM”是指达尔伯克改良伊格尔培养基；“DMSO”是指二甲基亚砜；“F12”是指Ham’s F12培养基；“FBS”是指胎牛血清；“FRET”是指荧光共振能量转移；“HB-PS”是指HEPES-缓冲的生理盐水；“HEK”是指人胚肾；“HEPES”是指2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙烷磺酸；“HPLC’是指高效液相色谱；“IC50”是指产生50％该活性剂可能的最大抑制响应的活性剂的浓度；“JohnPhos”是指二叔丁基-(2-苯基苯基)膦；“min”是指分钟；“MTBE”是指甲基叔丁基醚；“PDAPP”是指血小板衍生的淀粉样前体蛋白；“RFU”是指相对荧光单位；“SFC”是指超临界流体色谱；和“SEM”是指平均值的标准误差。

本发明化合物或其盐可通过本领域已知的各种方法制备，某些方法如以下制备例和实施例中所举例说明。所述各路线的具体合成步骤可以以不同的方式相组合以制备式I化合物或其盐。在以下制备例和实施例中，各步骤的产物可通过本领域公知的常规方法回收，包括萃取、蒸发、沉淀、色谱、过滤、研制和结晶。对于本领域普通技术人员来说，试剂和原料均是易得的。

在一个任选的步骤中，式I化合物的可药用盐、例如盐酸盐可通过将适当的式I的游离碱与适当的可药用酸在适当的溶剂中在标准条件下反应来形成。另外，该盐的形成可在氮保护基脱保护的同时进行。该盐的形成是本领域已知的。参见例如Gould,P.L.,“基础药物的盐的选择”International Journal of Pharmaceutics,33:201-217(1986)；Bastin,R.J.等人“Salt Selection and Optimization Procedures for PharmaceuticalNew Chemical Entities,”Organic Process Research and Development,4:427-435(2000)；和Berge,S.M.等人,“药物盐”Journal of Pharmaceutical Sciences,66:1-19,(1977)。

以下制备例和实施例进一步解释本发明。

制备例1

(叔-丁氧基羰基氨基)碳酸叔丁酯

将羟胺盐酸盐(550.0g,7.9mol)、水(5.5L)和庚烷/MTBE溶液(5:1,5.5L)的混合物冷却至-5℃。在2小时内缓慢加入预冷却的(-5℃)二碳酸二叔丁酯(3.55Kg,16.3mol)、三乙胺(1.67Kg,16.5mol)在庚烷/MTBE(5:1,1.1L)中的溶液。将反应液在-5℃下搅拌1小时，然后升温至室温并搅拌过夜。分层并将有机层用饱和氯化铵水溶液(2L)和饱和氯化钠水溶液(1L)洗涤两次，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到油，该油结晶成白色固体。将固体与庚烷(1L)一起在冰水浴中搅拌并过滤得到标题产物(1360.2g,73％)。¹HNMR(d₆-DMSO)δ10.83-10.58(m,1H),1.43(d,J＝11.3Hz,18H)。

制备例2

[叔-丁氧基羰基-[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基]碳酸叔丁酯

向20L反应器中在氮气下加入(叔-丁氧基羰基氨基)碳酸叔丁酯(812.9g,3.48mol)、二甲基甲酰胺(4.4L)、碳酸钾(626.5g,4.52mol)和1-(氯甲基)-4-甲氧基-苯(462mL,2.56mol)。将混合物在40℃下搅拌过夜。¹HNMR分析表明未完全反应。补加碳酸钾(626.5g,4.52mol)并将混合物在40℃下搅拌。48小时后，¹H NMR分析表明仍未完全反应。补加碳酸钾(482g,3.49mol)并将混合物在40℃下搅拌。在反应过夜后，¹H NMR分析表明完全反应，无剩余原料。加入水(5L)和MTBE(5L)并分层。将有机层用水洗涤(3×3L)，用硫酸钠干燥并浓缩得到标题化合物(1.21Kg,98％)。¹H NMR(d₆-DMSO)δ7.20(d,J＝8.3Hz,2H),6.91(d,J＝8.3Hz,2H),3.73(s,2H),3.35(s,3H),1.41(s,18H)。

制备例3

N-[(4-甲氧基苯基)甲基]羟基胺盐酸盐

将[叔-丁氧基羰基-[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基]碳酸叔丁酯(1.125Kg,3.1mol)溶于1,4-二恶烷(2.8L)并在1小时30分钟内滴加氯化氢溶液(4M的二恶烷溶液,3.15L,12.4mol)。将溶液在室温下搅拌过夜。通过过滤收集白色固体状标题产物(488.0g,81％)。¹H NMR(d₆-DMSO)δ11.71(s,2H),10.94(s,1H),7.44(d,J＝8.8Hz,2H),6.95(d,J＝8.8Hz,2H),4.22(s,2H),3.75(s,3H)。

制备例4

2-(烯丙基(叔-丁氧基羰基)氨基)乙酸

向含有碳酸钾(100g,724mmol)、碘化钠(110g,727mmol)、二甲基甲酰胺(300mL)、三乙胺(200mL,1.44mol)和2-丙烯-1-胺(24g,426mmol)的圆底烧瓶中在0℃下滴加2-溴乙酸乙酯(60.2g,360mmol)的二甲基甲酰胺(40mL)溶液。将反应液升温至室温并搅拌14小时。通过过滤除去固体并用二乙醚洗涤。将饱和氯化钠水溶液(1L)加入到滤液中并分层。将水层用二乙醚萃取。将有机相合并，用硫酸镁干燥，过滤并减压除去溶剂得到残余物。在0℃下向粗残余物的乙醇(500ml)和三乙胺(40g,395mmol)溶液中一次性加入二碳酸二叔丁酯(105g,467mmol)。将反应液升温至室温并搅拌14小时。将反应液减压浓缩并用水(200mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(200mL)稀释并用二乙醚萃取。将有机相合并，用硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩得到残余物。向残余物中加入甲醇(200mL)和2N氢氧化钠(500mL)。将形成的溶液在室温下搅拌3小时。将体积在减压下浓缩至约200ml，将形成的溶液用盐酸(12N)酸化至pH4。将形成的浅橙色固体通过过滤收集，用水洗涤并干燥得到标题化合物(50g,65％)。¹HNMR(CDCl₃)两种旋转异构体的混合物(50:50)δ1.43,1.45(s,9H),3.86-3.99(m,4H),5.10-5.20(m,2H),5.71-5.83(m,1H)。

制备例5

N-烯丙基-N-[2-(甲氧基(甲基)氨基)-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯

将2-(烯丙基(叔-丁氧基羰基)氨基)乙酸(49.6g,156mmol)在0℃下加入到四氢呋喃(600mL)中，然后加入三乙胺(36.3g,359mmol)和新戊酰氯(31g,353mmol)。将反应液在室温下搅拌3小时，然后冷却至0℃。然后加入N,O-二甲基羟基胺盐酸盐(28g,283mmol)、三乙胺(33mL,237mmol)和四氢呋喃(400mL)。除去冰浴并将反应液在室温下搅拌3小时然后减压浓缩。将形成的固体溶于水并用乙酸乙酯萃取。将有机相合并，用硫酸钠干燥，过滤并减压除去溶剂得到残余物。将残余物通过硅胶柱色谱纯化，用0-50％丙酮的己烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(32g,54％)。¹HNMR(CDCl₃)两种旋转异构体的混合物(60:40)δ1.42,1.44(s,9H),3.16,3.17(s,3H),3.66,3.69(s,3H),3.88-3.98(m,2H),4.01,4.11(s,2H),5.10-5.18(m,2H),5.73-5.85(m,1H)。

制备例6

4-氯-N-甲氧基-N-甲基-吡啶-2-甲酰胺

将4-氯吡啶-2-甲酸(40.9g,259.59mmol)在搅拌下悬浮于无水二氯甲烷(700mL)中并除去水分(使用硅胶干燥管)。将形成的溶液冷却至0℃并加入N-甲基吗啉(129mL,1.17mol)、N,O-二甲基羟基胺盐酸盐(35.45g,363.43mmol)，然后分批加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(69.67g,363.43mmol)。加入完成后，将反应液升温至室温并在该温度下搅拌过夜。加入水(600mL)并分层。将水层用二氯甲烷(300mL)重新萃取两次。将有机层合并，用盐水(400mL)洗涤并用无水硫酸钠干燥。减压除去溶剂得到黑色油。将其通过硅胶柱色谱纯化，用0至50％乙酸乙酯的异己烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(23.7g,46％)。ES/MS(m/e)201/203。

制备例7

1-(4-氯吡啶-2-基)乙酮

将甲基溴化镁(3M的二乙醚溶液)(59mL；177.20mmol)在搅拌下于氮气下加入到无水四氢呋喃(150mL)中。将形成的溶液冷却至-15℃并在20分钟内滴加4-氯-N-甲氧基-N-甲基-吡啶-2-甲酰胺(23.7g 1.00 118.13mmol)的无水四氢呋喃(150mL)溶液，同时将温度保持在0至-15℃之间。加入完成后，将反应液在0℃下搅拌45分钟。然后将反应液冷却至-15℃并通过小心地滴加水(250mL)缓慢地终止反应。加入饱和氯化铵水溶液(250mL)和二乙醚(200mL)。分层并将水层用二乙醚(200mL)重新萃取两次。将合并的有机萃取液用无水硫酸钠干燥，过滤并减压除去溶剂得到黄色油状标题化合物(18.6g)。ES/MS 156/158(M+1)。

制备例8

2-溴-1-(4-氯-2-吡啶基)乙酮

将1-(4-氯-2-吡啶基)乙酮(24.4g,156.83mmol)在搅拌下溶于冰乙酸(224mL)。加入溴化氢溶液(32％的乙酸溶液)(34mL)，然后缓慢加入溴(8.2mL,159.97mmol)。将形成的溶液在75℃下加热3.5小时，然后立即在冰浴中冷却。将饱和碳酸氢钠水溶液(1L)在搅拌下缓慢加入到冷却的反应混合物中，然后加入固体碳酸氢钠将溶液的pH调节至7。然后加入乙酸乙酯(400mL)并分层。将水层用乙酸乙酯重新萃取(3×400mL)。将有机萃取液合并，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到棕色结晶状固体。将分离出的固体用异己烷研制并进一步真空干燥得到标题化合物(21g)。将留在异己烷中的产物通过硅胶柱色谱回收，用0至40％二氯甲烷的异己烷溶液梯度洗脱得到另外的5.5g标题产物，由此得到合并收率(26.5g,72％)。ES/MS(m/e)234/236/238(M+1)。

制备例9

1-(4-氯-2-吡啶基)-2-(二烯丙基氨基)乙酮

将N-烯丙基丙-2-烯-1-胺(15.8g,158.2mmol)在氮气下在搅拌下溶于无水四氢呋喃(283mL)。加入三乙胺(79mL)并将形成的溶液冷却至0℃。滴加2-溴-1-(4-氯-2-吡啶基)乙酮(26.5g,113.0mmol)的无水四氢呋喃(126mL)溶液(在该加入过程中反应液的颜色从无色变成黄色，然后变成橙色，最终变成红色)。1.5小时后，加入水(500mL)并减压除去溶剂。将形成的水溶液用乙酸乙酯萃取(5×250mL)。向合并的有机萃取液中加入无水硫酸钠。将形成的悬浮液通过薄的硅胶和硅藻土垫过滤。将该垫用乙酸乙酯洗涤(1L)。然后将滤液减压浓缩得到标题化合物(23.6g)。ES/MS(m/e)251/253(M+1)。该中间体的稳定性有限，不进行储存，并且不经进一步纯化直接使用。

制备例10

5-烯丙基-6a-(4-氯-2-吡啶基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异唑

将1-(4-氯-2-吡啶基)-2-(二烯丙基氨基)乙酮(23.6g,94.4mmol)在搅拌下在氮气下溶于无水甲苯(343mL)。依次加入N-[(4-甲氧基苯基)甲基]羟基胺盐酸盐(27.9g,146.9mmol)、三乙胺(23.6mL,169.5mmol)和乙醇钛(IV)(35.4mL,38.7g,169.5mmol)。将形成的反应混合物在70℃下在氮气下加热。8小时后，将反应液冷却并在室温下搅拌过周末。然后加入二乙醚(1l)和水(500mL)。将沉淀出的固体通过硅藻土垫滤出。将该垫用二乙醚(500mL)充分洗涤。分相并将水相用二乙醚(300mL)重新萃取。将合并的有机相用无水硫酸钠干燥并过滤得到棕色油。将其通过硅胶柱色谱纯化，用0至20％四氢呋喃的氯仿溶液梯度洗脱得到浅棕色油状标题化合物(17.5g,40％)。ES/MS(m/e)386/388。

制备例11

6a-(4-氯-2-吡啶基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异唑-5-甲酸叔丁酯

将5-烯丙基-6a-(4-氯-2-吡啶基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异唑(17.5g,45.35mmol)在搅拌下在氮气下溶于无水二氯甲烷(230mL)。在氮气流下加入N,N-二甲基巴比妥酸(38.24g,244.89mmol)和四(三苯基膦)钯(5.24g,4.53mmol)并将氮气鼓泡通过溶液数分钟。然后将形成的溶液在30℃下在氮气下加热2小时。然后将反应液冷却至室温。加入二碳酸二叔丁酯(10.10g,46.26mmol)和三乙胺(7mL,52.15mmol)并将形成的溶液在室温下搅拌2小时。将反应混合物减压浓缩得到琥珀色半固体，然后将其重新溶于乙酸乙酯(500mL)。将形成的溶液用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤(2×250mL)。将有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到黑色油。将该油通过硅胶柱色谱纯化，用0至70％乙酸乙酯的异己烷溶液梯度洗脱得到黄色泡沫状标题化合物(14.8g,73％)。ES/MS(m/e)446(M+1)。

制备例12

N-烯丙基-N-[2-(4-氯-2-吡啶基)-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯

向搅拌着的四氢呋喃溶液(60mL)中在氮气下在-10℃(甲醇-冰浴)下加入异丙基氯化镁氯化锂复合溶液(56.84mL,73.89mmol,1.3M的四氢呋喃溶液)。滴加2-溴-4-氯-吡啶(9.48g,49.26mmol)的四氢呋喃(60mL)溶液，确保在加入过程中温度不超过0℃。40分钟后，该溶液为澄清的浅橙色，此时再次加入N-烯丙基-N-[2-(甲氧基(甲基)氨基)-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯(19.09g,73.89mmol)的四氢呋喃(27mL)溶液，确保温度不超过0℃。加入完成后，将形成的棕色溶液升温至室温。2小时后通过加入饱和氯化铵水溶液终止反应，然后加入小体积的水。加入乙酸乙酯并分层。将水层用乙酸乙酯重新萃取(4×)。将有机层合并，用无水硫酸镁干燥，过滤并浓缩得到棕色油。将粗产物通过硅胶柱色谱纯化，用0至30％乙酸乙酯的异己烷溶液梯度洗脱得到澄清的浅黄色油状标题化合物(10.1g,66％)。ES/MS(m/e)333(M+23)。

制备例13

向搅拌着的N-烯丙基-N-[2-(4-氯-2-吡啶基)-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯(10.10g,32.50mmol)的甲苯(230mL)溶液中在氮气下加入N-[(4-甲氧基苯基)甲基]羟基胺盐酸盐(6.47g,34.12mmol)、三乙胺(4.76mL,34.12mmol)和乙醇钛(IV)(14.27mL,68.25mmol)。将形成的溶液在氮气下升温至70℃。3.5小时后将反应液冷却至室温。加入水和乙酸乙酯并将形成的悬浮液通过硅藻土过滤。将硅藻土垫用乙酸乙酯充分洗涤。分相并将有机相用盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤并浓缩得到橙色油。将该油通过硅胶柱色谱纯化，用0至25％乙酸乙酯的异己烷溶液梯度洗脱得到澄清的黄色油状标题化合物(11.72g；81％)。ES/MS(m/e)446(M+1)。

制备例14

6a-(4-氨基-2-吡啶基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异唑-5-甲酸叔丁酯

将6a-(4-氯-2-吡啶基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异唑-5-甲酸叔丁酯(9.4g,21.1mmol)、JohnPhos(2.0g,6.3mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(3.0g,3.2mmol)、二苯甲酮亚胺(7.4mL,42.3mmol)和叔丁醇钠(6.1g,63.4mmol)一起加入到甲苯(121mL)中。将形成的混合物通过在氮气氛下用液氮冷却并随后在水浴中真空熔化至室温而彻底脱气。将该步骤重复4次。然后将反应液在75℃下在搅拌下在氮气下加热1.5小时。将反应液冷却至室温并用乙酸乙酯稀释。将形成的悬浮液通过硅藻土垫过滤并将该垫用乙酸乙酯充分洗涤。蒸发溶剂得到中间体亚胺。将其重新溶于甲醇(235mL)并加入乙酸钠(7.0g,84.6mmol)和羟基胺盐酸盐(5.9g,84.6mmol)。将形成的混合物在室温下搅拌1.5小时。用碳酸氢钠水溶液终止反应并减压除去甲醇。然后将剩余的水层用乙酸乙酯萃取(2×)。将合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩得到橙色油。将粗产物通过硅胶柱色谱纯化，用0至10％2M氨的甲醇溶液的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到棕色树胶状标题化合物以及含有产物的混合级分。将混合的级分合并，分两批进一步用硅胶柱色谱纯化，用0至5％2M氨的甲醇溶液的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到另外的产物，得到合并收率(6.72g,75％)的标题化合物，为浅棕色固体。ES/MS(m/e)427(M+1)。

制备例15

6a-(4-乙酰氨基-2-吡啶基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异唑-5-甲酸叔丁酯

将6a-(4-氨基-2-吡啶基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异唑-5-甲酸叔丁酯(3.06g,7.17mmol)置于250mL烧瓶中并在搅拌下在氮气下加入乙酸乙酯(16mL)。向形成的悬浮液中加入1-丙烷膦酸环状酸酐(>50wt％的乙酸乙酯溶液)(11mL,17.92mmol)、三乙胺(3.50mL,25.09mmol)和乙酸(616μL,10.75mmol)。将形成的溶液在75℃下在氮气下加热。1小时后将反应液冷却至室温。加入乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠水溶液。分层并将水相用乙酸乙酯重新萃取(2×)。将合并的有机层用无水硫酸镁干燥，过滤并浓缩得到琥珀色泡沫状标题产物(3.11g,92％)。ES/MS(m/e)469(M+1)。

制备例16

N-[2-(1,3,3a,4,5,6-六氢吡咯并[3,4-c]异唑-6a-基)-4-吡啶基]乙酰胺

向6a-(4-乙酰氨基-2-吡啶基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异唑-5-甲酸叔丁酯(3.11g,6.64mmol)中在搅拌下加入三氟乙酸(10mL)并将形成的溶液在50℃下加热。1.5小时后将反应液冷却并减压浓缩。将形成的黑色油重新溶于二氯甲烷/甲醇溶液并负载到两个离子交换柱(25g)上。将产物用甲醇洗脱，然后用2M氨的甲醇溶液洗脱。将碱性级分减压浓缩得到粘稠的棕色油(1.71g,88％)。ES/MS(m/e)248(M+1)。

制备例17

6a-(4-乙酰氨基-2-吡啶基)-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异唑-5-甲酸叔丁酯

将N-[2-(1,3,3a,4,5,6-六氢吡咯并[3,4-c]异唑-6a-基)-4-吡啶基]乙酰胺(1.71g,5.85mmol)在搅拌下溶于二氯甲烷(无水)(13mL)并加入二碳酸二叔丁酯(1.28g,5.86mmol)，然后加入三乙胺(810μL,5.81mmol)。将形成的溶液在室温下搅拌1小时45分钟。将反应液用二氯甲烷稀释并用盐水洗涤。将有机层用无水硫酸镁干燥，过滤并减压蒸发得到浅黄色泡沫状标题产物(2.05g,定量)。ES/MS(m/e)349(M+1)。

制备例18

6a-(4-乙酰氨基-2-吡啶基)-1-(苯甲酰基硫代氨基甲酰基)-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异唑-5-甲酸叔丁酯

向6a-(4-乙酰氨基-2-吡啶基)-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异唑-5-甲酸叔丁酯(2.05g,5.88mmol)中在搅拌下在氮气下加入无水四氢呋喃(15.0mL)。加入苯甲酰基异硫氰酸酯(900μL,6.54mmol)并将反应液在室温下在氮气下搅拌。2小时后将反应液减压浓缩得到浅黄色油。将该油通过硅胶柱色谱纯化，利用20至100％乙酸乙酯的环己烷溶液梯度洗脱得到米色泡沫状标题产物(2.14g,66％)。ES/MS(m/e)512(M+1)。

制备例19

3-(4-乙酰氨基-2-吡啶基)-3-(苯甲酰基硫代氨基甲酰基氨基)-4-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯

将6a-(4-乙酰氨基-2-吡啶基)-1-(苯甲酰基硫代氨基甲酰基)-3,3a,4,6-四氢吡咯并[3,4-c]异唑-5-甲酸叔丁酯(2.14g,3.86mmol)溶于乙醇(40mL)并置于一个大的Parr氢化瓶中。在氮气氛下加入氢氧化钯(20wt％，负载在碳上，877mg)，然后置于Parr氢化装置中并在50psi下氢化24小时。将反应悬浮液用乙醇稀释并通过硅藻土过滤。将该垫用乙酸乙酯洗涤。将合并的滤液减压浓缩得到标题产物(2.03g,96％)，该产物不经进一步纯化即可使用。ES/MS(m/e)514(M+1)。

另一制备例19

将3-(4-乙酰氨基-2-吡啶基)-3-氨基-4-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.43g,4.08mmol)溶于无水四氢呋喃(27mL)。加入苯甲酰基异硫氰酸酯(578.49μL,4.20mmol)并将形成的混合物在室温下在氮气下搅拌2小时。然后减压除去溶剂得到黄色固体泡沫。将该产物通过硅胶柱色谱纯化，利用0至100％乙酸乙酯的环己烷溶液梯度洗脱得到白色固体状标题化合物(2.1g,定量)。ES/MS(m/e)514(M+1)。

制备例20

3-(4-乙酰氨基-2-吡啶基)-3-氨基-4-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯

将6a-(4-乙酰氨基-2-吡啶基)-3,3a,4,6-四氢-1H-吡咯并[3,4-c]异唑-5-甲酸叔丁酯(2.026g,5.82mmol)在超声处理下溶于乙醇(145mL)。将形成的溶液在70℃下以3ml/min的流速循环通过位于流动氢化器(在85巴压力和100％氢产量下运行)上的氢氧化钯(20wt％，负载在碳上，小短柱)两次。减压除去乙醇得到白色泡沫状标题化合物(1.98g)，其具有低的杂质含量，不经进一步纯化即可使用。ES/MA(m/e)351(M+1)。

制备例21

外消旋的(顺式)-7a-(4-乙酰氨基-2-吡啶基)-2-苯甲酰氨基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁酯

向搅拌着的3-(4-乙酰氨基-2-吡啶基)-3-(苯甲酰基硫代氨基甲酰基氨基)-4-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(5.16g,8.53mmol)的四氢呋喃(80mL)溶液中在氮气下加入1,1'-羰基二咪唑(1.84g,11.35mmol)。将形成的溶液在室温下搅拌。4小时后，补加1,1'-羰基二咪唑(968.52mg,5.97mmol)并将反应液继续在室温下搅拌。继续搅拌3.5小时后，完全形成中间体咪唑加合物，ES/MS 608(M+1)。然后将反应液升温至75℃，利用硅胶干燥管除去水分并将混合物搅拌过夜。将反应液冷却至室温并用乙酸乙酯稀释。将形成的溶液用水洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩得到黄色油。将残余物通过硅胶柱色谱纯化，利用0至100％乙酸乙酯的异己烷溶液梯度洗脱得到浅黄色固体状标题化合物(3.31g；78％)。ES/MS(m/e)496(M+1)。

制备例22

外消旋的(顺式)-N-[7a-(4-乙酰氨基-2-吡啶基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

将外消旋的(顺式)-7a-(4-乙酰氨基-2-吡啶基)-2-苯甲酰氨基-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁酯(3.31g,6.67mmol)在搅拌下悬浮于二氯甲烷(19mL)。加入三氟乙酸(9.5mL)得到澄清的溶液。将溶液在室温下搅拌2小时并减压除去溶剂。将形成的残余物重新溶于甲醇并将该溶液负载到离子交换柱(50g)上。将该柱用甲醇(3个柱体积)洗脱，然后用2M氨的甲醇溶液(3个柱体积)洗脱。将碱性洗涤液合并并减压浓缩得到黄色固体状标题化合物(2.90g,定量)。ES/MS(m/e)396(M+1)。

制备例23

外消旋的(顺式)-N-[7a-(4-乙酰氨基-2-吡啶基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

向搅拌着的外消旋的(顺式)-N-[7a-(4-乙酰氨基-2-吡啶基)-4a,5,6,7-四氢-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(2.90g,6.61mmol)的1,4-二恶烷(100mL)溶液中加入5-氟-2-氯嘧啶(3.15mL,33.03mmol)和二异丙基乙基胺(5.8mL,33.03mmol)。将形成的溶液在100℃下搅拌18小时并除去水分。减压除去溶剂得到棕色油。将残余物通过硅胶柱色谱纯化，利用0至100％乙酸乙酯的异己烷溶液梯度洗脱得到黄色固体状标题化合物(2.60g；80％)。ES/MS(m/e)492(M+1)。

制备例24

外消旋的(顺式)-7a-(4-氨基-2-吡啶基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺

向外消旋的(顺式)-N-[7a-(4-乙酰氨基-2-吡啶基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(2.6g,5.3mmol)的甲醇(106mL)溶液中加入氢氧化锂(1.3g,52.8mmol)。将反应液在70℃下加热8小时，然后在室温下加热过夜。在该时间内有白色固体沉淀析出并通过过滤将其收集。将过滤的固体用少量甲醇洗涤并干燥得到标题化合物(1.1g；59％)。ES/MS 346(M+1)。将留在滤液中的产物用离子交换色谱回收。将甲醇滤液直接负载到离子交换柱(50g)上，用甲醇洗脱(3个柱体积)，然后用2M氨的甲醇溶液洗脱(3个柱体积)。将碱性洗脱剂减压浓缩得到另外700mg标题化合物，70％纯度。ES/MS 346(M+1)。

制备例25

外消旋的(顺式)-N-[7a-(4-氨基-2-吡啶基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]氨基甲酸叔丁酯

向搅拌着的外消旋的(顺式)-7a-(4-氨基-2-吡啶基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(1.08g,3.12mmol)的二甲基甲酰胺(17mL)悬浮液中加入二碳酸二叔丁酯(1.16g,5.30mmol)的二氯甲烷(9mL)溶液。将悬浮液在室温下搅拌过周末。将反应混合物在二氯甲烷和盐水溶液之间进行分配。将有机相分离并用更多的盐水溶液洗涤。将有机层用无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩得到黄色油。将残余物通过硅胶柱色谱纯化，利用0至5％2M氨/甲醇溶液的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到澄清树胶状标题化合物(外消旋体，1.60g，含有20％残余的二甲基甲酰胺/二氯甲烷)，其不经进一步纯化直接使用。ES/MS(m/e)446(M+1)。

制备例26

外消旋的(顺式)-N-[(4aR,7aR)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-7a-[4-[(5-甲氧基吡嗪-2-羰基)氨基]-2-吡啶基]-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]氨基甲酸叔丁酯

将外消旋的(顺式)-N-[7a-(4-氨基-2-吡啶基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]氨基甲酸叔丁酯(1.01g,2.27mmol)在搅拌下溶于乙酸乙酯(8mL)。然后加入1-丙烷膦酸环状酸酐(>50wt％的乙酸乙酯溶液)(2.31mL,3.63mmol)、三乙胺(948μL,6.80mmol)和5-甲氧基吡嗪-2-甲酸(454mg,2.95mmol)。将形成的溶液在80℃下在氮气下加热1小时20分钟，然后将其冷却至室温。将混合物用乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠水溶液稀释并分层。将水层用乙酸乙酯重新萃取。将有机层合并，用无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩得到棕色固体。将残余物通过硅胶柱色谱纯化，利用0至75％乙酸乙酯的异己烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(576mg,44％)。ES/MS(m/e)582(M+1)。

制备例27

N-[(4aR,7aR)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-7a-[4-[(5-甲氧基吡嗪-2-羰基)氨基]-2-吡啶基]-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]氨基甲酸叔丁酯

将外消旋的(顺式)-N-[(4aR,7aR)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-7a-[4-[(5-甲氧基吡嗪-2-羰基)氨基]-2-吡啶基]-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]氨基甲酸叔丁酯(576mg,0.99mmol)通过手性SFC分离成其组成对映体(柱:OJ-H,25cm x 21.2mm,5微米)；流动相:24％甲醇(0.1％氨)76％CO₂；流速:70mL/min，UV 220nm；35℃；每次注射12mg)。第二洗脱的异构体(异构体2)是标题化合物(207mg,36％)。ES/MS(m/e)582(M+1)。

实施例1

外消旋的(顺式)-N-[2-[(4aR,7aR)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-吡啶基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺

向外消旋的(顺式)-N-[6-(5-氟嘧啶-2-基)-7a-[4-[(5-甲氧基吡嗪-2-羰基)氨基]-2-吡啶基]-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]氨基甲酸叔丁酯(487mg,837.30μmol)的二氯甲烷(14mL)溶液中加入三氟乙酸(1.7mL)并将混合物在室温下搅拌1.5小时。将反应液用二氯甲烷稀释并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。分层并将水层用二氯甲烷重新萃取。将有机层合并，用无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩得到白色固体。将固体通过硅胶柱色谱纯化，利用0至5％2M氨/甲醇溶液的二氯甲烷溶液梯度洗脱得到标题化合物(126mg,31％)。ES/MS(m/e)482(M+1)。

实施例2

N-[2-[(4aR,7aR)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-吡啶基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺

向N-[(4aR,7aR)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-7a-[4-[(5-甲氧基吡嗪-2-羰基)氨基]-2-吡啶基]-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]氨基甲酸叔丁酯(异构体2,207mg,355.90μmol)的二氯甲烷(6mL)溶液中加入三氟乙酸(712μL,9.41mmol)。将形成的溶液在室温下搅拌1.5小时。然后将反应液用二氯甲烷稀释并用饱和碳酸氢钠水溶液溶液洗涤。分层并将水层用二氯甲烷重新萃取。将有机层合并，用无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩得到白色固体，将其在真空烘箱中在35℃下干燥5小时得到标题化合物(186mg,定量)。ES/MS(m/e)482(M+1)。

N-[2-[(4aR,7aR)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-吡啶基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的另一制备例

将外消旋的(顺式)-N-[2-[(4aR,7aR)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-吡啶基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺(126mg,0.262mmol)通过手性HPLC分离成其组成对映体(柱:AD-H,25cm x 21.2mm,5微米)；流动相:1:4比率的乙腈和甲醇(20mM氨的甲醇溶液)；流速:30mL/min，UV可变波长检测；每次注射8mg)。第二洗脱的异构体是标题化合物(92mg,73％)。ES/MS(m/e)482(M+1)。

实施例3

外消旋的(顺式)-N-[2-[2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-吡啶基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺盐酸盐

将外消旋的(顺式)-N-[2-[2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-吡啶基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺(56mg,0.116mmol)溶于乙腈(0.35mL)，然后加入0.1M氯化氢水溶液(1.1mL)。将形成的溶液置于冷冻干燥器上过夜得到白色固体状标题化合物(61mg,51％)。ES/MS(m/e)482(M+1)。

体外试验方法:

对于体外酶和细胞试验，将待测化合物在DMSO中制成10mM储备液。将该储备液在DMSO中系列稀释得到10个点的稀释曲线，在96-孔圆底板中进行体外酶和完整细胞试验前，最终化合物的浓度范围是10μM至0.05nM。

体外蛋白酶抑制试验:

huBACE1Fc的表达和纯化

通过RT-PCR从全脑cDNA克隆人BACE1(保藏号:AF190725)。将对应于氨基酸序列#1至460的核苷酸序列插入编码人IgG₁(Fc)多肽的cDNA(Vassar等人,Science,286,735-742(1999))。将BACE1(1-460)和人Fc的融合蛋白(命名为huBACE1:Fc)构建到pJB02载体中。将人BACE1(1-460):Fc(huBACE1:Fc)在HEK293细胞中瞬时表达。将每个构建体的250μg cDNA与Fugene 6混合并加入到1升HEK293细胞中。转染4天后，收获条件培养液用于纯化。将huBACE1:Fc通过Protein A色谱纯化。将酶以小等分试样保存在–80℃下(参见Yang等人,J.Neurochemistry,91(6)1249-59(2004)。

BACE1FRET试验

如上所述制备待测化合物的系列稀释液。将化合物在KH₂PO₄缓冲液中进一步稀释20倍。将10μL各稀释液加入到相应的含有反应混合物(25μL50mM KH₂PO₄,pH 4.6,1mMX-100,1mg/mL牛血清白蛋白和15μM FRET底物)的低蛋白结合黑色板的A至H行上的每个孔中(参见Yang等人,J.Neurochemistry,91(6)1249-59(2004))。将内含物在板振荡器上良好混合10分钟。将15μL位于KH₂PO₄缓冲液中的200pM人BACE1(1-460):Fc(参见Vasser等人,Science,286,735-741(1999))加入到含底物和待测化合物的板中以开始反应。在板振荡器上简短混合后，在激发波长355nm和发射波长460nm下记录混合物在0时刻的RFU。将反应板用铝箔覆盖并在黑色加湿的烘箱中在室温下放置16至24小时。在与0时刻所用的激发和发射设置相同的条件下记录保温结束时的RFU。0时刻和保温结束时的RFU差值反映了经化合物处理的BACE1的活性。绘制RFU差值对抑制剂浓度的曲线，并将该曲线用四参数Logistic方程拟合得到IC₅₀值(参见Sinha等人,Nature,402,537-540(2000)和May等人,Journal ofNeuroscience,31,16507-16516(2011))。

将实施例2的化合物基本如上所述进行试验，其对BACE1表现出0.90nM(±0.36,n＝10)平均±SEM的IC₅₀值。

该数据表明实施例2的化合物在体外抑制纯化的重组BACE1酶的活性。

用于测定对β-分泌酶活性的抑制作用的完整细胞试验

PDAPP原代神经元试验

还在由PDAPP转基因胚胎小鼠产生的原代神经元培养物中进行了验证性完整细胞试验(记载于Games等人,Nature 373,523-527(1995)和May等人,Journal ofNeuroscience,31,16507-16516(2011))。原代皮层神经元从胚胎16天的PDAPP胚胎制备并在96孔板中培养(15x 10⁴细胞/孔，在DMEM/F12(1:1)加10％FBS中)。在体外2天后，将培养液用含有B27补充剂和2μM(终浓度)Ara-C(Sigma,C1768)的不含血清的DMEM/F12(1:1)代替。在体外的第5天，将神经元在37℃下、在存在/不存在所需浓度的抑制剂(用DMSO稀释)的条件下孵育24小时。在孵育结束时，通过例如对Aβ肽的分析对条件培养液进行分析以证明β-分泌酶活性。通过夹层ELISA测定总的Aβ肽(Aβ1-x)，用单克隆的266作为捕获抗体并用生物素化的3D6作为报告抗体。或者，还可通过夹层ELISA测定Aβ1-40和Aβ1-42肽，利用单克隆2G3作为Aβ1-40的捕获抗体，利用单克隆21F12作为Aβ1-42的捕获抗体。Aβ1-40和Aβ1-42ELISA均利用生物素化的3D6作为报告抗体(对于抗体的描述，可参见Johnson-Wood等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94,1550-1555(1997))。在化合物处理后，在条件培养液中释放的Aβ浓度对应于BACE1在该条件下的活性。绘制10个点的抑制曲线并用四参数Logistic方程拟合得到Aβ-降低效应的IC₅₀值。实施例2的化合物基本如上所述进行试验并且表现出以下活性。降低Aβ_1-40的IC₅₀值＝0.65nM(±0.11,n＝3)。降低Aβ_1-42的IC₅₀值＝0.91nM(±0.16,n＝3)。

该数据表明实施例2的化合物在完整细胞内抑制Aβ_1-40和Aβ_1-42的产生。

Claims

1.下式化合物或其可药用盐:

2.根据权利要求1所述的化合物或盐，其是N-[2-[(4aR,7aR)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-吡啶基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物，其是N-[2-[(4aR,7aR)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氢吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-吡啶基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺。

4.治疗阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括向需要所述治疗的患者施用有效量的权利要求1-3中的任一项所述的化合物或其可药用盐。

5.用于治疗的根据权利要求1-3中的任一项所述的化合物或其可药用盐。

6.用于治疗阿尔茨海默氏病的根据权利要求1-3中的任一项所述的化合物或其可药用盐。

7.药物组合物，其包含根据权利要求1-3中的任一项所述的化合物或其可药用盐和一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。