CN106061991B - 水不溶性高分子化合物的分解物的连续制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题在于，通过容易的操作且高效地使水不溶性蛋白质、水不溶性多糖类等水不溶性高分子化合物进行可溶化和低分子化，从而制造新型的功能性材料。根据本发明来提供水不溶性高分子化合物的分解物的制造方法，其包括如下的各工序：使固体酸催化剂接触水不溶性高分子化合物并进行加热处理后，回收上清液的工序；向回收上清液后的固体酸催化剂中添加水性介质并搅拌，进行加热处理后，进一步回收上清液的工序；用水性介质清洗该固体酸催化剂，回收清洗液的工序；将回收的上清液与清洗液合并，得到非吸附于固体酸催化剂的级分的工序；以及，使吸附的成分从该固体酸催化剂中溶出，回收溶出液，得到吸附于固体酸催化剂的级分的工序。
Description
技术领域
本发明涉及对水不溶性高分子化合物（蛋白质或多糖类）进行可溶化和低分子化，从而连续地制造水不溶性高分子化合物（蛋白质或多糖类）的分解物的方法。
背景技术
近年来，作为药品、饮料食品、化妆品的材料而着眼于功能性蛋白质、功能性肽。其中，作为其代表例，可列举出具备与骨·关节疾病相伴的症状的缓和作用、美肤作用、骨形成作用等的胶原及其分解物、即胶原肽。胶原或胶原肽的原料主要是鱼、牛、猪、鸡皮、骨、腱等，水母类也被用作原料之一，提出了经由对水母类进行冻结·解冻·低温贮藏·搅拌等处理工序而从水母类中有效回收未改性胶原的方法（专利文献1、2等）。
近年来，在日本沿岸各地大量出现水母类成为严重的社会问题，其对渔业造成重大的损害，并且，水母类会聚集在工厂、发电厂等的取水口，为了将其去除、对其进行废弃处理会耗费成本，因此，如上所述，作为胶原的原料期望实现水母的有效利用。截止至今的现状是：被用作胶原原料的水母类主要是小型且容易液化的海月水母，可食用水母（esculentjellyfish）等大型且水不溶性蛋白质多的水母类尚未有效利用。
一般来说，水不溶性蛋白质的可溶化和低分子化通过加热处理、酸或碱处理、蛋白分解酶（蛋白酶）处理等来进行。然而，加热处理存在因蛋白质种类的不同而发生热改性的问题。酸或碱处理中有可能破坏氨基酸，处理后的废液处理耗时耗力。另外，蛋白分解酶处理中，为了配合所用酶的最佳条件，需要设定·控制温度、pH，处理物中残留有酶时，还需要失活、去除酶的操作。
另外，使用固体酸催化剂使蛋白质水解的方法（专利文献3）是已知的，其还用于制造水母胶原肽（专利文献4）。然而，这些例子均以可溶性蛋白质作为对象，未进行水不溶性蛋白质的可溶化和低分子化。
另一方面，作为木质系生物质资源的有效活用，研究了由纤维素、半纤维素、木素构成的木质纤维素的分解技术，但其与上述水不溶性蛋白质存在相同的问题。例如，作为木质纤维素的分解技术，有酸糖化法、酶糖化法，使用了硫酸的酸糖化法虽然存在快速反应的优点，但存在产物（单糖）过度分解的问题，酸的废液处理存在污染环境的问题。另外，使用了纤维素酶的酶糖化法存在环境污染小的优点，但是，纤维素具有β-葡萄糖分子介由1,4糖苷键聚合而成的高分子彼此进行氢键合、不溶于水的稳固的晶体结构，因此，存在与纤维素酶接触的面积少、反应慢的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2007-051191号
专利文献2：日本特开2008-031106号
专利文献3：日本特开2009-120511号
专利文献4：日本特开2013-95708号。
发明内容
发明要解决的问题
因此，本发明的课题在于，通过容易的操作且高效地使水不溶性蛋白质、水不溶性多糖类等水不溶性高分子化合物进行可溶化和低分子化，从而制造新型的功能性材料。
用于解决问题的手段
本发明人等为了解决上述课题而重复进行了深入研究，结果发现：利用固体酸催化剂对水不溶性蛋白质进行处理时，水不溶性蛋白质分解物令人惊讶地主要得到非吸附于固体酸催化剂的级分。并且，通过在重复进行非吸附级分的回收操作后，进一步合并从固体酸催化剂中溶出的吸附级分，从而成功地以高收率连续地制造水不溶性蛋白质分解物，由此完成了本发明。
即，本发明包括以下的发明。
（1）水不溶性高分子化合物的分解物的制造方法，其包括以下的工序：
(A)使固体酸催化剂接触水不溶性高分子化合物后，进行加热处理，并回收上清液的工序；
(B)在工序（A）之后，向该固体酸催化剂中添加水性介质并搅拌，进行加热处理后，回收上清液的工序；
(C)在工序（B）之后，用水性介质清洗该固体酸催化剂，并回收清洗液的工序；
(D)将工序（A）中回收的上清液、工序（B）中回收的上清液和工序（C）的清洗液合并，得到非吸附于固体酸催化剂的级分的工序；
(E)在工序（D）之后，使吸附的成分从该固体酸催化剂中溶出，回收溶出液，得到吸附于固体酸催化剂的级分的工序。
（2）根据（1）所述的方法，其中，水不溶性高分子化合物为水不溶性蛋白质或水不溶性多糖类。
（3）根据（1）或（2）所述的方法，其还包括在使水不溶性高分子化合物接触固体酸催化剂之前浸润至水性介质的工序。
（4）根据（1）~（3）中任一项所述的方法，其中，水不溶性高分子化合物的量相对于固体酸催化剂以质量比计为0.01~0.5倍。
（5）根据（1）~（4）中任一项所述的方法，其中，在前述工序（A）中，调整水不溶性高分子化合物与固体酸催化剂接触时的水性介质的量，以使其相对于固体酸催化剂以质量比计达到1~50倍。
（6）根据（1）~（5）中任一项所述的方法，其中，前述工序（A）和（B）的加热处理在40~160℃下进行0.1~168小时。
（7）根据（1）~（6）中任一项所述的方法，其中，分别重复多次前述工序（A）和（B）的操作，直至非吸附级分中的水不溶性高分子化合物的分解物的收率达到50%以上为止。
（8）根据（1）~（7）中任一项所述的方法，其中，固体酸催化剂为选自阳离子交换体、沸石和硅藻土中的至少1种。
发明的效果
根据本发明，可提供水不溶性高分子化合物的分解物的制造方法。通过使用本发明的方法，能够高效且低成本地由截止至今未被有效利用的材料连续地制造水不溶性高分子化合物的分解物。另外，本发明的方法与以往的加热处理、酸或碱处理、蛋白分解或糖分解酶处理不同，不存在高分子化合物的无用的改性，可进行确实的水解处理，在制造工序中不需要复杂的操作、特殊的控制。
本申请基于2013年12月25日申请的日本专利申请2013-267662号而要求优先权，包括该专利申请的说明书中记载的内容。
附图说明
图1示出作为本发明的一个实施方式的水不溶性蛋白质分解物的连续制造方法的工序图。
图2示出作为本发明的一个实施方式的水不溶性蛋白质分解物的连续制造方法中的非吸附于固体酸催化剂的级分（上清液）的回收方法的一个实施方式。
图3示出非吸附于固体酸催化剂的级分中的水不溶性蛋白质分解物（可食用水母伞部的胶原肽）的回收量变迁(图3a：反应时间24小时、图3b：反应时间48小时）以及基于反应时间的吸附量对比（图3c）。
图4中，图4a示出非吸附于固体酸催化剂的级分中的水不溶性蛋白质分解物（可食用水母伞部的胶原肽）的分子量分布（反应时间24小时、上图：回收液第1~6次、下图：回收液第7~12次、支链淀粉标准品分子量M1：112kDa、 M2：47.3kDa、 M3：22.8kDa、 M4：11.8kDa、M5：5.9kDa)。图4b示出非吸附于固体酸催化剂的级分中的水不溶性蛋白质分解物（可食用水母伞部的胶原肽）的分子量分布（反应时间48小时、支链淀粉标准品分子量M1：112kDa、M2：47.3kDa、 M3：22.8kDa、 M4：11.8kDa、 M5：5.9kDa)。
图5示出吸附于固体酸催化剂的级分中的水不溶性蛋白质分解物（可食用水母伞部的胶原肽）的分子量分布（上图：反应时间24小时、下图：反应时间48小时、支链淀粉标准品分子量M1：112kDa、M2：47.3kDa、M3：22.8kDa、M4：11.8kDa、M5：5.9kDa)。
图6示出非吸附于固体酸催化剂的级分中的水不溶性蛋白质分解物（丝胶肽）的回收量的变迁。
图7示出非吸附于固体酸催化剂的级分中的水不溶性蛋白质分解物（丝胶肽）的分子量分布（上图：回收液第1~6次、下图：回收液第7~12次、支链淀粉标准品分子量M1：112kDa、M2：47.3kDa、M3：22.8kDa、M4：11.8kDa、M5：5.9kDa)。
图8示出吸附于固体酸催化剂的级分中的水不溶性蛋白质分解物（丝胶肽）的分子量分布（支链淀粉标准品分子量M1：112kDa、 M2：47.3kDa、 M3：22.8kDa、 M4：11.8kDa、 M5：5.9kDa)。
图9示出非吸附于固体酸催化剂的级分中的水不溶性蛋白质分解物（角蛋白肽）的分子量分布（上图：回收液第1~5次、下图：回收液第6~8次、支链淀粉标准品分子量M1：112kDa、 M2：47.3kDa、 M3：22.8kDa、 M4：11.8kDa、 M5：5.9kDa)。
图10示出吸附于固体酸催化剂的级分中的水不溶性蛋白质分解物（角蛋白肽）的分子量分布（支链淀粉标准品分子量M1：112kDa、 M2：47.3kDa、 M3：22.8kDa、 M4：11.8kDa、M5：5.9kDa)。
图11示出非吸附于固体酸催化剂的级分中的水不溶性多糖类分解物（琼脂寡糖）的回收量的变迁。
图12示出非吸附于固体酸催化剂的级分中的水不溶性多糖类分解物（琼脂寡糖）的分子量分布(对照物质M1：5.9kDa（昭和电工株式会社制Shodex STANDARD P-82、 M2：3糖(蜜三糖)、M3：2糖(蔗糖)、M4：1糖(葡萄糖))。
具体实施方式
以下针对本发明进行详细说明。
本发明是水不溶性高分子化合物的分解物的制造方法，其包括以下的工序。图1示出其制造工序的概要。
(A)使固体酸催化剂接触水不溶性高分子化合物后，进行加热处理，并回收上清液的工序；
(B)在工序（A）之后，向该固体酸催化剂中添加水性介质并搅拌，进行加热处理后，回收上清液的工序；
(C)在工序（B）之后，用水性介质清洗该固体酸催化剂，并回收清洗液的工序；
(D)将工序（A）中回收的上清液、工序（B）中回收的上清液和工序（C）的清洗液合并，得到非吸附于固体酸催化剂的级分的工序；
(E)在工序（D）之后，使吸附的成分从该固体酸催化剂中溶出，回收溶出液，得到吸附于固体酸催化剂的级分的工序。
作为本发明方法中使用的“水不溶性高分子化合物”，优选为水不溶性蛋白质或水不溶性多糖类。另外，本发明中，“水不溶性高分子化合物的分解物”只要是水不溶性高分子化合物经可溶化·分解而得到的物质即可，则平均分子量、分子量分布不限。
工序(A)：
工序（A）中，使固体酸催化剂接触水不溶性高分子化合物后，进行加热处理，回收上清液。本发明中，“水不溶性”是指无法溶于水的状态。
水不溶性高分子化合物中包括水不溶性蛋白质或水不溶性多糖类，可以是动物性，也可以是植物性，另外，种类也没有特别限定。作为水不溶性蛋白质，可列举出例如胶原、丝胶、丝蛋白、角蛋白、酪蛋白、白蛋白、球蛋白、弹性蛋白、肌凝蛋白、肌动蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、小麦蛋白、胡麻蛋白、卵蛋白等。其中，优选为水母类的胶原，水母类没有限定，可列举出隶属于钵水母纲（Scyphozoa）、根口目（Rhizostomeae)的可食用水母、越前水母、硝水母、Thysanostoma thysanura、蝶形棱口水母、Cephea cephea（イボクラゲ）、海蜇（Rhopilema asamushi）、Cassiopea ornate（サカサクラゲ）等。另外，作为水不溶性多糖类，可列举出纤维素、半纤维素、木质纤维素、菊糖、果胶、葡聚糖、角叉菜多糖、琼脂糖、几丁质、几丁糖等。对于水不溶性高分子化合物原料，为了通过与固定酸催化剂接触来促进可溶化·低分子化，优选的是，使用裁切机、切肉机、切割器等作为前处理来进行粗粉碎，进而进行粉末化。粉末化例如可利用锤磨机、珠磨机、辊磨机、销磨机、共混器等本领域技术人员通常使用的机械来进行。
进行了上述前处理的水不溶性高分子化合物可以在与固体酸催化剂接触之前，浸润于水性介质。浸润因水不溶性高分子化合物的种类而异，优选进行1~36小时左右。
本发明中使用的固体酸催化剂优选为选自阳离子交换体、沸石和硅藻土中的至少一种，更优选为阳离子交换体。这些固体酸催化剂可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。
阳离子交换体优选为具有磺基、羧基中的至少1种的树脂，磺基、羧基可以分别是磺基丙基、羧甲基。在阳离子交换体的抗衡离子为质子以外的情况下，优选置换成质子型后进行使用。磺酸型阳离子交换体是指包含磺酸基（-SO3H）的具有阳离子交换能力的离子交换体，作为优选形态，可列举出包含磺酸基的阳离子交换树脂和包含磺酸基的阳离子交换膜。作为优选的阳离子交换树脂，可列举出东曹株式会社制造的TOYOPEARL SP-650C、SP-550C等那样地包含亲水性乙烯基聚合物作为基材的树脂；Nafion（注册商标）等那样地包含全氟磺酸的聚四氟乙烯共聚物。
沸石只要是通常被用作沸石催化剂的沸石即可使用，没有特别限定，可列举出例如东曹株式会社制造的ゼオラム（注册商标）等。
硅藻土只要能够作为酸催化剂而发挥功能即可使用，没有特别限定，可列举出例如和光纯药工业株式会社制造的硅藻土（颗粒状）等。
本发明中使用的固体酸催化剂的形状可以是粒状、粉末状中的任一者。另外，可适合地使用平均粒径为2μm~2mm左右、离子交换容量为0.01~1eq/L左右的催化剂。
前述固体酸催化剂优选为多孔质体。例如，前述东曹株式会社制造的TOYOPEARLSP-650C、SP-550C是向凝胶过滤色谱用填充剂中导入磺酸基作为离子交换基团的多孔质体。关于多孔质体的细孔尺寸，适当的细孔尺寸因水不溶性高分子化合物的目标分子量而异，例如为0.01~0.75μm、优选为0.05~0.6μm。
水不溶性高分子化合物与固体酸催化剂接触时的水性介质的量还配合着用于湿润水不溶性高分子化合物的水性介质，相对于固体酸催化剂以质量比计为1~50倍、优选为5~15倍。本发明的方法中，为了以水不溶性高分子化合物的分解物为主而回收至固体酸催化剂的非吸附级分（上清液），水性介质的量低于上述范围时，需要进行离心分离操作，故不优选。另外，水性介质的量超过上述范围时，作业效率变差，故不优选。本发明中，水不溶性高分子化合物的浸润以及水不溶性高分子化合物与固体酸催化剂的接触中使用的水性介质只要不妨碍水不溶性高分子化合物与固体酸催化剂的反应就没有特别限定，可列举出例如水（离子交换水、纯化水、RO水、自来水、井水等）、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、TRIS等缓冲液、氯化钠、氯化钾、氯化钙等无机盐水溶液等。另外，盐浓度优选为1mM~0.1M左右的低浓度。
水不溶性高分子化合物的量可根据固体酸催化剂的催化剂能力来适当确定，例如，相对于固体酸催化剂，以质量比计为0.01~0.5倍、优选为0.05~0.2倍。
固体酸催化剂与水不溶性高分子化合物接触后的加热处理对于良好地推进水不溶性高分子化合物的可溶化和低分子化反应而言是必须的。加热温度为40~160℃、优选为60~120℃、更优选为80~100℃，加热时间取决于加热温度，为0.1~168小时、优选为10~72小时、更优选为24~48小时。例如，水不溶性高分子化合物为水不溶性蛋白质时，重要的是，其低分子化停留在分解至肽为止，在高温下长时间处理时，水不溶性蛋白质有可能被水解为氨基酸，因此优选的是，处理温度越为高温，则越减少处理时间。
本发明中，水不溶性高分子化合物与固体酸催化剂的接触优选用间歇法进行。用间歇法进行时，将容器内的固体酸催化剂与水不溶性高分子化合物充分混合后，进行加热。加热优选在密封容器后进行。加热条件如上所示。间歇法中使用的容器可以是1个，也可以是多个。
进行上述加热处理后，回收上清液。上清液的回收可通过沉降分离、上浮分离、过滤、膜分离、离心分离等方法来进行，沉降分离是简便的，故而优选。将上清液的回收方法的例子示于图2。固体酸催化剂比水性介质更重，因此，若静置则通常在15分钟左右发生沉淀，在实际操作中，可以在罐底的略上方（固体酸催化剂的沉淀位置的略上方）设置排液阀，由此进行排液来回收上清液。或者，也可以在罐底设置具有如下孔径的过滤器，由此进行排液来回收上清液，所述孔径会使包含水不溶性高分子化合物的分解物的上清液穿过，但固体酸催化剂无法穿过。
该工序中的上述一系列操作（水不溶性高分子化合物与固体酸催化剂的接触、加热处理、上清液的回收）要进行多次。针对次数，可根据水不溶性高分子化合物的种类、该工序的目标收率来适当变更，可例示出4~5次左右。关于重复次数，以将该工序的上清液、下一工序（B）的上清液和下一工序（C）的清洗液合并的非吸附级分中的水不溶性高分子化合物的分解物的收率达到50%以上、优选达到65%以上、更优选达到70%以上、最优选达到80%以上的方式进行确定。关于水不溶性高分子化合物与固体酸催化剂的各次接触，从基于固体酸催化剂的水不溶性高分子化合物的可溶化·低分子化效率的观点出发，优选的是，将要处理的水不溶性高分子化合物的总量分成等量来进行。
工序(B)：
工序（B）中，在工序（A）之后，向该固体酸催化剂中添加水性介质并搅拌，进行加热处理后，回收上清液。通过该工序，在工序（A）中未被可溶化而附着于固体酸催化剂表面的水不溶性高分子化合物发生可溶化和低分子化，从而能够回收。该工序的加热处理按照前述固体酸催化剂与水不溶性高分子化合物接触时的加热处理条件（温度和时间）进行即可。另外，该工序的回收操作还优选进行多次。针对次数，可根据水不溶性高分子化合物的种类、工序（A）中的水不溶性高分子化合物的分解物的收率和最终目标收率来适当变更，可例示出3~6次左右。重复次数以将工序（A）的上清液、工序（B）的上清液和下一工序（C）的清洗液合并的非吸附级分中的水不溶性高分子化合物的分解物的收率达到50%以上、优选达到65%以上、更优选达到70%以上、最优选达到80%以上的方式确定即可。上清液的回收可以与工序（A）同样地进行。
工序(C）：
工序（C）中，在工序（B）之后，用水性介质清洗固体酸催化剂，回收清洗液。该工序中，不进行加热处理，用水性介质对固体酸催化剂进行1次清洗即可。
工序(D)：
工序（D）中，将工序（A）中回收的上清液、工序（B）中回收的上清液和工序（C）中回收的清洗液合并，得到非吸附于固体酸催化剂的级分。通过该工序，能够通过与固体酸催化剂的反应来进行可溶化·低分子化，并且，以高收率得到非吸附于固体酸催化剂的水不溶性高分子化合物。
工序(E)：
工序（E)中，在工序（D）之后，使吸附的成分从固体酸催化剂中溶出，回收溶出液，得到吸附于固体酸催化剂的级分。溶出可使用以高浓度（0.1M以上）包含氯化钠等盐的水溶液或盐酸、三氟乙酸等酸、三乙胺等碱等。根据本发明的方法，利用上述工序（A）~（D）能够以高收率得到水不溶性高分子化合物的分解物，进而，根据该工序，在通过与固体酸催化剂的反应而进行了可溶化·低分子化的水不溶性高分子化合物的分解物之中，还能够得到吸附于固体酸催化剂的水不溶性高分子化合物的分解物，能够进一步提高收率。
工序（D）中得到的非吸附级分和工序（E）中得到的吸附级分可以分别干燥而制成最终制品，另外，也可以在混合后进行干燥而制成最终制品。作为干燥方法，没有特别限定，可列举出自然干燥、冻结干燥、送风干燥、温风干燥、真空干燥、基于微波照射的干燥等方法。
实施例
以下，通过实施例来更具体地说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。
（实施例1）可食用水母伞部的不溶性胶原的可溶化·低分子化
(1) 可食用水母伞部的不溶性胶原的制备
将日本福冈县柳川市的有明海中采取的可食用水母分离成伞部和口腕部。将处于伞部内侧的褐色皮剥掉后，用自来水进行清洗，进一步用微酸性电解水、臭氧水进行清洗杀菌。切取1kg个体，破碎成1mm~1cm的方形断片。用纱布过滤，得到包含不溶性胶原的固体。将所得固体用9倍量的RO水进行悬浊，通过过滤来回收固体。将该操作进一步重复2次，进行清洗·脱盐。对回收的固体进行冻结干燥，干燥后利用共混器进行粉末化，从而得到不溶性胶原粉末。
(2) 基于固体酸催化剂的可食用水母伞部的不溶性胶原的可溶化·低分子化
(2-1)反应时间为24小时
用90ml的RO水使(1)中制备的不溶性胶原粉末1g湿润1晩后，与阳离子交换树脂（TOYOPEARL SP-550C）10ml混合，充分搅拌。使其以80℃反应24小时而进行可溶化后，进行冷却，回收包含胶原肽的上清液。接着，与上述同样操作，使(1)中制备的可食用水母伞部的不溶性胶原粉末湿润1晩后，添加至前述上清液回收后的阳离子交换树脂，用RO水定容至100ml后，充分搅拌。使其以80℃反应24小时，再次回收上清液。将该操作进一步重复3次（回收1~5次结束）。可食用水母伞部的不溶性胶原粉末各次使用等量，共计使用5g。
向残留的阳离子交换树脂中添加RO水，定容至100ml，充分搅拌。使其以80℃反应24小时后，回收上清液。将该操作进一步重复6次（回收6~11次结束）。将残留的阳离子交换树脂用30ml的RO水进行清洗。将回收的上清液与清洗液混合，得到未吸附至阳离子交换树脂的分子量（Mp）12kDa以下的胶原肽液。
图3a示出回收的上清液中的胶原肽（非吸附肽）的量的变迁（反应时间为24小时）。
接着，向清洗后的阳离子交换树脂中添加0.5M NaCl 30ml，从树脂中溶出包含胶原肽的分解物。将其进一步重复3次，将所有溶出液混合，得到吸附于阳离子交换树脂的分子量（Mp）12kDa以下的胶原肽液。
(2-2)反应时间为48小时
用90ml的RO水使(1)中制备的不溶性胶原粉末1g湿润1晩后，与阳离子交换树脂（TOYOPEARL SP-550C）10ml混合，充分搅拌。使其以80℃反应48小时而进行可溶化后，进行冷却，回收包含胶原肽的上清液。接着，与上述同样操作，使(1)中制备的可食用水母伞部的不溶性胶原粉末湿润1晩后，添加至前述上清液回收后的阳离子交换树脂，用RO水定容至100ml后，充分搅拌。使其以80℃反应48小时，再次回收上清液。将该操作进一步重复3次（回收1~5次结束）。可食用水母伞部的不溶性胶原粉末各次使用等量，共计使用5g。
向残留的阳离子交换树脂中添加RO水，定容至100ml，充分搅拌。使其以80℃反应48小时后，回收上清液。将该操作进一步重复2次（回收6~8次结束）。将残留的阳离子交换树脂用80ml的RO水进行清洗。将回收的上清液与清洗液混合，得到未吸附于阳离子交换树脂的分子量（Mp）12kDa以下的胶原肽液。
图3b示出回收的上清液中的胶原肽（非吸附肽）的量的变迁（反应时间为48小时）。
接着，向清洗后的阳离子交换树脂中添加0.5M NaCl 50ml，从树脂中溶出包含胶原肽的分解物。将该操作进一步重复2次，将所有的溶出液混合，得到吸附于阳离子交换树脂的分子量（Mp）12kDa以下的胶原肽液。
(3)肽混合物的定量
(3-1)胶原肽标准样品的制备
用100ml的RO水使可食用水母伞部的不溶性胶原粉末1g湿润1晩后，与阳离子交换树脂（TOYOPEARL SP-550C）100g混合，充分搅拌。使其以80℃反应24小时而进行可溶化后，进行冷却，用RO水500ml进行清洗。将清洗后的树脂用5%三乙胺/10%乙腈100ml提取3次。与所得提取液混合后，用旋转蒸发仪进行浓缩干固。用RO水溶解已干固的提取物，进行冻结干燥。将所得干燥物调整至3.00、1.50、0.75、0.375、0.188mg/ml，用于胶原肽定量用的标准曲线。
(3-2)肽量的测定
(2)中使用的胶原肽量的测定使用了PIERCE公司制造的BCA protein assay kit。将BCA protein assay reagent A与BCA protein assay reagent B以50:1进行混合，将其制成BCA reagent。将样品100μl与BCA reagent 2ml混合，以37℃培养15分钟后，用562 nm测定吸光度。吸光度测定使用了三绅公司制造的数码比色计mini photo 10。由利用(3-1）制作的胶原肽标准曲线计算肽量。
将反应24小时的测定结果示于表1和表2。回收的上清液中的胶原肽(非吸附肽）量为3.65g、收率为73%。另外，回收的溶出液中的胶原肽(吸附肽）量为0.86 g、收率为17%。
[表1]
[表2]
将反应48小时的测定结果示于表3和表4。回收的上清液中的胶原肽(非吸附肽）量为3.58g、收率为72%。另外，回收的溶出液中的胶原肽(吸附肽）量为0.77g、收率为15%。
[表3]
[表4]
如上所示，反应时间为24小时和48小时时，收率没有显著差异，反应时间为48小时时，回收次数少即可，可以说是有效的。
(4)肽混合物的分子量分布的分析
使用凝胶渗透色谱测定(2)中得到的胶原肽的分子量分布。以下示出测定条件。
a) HPLC装置：使用了泵GL Sciences公司制 GL-7410、自动取样器GL Sciences公司制GL-7420、柱恒温槽GL Sciences公司制CO631C、UV检测器 岛津制作所制 SPD-10AV和日立公司制L-4200、RI检测器GL Sciences公司制GL-7454、真空Degasser Gastorr公司制AG-14。
b) 柱：东曹株式会社制TSKgel G3000SWXL（7.8×300mm, 5μm）
c) 流动相：50mM磷酸钠缓冲液/50mM氯化钠（pH 7.0）
d) 流速：0.5ml/min
e) 温度：20℃
f) 测定波长：215nm、280nm
g) 分子量测定用标准品：以昭和电工公司制造的Shodex STANDARD P-82达到0.1%的方式进行制备，作为分子量测定用标准液。
图4示出上清液中的胶原肽（非吸附肽）的分子量分布（支链淀粉标准品分子量M1：112kDa、M2：47.3kDa、M3：22.8kDa、M4：11.8kDa、M5：5.9kDa)。反应时间为24小时时，回收第1次、第2次能够得到支链淀粉分子量换算为5.9kDa以下的尖锐的峰，其后在高分子侧得到宽阔的峰(图4a）。反应时间为48小时时，峰从高分子侧略微向低分子侧位移（图4b）。
图5示出溶出液中的胶原肽（吸附肽）的分子量分布（支链淀粉标准品分子量M1：112kDa、M2：47.3kDa、M3：22.8kDa、M4：11.8kDa、M5：5.9kDa)。吸附肽的分子量低于非吸附肽，峰值为5.9kDa以下。另外，不受反应时间的影响，反应24小时和反应48小时时，分子量分布大致相同。
（实施例2）丝胶的可溶化·低分子化
(1) 基于固体酸催化剂的丝胶的可溶化·低分子化
用90ml的RO水使丝胶粉末（高原公司制）1g湿润1晩后，与阳离子交换树脂（TOYOPEARL SP-550C）10ml混合，充分搅拌。使其以80℃反应24小时而进行可溶化后，进行冷却，回收包含丝胶肽的上清液。接着，与上述同样操作，使丝胶粉末湿润1晩后，将上述上清液添加至回收后的阳离子交换树脂，用RO水定容至100ml后，充分搅拌。使其以80℃反应24小时，再次回收上清液。将该操作进一步重复3次（回收1~5次结束）。丝胶粉末各次使用等量，共计使用5g。向残留的阳离子交换树脂中添加RO水，定容至100ml，充分搅拌。使其以80℃反应24小时后，回收上清液。将该操作进一步重复6次（回收6~11次结束）。将残留的阳离子交换树脂用60ml的RO水进行清洗。将回收的上清液与清洗液混合，得到未吸附于阳离子交换树脂的分子量（Mp）5.9kDa以下的丝胶肽液。
图6示出回收的上清液中的丝胶肽（非吸附肽）的量的变迁。
接着，向清洗后的阳离子交换树脂中添加0.5M NaCl 60ml，从树脂中溶出包含丝胶肽的分解物。将其进一步重复3次，将所有溶出液混合，得到吸附于阳离子交换树脂的分子量（Mp）5.9kDa以下的丝胶肽液。
(2)肽混合物的定量
(2-1)丝胶肽标准样品的制备
对(1)中得到的非吸附于阳离子交换树脂的丝胶肽液进行冻结干燥。将所得干燥物调整至0.75、0.375、0.188、0.094mg/ml，用于丝胶肽定量用的标准曲线。
(2-2)丝胶肽量的测定
(1)中得到的丝胶肽量的测定除了使用上述丝胶肽定量用的标准曲线之外，与实施例1的(3-2)同样操作来进行。
将上述的测定结果示于表5和表6。回收的上清液中的丝胶肽（非吸附肽）量为3.36g、收率为67%。另外，回收的溶出液中的丝胶肽（吸附肽）量为0.21g、收率为4%。
[表5]
[表6]
(3)肽混合物的分子量分布的解析
按照与实施例1相同的测定条件，使用凝胶渗透色谱测定(1)中得到的丝胶肽的分子量分布。
图7示出上清液中的丝胶肽（非吸附肽）的分子量分布（支链淀粉标准品分子量M1：112kDa、M2：47.3kDa、M3：22.8kDa、M4：11.8kDa、M5：5.9kDa)。回收第1次、第2次能够得到支链淀粉分子量换算为5.9kDa以下的尖锐的峰，其后在高分子侧得到宽阔的峰。
图8示出溶出液中的丝胶肽（吸附肽）的分子量分布（支链淀粉标准品分子量 M1：112kDa、M2：47.3kDa、M3：22.8kDa、M4：11.8kDa、M5：5.9kDa)。吸附肽的峰值与非吸附肽的回收第1~2次、第7~12次没有显著差异。
（实施例3）角蛋白的可溶化･低分子化
（1）基于固体酸催化剂的角蛋白的可溶化·低分子化
用90ml的RO水使角蛋白粉末（ナカライテスク）1g湿润1晩后，与阳离子交换树脂（TOYOPEARL SP-550C）10ml混合，充分搅拌。使其以100℃反应48小时而进行可溶化后，进行冷却，回收包含角蛋白肽的上清液。接着，与上述同样操作，使角蛋白粉末湿润1晩后，将上述上清液添加至回收后的阳离子交换树脂，用RO水定容至100ml后，充分搅拌。使其以100℃反应48小时，再次回收上清液。将该操作进一步重复3次（回收1~5次结束）。角蛋白粉末各次使用等量，共计使用5g。向残留的阳离子交换树脂中添加RO水，定容至100ml，充分搅拌。使其以100℃反应48小时后，回收上清液。将该操作进一步重复2次（回收6~8次结束）。将残留的阳离子交换树脂用80ml的RO水进行清洗。将回收的上清液与清洗液混合，得到未吸附于阳离子交换树脂的分子量（Mp）5.9kDa以下的角蛋白肽液。
接着，向清洗后的阳离子交换树脂中添加0.5M NaCl 50ml，从树脂中溶出包含角蛋白肽的分解物。将其进一步重复2次，将所有溶出液混合，得到吸附于阳离子交换树脂的分子量（Mp）5.9kDa以下的角蛋白肽液。
（2）肽混合物的定量
（2-1）角蛋白肽标准样品的制备
对(1)中得到的吸附于离子交换树脂的角蛋白肽液（溶出液）进行冻结干燥。将所得干燥物调整至0.75、0.375、0.188、0.094mg/ml，用于角蛋白肽定量用的标准曲线。
（2-2）角蛋白肽量的测定
利用(1)得到的角蛋白肽之中，溶出液中的角蛋白肽使用上述角蛋白肽定量用的标准曲线，除此之外，与实施例1的（3-2）同样操作来进行。另外，针对上清液（包含清洗液）中的角蛋白肽，对上清液进行冻结干燥，测定干燥重量。
回收的上清液中的角蛋白肽（非吸附肽）量为2.65g、收率为53%。另外，回收的溶出液中的角蛋白肽（吸附肽）量为0.20g、收率为4%。
(3)肽混合物的分子量分布的解析
按照与实施例1相同的测定条件，使用凝胶渗透色谱测定(1)中得到的角蛋白肽的分子量分布。
图9示出上清液中的角蛋白肽（非吸附肽）的分子量分布（支链淀粉标准品分子量M1：112kDa、M2：47.3kDa、M3：22.8kDa、M4：11.8kDa、M5：5.9kDa)。回收第1~5次、第6~8次均能够得到支链淀粉分子量换算为5.9kDa以下的尖锐的峰。
图10示出溶出液中的角蛋白肽（吸附肽）的分子量分布。吸附肽的峰值与非吸附肽没有明显差别。
（实施例4）琼脂的可溶化･低分子化
（1）基于固体酸催化剂的琼脂的可溶化･低分子化
用90ml的RO水来悬浮琼脂粉末（关东化学）1g，与阳离子交换树脂（TOYOPEARL SP-550C）10ml混合，充分搅拌。使其以100℃反应24小时而进行可溶化后，进行冷却，回收包含琼脂寡糖的上清液。接着，与上述同样操作，使琼脂粉末湿润1晩后，将上述上清液添加至回收后的阳离子交换树脂，用RO水定容至100ml后，充分搅拌。使其以100℃反应24小时，再次回收上清液。将该操作进一步重复3次（回收1~5次结束）。琼脂粉末各次使用等量，共计使用5g。
向残留的阳离子交换树脂中添加RO水，定容至100ml，充分搅拌。使其以100℃反应24小时后，回收上清液。将该操作进一步重复2次（回收6~8次结束）。将残留的阳离子交换树脂用80ml的RO水进行清洗。将回收的上清液与清洗液混合，得到未吸附于阳离子交换树脂的琼脂寡糖液。
图11示出回收的上清液中的琼脂寡糖（非吸附寡糖）的量的变迁。
接着，向清洗后的离子交换树脂中添加0.5M NaCl 50ml，从树脂中溶出包含琼脂寡糖的分解物。将其进一步重复2次，将所有溶出液混合，得到吸附于阳离子交换树脂的琼脂寡糖液。
（2）寡糖混合物的定量
利用(1)得到的琼脂寡糖之中，针对上清液（包含清洗液）中的琼脂寡糖，对上清液进行冻结干燥，测定干燥重量。另外，溶出液中的琼脂寡糖通过下示的苯酚硫酸法来计算。首先，向样品1.0ml中添加5%苯酚液1.0ml并混合。接着，迅速地直接滴加浓硫酸5.0ml并混合。在室温下放置10分钟，其后在水浴中冷却10分钟。用470nm测定吸光度。吸光度测定使用了三绅公司制造的数码比色计mini photo 10。标准品使用制备成50、100、150mg/ml的葡萄糖，用于标准曲线。
将上述的测定结果示于表7。回收的上清液中的琼脂寡糖（非吸附寡糖）量为4.15g、收率为83%。
[表7]
另外，回收的溶出液中未检出琼脂寡糖，收率为0%。
（3）寡糖混合物的分子量分布的分析
使用凝胶渗透色谱测定（1）中得到的琼脂寡糖的分子量分布。测定中，柱使用东曹株式会社制造的TSKgel G-OLIGO-PW（7.8×300mm），除此之外，按照与实施例1相同的测定条件进行测定。另外，作为对照物质，使用了分子量测定用标准品（昭和电工株式会社制造的Shodex STANDARD P-82（分子量5.9kDa))、1糖(葡萄糖)、2糖(蔗糖)、3糖(蜜三糖)。
图12示出上清液中的琼脂寡糖（非吸附寡糖）的分子量分布（对照物质M1：5.9kDa（M1：昭和电工株式会社制 Shodex STANDARD P-82、M2：3糖(蜜三糖)、M3：2糖(蔗糖)、M4：1糖(葡萄糖)）。关于回收第1~5次，3糖(蜜三糖)以上均能够得到宽阔的峰。
产业利用性
本发明能够在成为药品、饮料食品、化妆品等的材料的功能性肽或功能性寡糖的制造领域中使用。
本说明书中援引的所有刊行物、专利和专利申请直接作为参考而引用至本说明书中。
Claims (7)
1.水不溶性蛋白质的分解物的制造方法，其包括以下的工序：
(A)使阳离子交换树脂接触水不溶性蛋白质后，进行加热处理，并回收上清液的工序；
(B)在工序（A）之后，向该阳离子交换树脂中添加水性介质并搅拌，进行加热处理后，回收上清液的工序；
(C)在工序（B）之后，用水性介质清洗该阳离子交换树脂，并回收清洗液的工序；
(D)将工序（A）中回收的上清液、工序（B）中回收的上清液和工序（C）的清洗液合并，得到非吸附于阳离子交换树脂的级分的工序；
(E)在工序（D）之后，使吸附的成分从该阳离子交换树脂中溶出，回收溶出液，得到吸附于阳离子交换树脂的级分的工序。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，水不溶性蛋白质为胶原、丝胶、丝蛋白、角蛋白、酪蛋白、白蛋白、球蛋白、弹性蛋白、肌凝蛋白、肌动蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、小麦蛋白、胡麻蛋白或卵蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其还包括在使水不溶性蛋白质接触阳离子交换树脂之前浸润至水性介质的工序。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，水不溶性蛋白质的量相对于阳离子交换树脂以质量比计为0.01~0.5倍。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在所述工序（A）中，调整水不溶性蛋白质与阳离子交换树脂接触时的水性介质的量，以使其相对于阳离子交换树脂以质量比计达到1~50倍。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述工序（A）和（B）的加热处理在40~160℃下进行0.1~168小时。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，分别重复多次所述工序（A）和（B）的操作，直至非吸附级分中的水不溶性蛋白质的分解物的收率达到50%以上为止。
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