CN106038606A - 美洲大蠊提取物在制备预防和治疗骨质疏松药物中的应用 - Google Patents

美洲大蠊提取物在制备预防和治疗骨质疏松药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了美洲大蠊提取物在制备预防和治疗骨质疏松药物中的应用，所述的美洲大蠊提取物具有促进成骨细胞的迁移，促进静脉内皮细胞形成血管，促进静脉内皮细胞向创伤部位移动，促进破骨细胞凋亡的作用；所述的药物为康复新液，具有促进成骨细胞的迁移，促进静脉内皮细胞形成血管，促进静脉内皮细胞向创伤部位移动，促进破骨细胞凋亡的作用，从而起到促进骨质疏松中骨组织的修复的作用。本发明所述的药物对骨质疏松的治疗效果明显，为临床治疗骨质疏松提供了一种新选择。

Description

美洲大蠊提取物在制备预防和治疗骨质疏松药物中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种美洲大蠊提取物在制备防治骨质疏松的药物中的应用。
背景技术
随着世界人口老龄化日趋明显，骨质疏松症的发病率逐年升高，由骨质疏松症所致的骨痛和骨折直接影响了中老年人的生存质量，已经成为严峻的社会问题。人体的骨骼通过不断的骨生成和骨吸收，一直在进行着改造，这种改造叫骨改造。在骨改造的过程中，有骨生成作用的成骨细胞和骨破坏作用的破骨细胞起重要的作用。两种细胞相互协调，骨形成和骨吸收处于一种动态平衡，维持骨质的不断更新。在年轻时骨生成和骨吸收保持着良好的平衡，但随着年龄的增长，由于各种原因该平衡倾向于骨吸收，长时间持续该状态的话会使得骨组织变脆，导致发生骨质疏松症、骨折等各种骨疾病。
针对骨质疏松症的发病机理，目前主要有两种治疗骨质疏松症的方案：抑制破骨细胞的形成和骨吸收活性，还有一个是促进成骨细胞的形成和骨形成活性。
美洲大蠊为昆虫纲有翅亚纲蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫昆虫，俗称“蟑螂”，其入药始载于《神农本草经》，并把它列为中品，谓“味：咸、寒；治：血瘀症坚寒热、破积聚、咽喉闭”。未见美洲大蠊在骨质疏松中的应用的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种美洲大蠊提取物在制备预防和治疗骨质疏松的药物中应用。
为达到上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：
美洲大蠊提取物在制备用于预防和治疗骨质疏松的药物中的应用。
所述的美洲大蠊提取物具有促进成骨细胞迁移的作用。
所述的美洲大蠊提取物具有促进静脉内皮细胞向创伤部位移动的作用。
所述的美洲大蠊提取物具有促进静脉内皮细胞形成血管的作用。
所述的美洲大蠊提取物具有促进破骨细胞凋亡的作用。
本发明所述的药物具有促进成骨细胞迁移的作用。
本发明所述的药物具有促进静脉内皮细胞向创伤部位移动的作用。
本发明所述的药物具有促进静脉内皮细胞形成血管的作用。
本发明所述的药物具有促进破骨细胞凋亡的作用。
本发明所述的药物为康复新液，为四川好医生攀西有限责任公司生产。
本发明所述的美洲大蠊提取物能够促进成骨细胞的迁移，促进静脉内皮细胞形成血管，促进静脉内皮细胞向创伤部位移动，促进破骨细胞凋亡的作用。本发明所述的药物具有促进成骨细胞的迁移、促进破骨细胞凋亡，促进静脉内皮细胞形成血管，促进静脉内皮细胞向创伤部位移动的作用，从而促进骨质疏松中骨组织的修复；所述的药物对骨质疏松的治疗效果明显，为临床治疗骨质疏松提供了一种新选择。
附图说明
图1为本发明所述的药物以及美洲大蠊提取物对成骨细胞迁移作用实验结果图；其中A为空白组，B为美洲大蠊提取物（0.1mg/ml），C为美洲大蠊提取物（1mg/ml），D为美洲大蠊提取物（2mg/ml），E为康复新液（0.1mg/ml），F为康复新液（1mg/ml），G为康复新液（2mg/ml）。
图2为本发明所述的药物以及美洲大蠊提取物对静脉内皮细胞趋向性运动的影响实验结果图；
图3为本发明所述的药物以及美洲大蠊提取物对静脉内皮细胞形成血管的影响实验结果图；
其中，a为空白组，b为美洲大蠊提取物（0.1mg/ml），c为美洲大蠊提取物（1mg/ml），d为美洲大蠊提取物（5mg/ml），e为康复新液（0.1mg/ml），f康复新液（1mg/ml），g为康复新液（5mg/ml）。
下面将结合具体实施例和实验例对本发明做进一步说明，但它们不是对本发明的进一步限制。
具体实施方式
实施例1美洲大蠊提取物的制备
A、粉碎：将干燥的美洲大蠊虫体粉碎，过24目筛，制得美洲大蠊粗粉；
B、浸泡：将步骤A所得美洲大蠊粗粉加入美洲大蠊粗粉重量2～3倍量浓度为90%～95%的乙醇浸泡密闭保存，制得粗粉混合液；
C、提取浓缩：将步骤B的美洲大蠊粗粉和乙醇混合液投入多功能提取浓缩机组的提取罐内，再加入美洲大蠊粗粉重量4～8倍量浓度为90%～95%的乙醇，罐内蒸汽加热至75～80℃，经过45～60分钟后，将部分提取液放入浓缩器中，在真空度0.05～0.06MPa、温度50～60℃的条件下减压浓缩，浓缩得到的回收酒精再返回提取罐中，如此边常压热回流提取边减压浓缩，连续提取浓缩10～15小时后至提取液色淡时提取结束，提取液浓缩至比重为1.05～1.15时，得乙醇浓缩液；
D、脱脂：将步骤C所得乙醇浓缩液移入脱脂罐内，加入乙醇浓缩液重量7～10倍量的纯化水，边搅拌边升温至85～95℃后搅拌10～60分钟，搅拌速度为20～60转/分，然后保温静置1～5小时使油水分层；
E、浓缩：将步骤D所得下层水层放出，经滤纸过滤后，滤液移入浓缩器，在温度60～80℃、真空度0.05～0.06MPa条件下减压浓缩至比重为1.25～1.35时，即得美洲大蠊提取物。
实验例1对成骨细胞迁移作用的影响
实验材料：成骨细胞（鼠源）；α-MEM培养液；胎牛血清（Gibco, USA）；青霉素/链霉素原液（中国医学科学院生物医学工程研究所）；谷氨酰胺；非必需氨基酸；洁净工作台；二氧化碳细胞培养箱；划痕插件；倒置荧光显微镜
实验过程：
种板：用胰酶消化细胞，轻轻拍打下贴壁细胞，加入培养液终止胰酶作用，小心收集细胞于离心管中，离心（1200r/min，5min），去除上清液，用10ml培养液重悬细胞，计数。调整细胞悬液浓度，使其细胞浓度为：5×105cell/ml，向插件的小方格内分别加入70ul的细胞悬液，方格外面的小盘子中加入200ul的培养液。5％CO2，37℃孵育过夜。
加药：去掉上清，拔掉插件，用不含胎牛血清的培养液配制梯度药物浓度（实施例1制备的美洲大蠊提取物：0.1、1、2mg／mL；康复新浓度：0.1、1、2mg／mL），每个小盘子中加入2ml的药液，放显微镜下观察，分别在0h、24h、48h后，每个实验组取3个视野拍照，实验结果见图1。
如图1中所示，各试验组作用24小时后，空白组有少量细胞迁移至划痕区。与空白组相比，美洲大蠊提取物（0.1-1mg/mL），康复新液（0.1-2mg/mL）对成骨细胞的迁移均有不同程度的促进作用。各试验组作用48小时后，空白组有更多的细胞迁移至划痕区。而与空白组相比，美洲大蠊提取物（0.1-1mg/mL），康复新液（0.1-2mg/mL）也进一步表现出对成骨细胞的迁移的促进作用，细胞迁移至划痕区交织成网状。
综上，所测试的美洲大蠊提取物、康复新液对均有促进成骨细胞迁移的效果。康复新液的促进迁移的效果更优，在所测试的范围内（0.1-2mg/mL）时均表现出显著的促迁移效应。在浓度为0.1和1mg/mL时，在24h和48h时，划痕区的细胞相对于其它各组，细胞密度更高，并交织成网状。有利于骨折部位骨痂的快速形成，促进骨组织修复。促进成骨细胞的形成和骨形成活性。可以预防骨质疏松的形成。
实验例2对破骨细胞的影响
1、破骨细胞凋亡试验
实验材料：
小鼠巨噬细胞（RAW264.7）；破骨细胞（0steoclasts）；DMEM高糖培养液；血清（Gibco,USA）；细胞刮刀；RANKL；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（碧云天）；二氧化碳细胞培养箱（HF240, Heat force）；生物安全柜（BSC-1100IIA，北京东联哈尔仪器制造有限公司）；Eppendorf离心机（AG22331, Eppendorf）；流式细胞仪（FC500MCL, Bechmancoult）；倒置显微镜（ECLIPSE-TI-S，Nikon）。
实验过程：
种板：用细胞刮刀轻柔地将贴壁的RAW264.7细胞刮下，轻柔吹打均匀后，小心收集细胞于离心管中，离心（1200r/min，5min），去除上清液，用10ml不含有血清的培养液重悬细胞，计数。取细胞悬液混匀新鲜培养基，细胞计数板计数。并以2×105cell/孔的密度接种于培养板，用倒置显微镜观察细胞的形态特征。5％C02，37℃孵育，贴壁过夜至细胞单层铺满孔底。
破骨细胞诱导：置于37 ℃、5％ CO2培养箱内培养7 d，每孔加人RANKL，并调节成终浓度为100 ng/ml，在第3、5天换液，并保持RANKL的终浓度为100 ng/ml，在第七天时破骨细胞形成并开始后续试验。
加药：去上清，加入用不含有血清的培养液配制的浓度梯度的药物（实施例1制备的美洲大蠊提取物浓度：0.1 mg/mL, 1 mg/mL , 2mg/mL；康复新液浓度：0.1 mg/mL，1mg/mL，2mg/mL），每孔3ml，每个浓度设3个复孔。同时设定三组空白对照组（每孔加3ml培养液）；5％C02，37℃孵育72h后立即进行后续实验。
细胞凋亡测定：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用使用细胞刮刀将破骨细胞刮下加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000r/min离心5分钟，沉淀细胞。加入细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1000 r /min离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞。1000 r /min离心5分钟，弃上清，加入195µl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5µl Annexin V-FITC，轻轻混匀。加入10µl碘化丙啶染色液，轻轻混匀。室温(20℃)避光孵育20分钟，随后置于冰浴中。使用铝箔进行避光。随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，碘化丙啶（PI）为红色荧光。
实验结果：
表1 破骨细胞细胞凋亡试验结果
注：与空白组相比*p<0.05，**p<0.01
如表1中的数据可得：1mg/ml的美洲大蠊提取物，0.1mg/ml康复新分别表现出显著的促进破骨细胞凋亡的作用。抑制破骨细胞的形成,可以治疗和预防骨质疏松。
实验例3对静脉内皮细胞的作用
静脉内皮细胞体外形成血管试验主要分为两个试验，即静脉内皮细胞趋向性运动试验（Transwell Test）和小管形成试验（Tube Formation Test）。实验过程如下：
（1）静脉内皮细胞趋向性运动试验（Transwell Test）
实验材料：静脉内皮细胞；1640培养液；胎牛血清（Gibco, USA）；青霉素/链霉素原液（中国医学科学院生物医学工程研究所）；洁净工作台；二氧化碳细胞培养箱(上海博迅)；transwell板；显微镜
实验过程：
种板：用胰酶消化细胞，轻轻拍打下贴壁细胞，加入培养液终止胰酶作用，小心收集细胞于离心管中，离心（1200r/min，5min），去除上清液，用10ml培养液重悬细胞，计数。调整细胞悬液浓度，使其细胞浓度为：1×105cell/ml，向transwell板的小篮子中加入100ul细胞悬液(细胞数为：1×104cell/孔)。
加药：transwell孔内加入浓度梯度的药物，静脉内皮细胞（Endu）（实施例1制备的美洲大蠊提取物：0.1、1、5mg／mL；康复新浓度：0.1、1、5mg／mL）；以及空白组（每孔加600ul培养液）；5％C02，37℃孵育24h。
染色：小心去掉小篮子中的培养液以及孔内的药物，用PBS浸洗小篮子以及小孔，向小篮子与孔中分别加入4%多聚甲醛（小篮子100ul,孔600ul）,将小篮子浸入多聚甲醛中固定30min。去掉小篮子及孔内的多聚甲醛，用PBS清洗，向小篮子与孔中分别加入结晶紫（小篮子100ul,孔600ul）,将小篮子浸入结晶紫中染色20min。
拍照：用PBS浸洗掉结晶紫，用棉签轻轻擦拭掉小篮子里面的细胞，放入倒置显微镜内观察及拍照。
实验结果：
如图2所示，在测试的浓度范围内康复新液和美洲大蠊提取物均能显著促进静脉内皮细胞趋向性移动。即能促进静脉内皮细胞向创伤部位移动，促进创伤的修复。
（2）小管形成试验（Tube Formation Test）
实验材料：
静脉内皮细胞（Endu）；1640培养液；胎牛血清（Gibco, USA）；青霉素/链霉素原液（中国医学科学院生物医学工程研究所）；洁净工作台；二氧化碳细胞培养箱(上海博迅)；matrix；倒置荧光显微镜
实验过程：
种板：提前一天将matrix放在4℃冰箱解冻，在冰浴上向96孔板中加入50ul的matrix，每个样品做3个复孔，然后放在37℃孵箱放置30min。
加药：用不含胎牛血清的培养液配制梯度药物浓度(提取物：0.1 、1 、2mg／ mL；康复新浓度：0.1 、1 、2mg／mL)，用胰酶消化细胞，轻轻拍打下贴壁细胞，加入培养液终止胰酶作用，小心收集细胞于离心管中，离心（1200r/min，5min），去除上清液，用10ml培养液重悬细胞，计数。倒掉上清液，用含药的细胞悬液调整细胞浓度，使其细胞浓度为：5×104cell/ml，每孔加入200ul含药细胞悬液，5％CO2，37℃孵育过夜，分别在0h，18h在显微镜下观察血管形成情况，并在18h每个实验组对整个视野进行拍照。
实验结果：
如图3所示，空白组未能形成血管样结构，细胞仍呈现散乱的排列。而康复新液和美洲大蠊提取物的各试验组，都形成了明显的血管结构。即在测试的浓度范围内康复新液和提取物，及阳性对照都具有显著的促进静脉内皮细胞形成血管的作用。
实验例4 本发明所述的药物用于骨质疏松的治疗
1.患者资料
骨质疏松的主要症状为：骨痛，腰背疼痛，腿膝酸软，易发骨折，可伴有足跟痛，夜间或有排肠肌痉挛，X线表现正常或骨组织密度降低、骨皮质变薄、骨小梁减少变细或有胸腰椎体呈双凹状或前方呈楔形改变，骨密度检测T≥-2.5。
选择符合上述标准的60例骨质疏松患者，男30例、女30例，平均年龄为65岁。
2.治疗方法：
使用四川好医生攀西药业有限责任公司生产的康复新液来进行治疗，其中一天3次，每次口服10ml，治疗30天为一个疗程。
3.疗效标准
根据“郑筱萸.中药新药临床研究指导原则（试行）.北京：中国医药科技出版社.2002：357-358”来制定疗效标准：
显效：腰背痛，局部疼痛等症状基本消失，行走腰背痛消失；
有效：上述症状基本消除，行走疼痛有所减轻；
无效：上述症状无明显改善。
4.结果
经过一个疗程的治疗，发现60例患者的腰背痛，局部疼痛等症状基本消失，行走腰背痛消失，因此全部符合显效的治疗标准，并且在整个治疗期间未观察到明显的不良反应。
综上所述，本发明所述的药物具有促进成骨细胞的迁移，促进静脉内皮细胞形成血管，促进静脉内皮细胞向创伤部位移动，促进破骨细胞凋亡的作用，从而起到促进骨质疏松中骨组织的修复的作用；本发明所述的药物对骨质疏松的治疗效果明显，为临床治疗骨质疏松提供了一种新选择。

Claims (10)

1.美洲大蠊提取物在制备预防和治疗骨质疏松的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的美洲大蠊提取物具有促进成骨细胞迁移的作用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的美洲大蠊提取物具有促进静脉内皮细胞向创伤部位移动的作用。
4.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于，所述的美洲大蠊提取物具有促进静脉内皮细胞形成血管的作用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的美洲大蠊提取物具有促进破骨细胞凋亡的作用。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为康复新液。
7.根据权利要求1或6所述的应用，其特征在于，所述的药物具有促进成骨细胞迁移的作用。
8.根据权利要求1或6所述的应用，其特征在于，所述的药物具有促进静脉内皮细胞向创伤部位移动的作用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的药物具有促进静脉内皮细胞形成血管的作用。
10.根据权利要求1或6所述的应用，其特征在于，所述的药物具有促进破骨细胞凋亡的作用。
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