CN106035060B - 一种杀灭猕猴桃花粉中Psa的方法 - Google Patents

一种杀灭猕猴桃花粉中Psa的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种杀灭猕猴桃花粉中Psa的方法，使用ClO2水溶液对猕猴桃花粉进行处理，能有效杀灭花粉中Psa，但对花粉的活力影响较小，杀死猕猴桃花粉中的Psa，有效控制Psa的传播，减少溃疡病的发生，保障猕猴桃产业持续发展；本发明采用ClO2水溶液处理方法是结合液体授粉前配制花粉悬浊液进行，在花粉悬浊液中加入适量ClO2水溶液杀死Psa，操作简单，不需要复杂的设备，成本低。

Description

一种杀灭猕猴桃花粉中Psa的方法
技术领域
本发明涉及果蔬病害防治技术领域，具体涉及一种杀灭猕猴桃花粉中Psa的方法。
背景技术
近年来猕猴桃溃疡病(kiwifruit bacterial canker)的大面积爆发导致猕猴桃产量下降，严重影响产业发展。猕猴桃溃疡病是由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syingae pv.actinidiae，Psa)引起的细菌性病害。病原菌借助昆虫、风雨等自然条件，自主侵染猕猴桃植株的嫩芽、枝条的落叶痕、新生的分叉、叶片的皮孔、气孔等或营养较差的以上组织，随后扩散入果树各枝蔓造成整棵植株染病；或通过修剪伤口、冻裂伤口进行传播。
Gallelli.A等(2011)通过分子检测技术发现意大利的猕猴桃花粉中存在溃疡病病原菌；Stefani.E等(2011)也从花粉中检测到Psa的存在，认为花粉是导致猕猴桃溃疡病传播的主要原因之一，新西兰学者认为新西兰目前大规模流行的PSA-V(强致病力菌株)病原菌是由于进口国外带菌花粉而引进的。蜂蜜在Psa的传播中扮演了重要角色，它的采花蜜及授粉行为虽然有助于猕猴桃授粉坐果，但同时也将果园中存在的溃疡病病原菌一同带给了花朵，导致花粉感染Psa。花粉中存在的Psa是造成猕猴桃溃疡病远距离传播的主要原因之一。由Psa引起的猕猴桃溃疡病是一种毁灭性的细菌性病害，一旦果树发病没有有效的药剂可以医治。因此研究出杀死花粉中Psa的方法，对控制猕猴桃溃疡病的传播具有重要意义。
目前对猕猴桃溃疡病防治方法的研究主要集中在生长期枝条、叶片防治药物的筛选方面，杀死花粉中Psa的方法未见报道。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种杀灭猕猴桃花粉中Psa的方法且不影响花粉的活力。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种杀灭猕猴桃花粉中Psa的方法，使用ClO2水溶液对猕猴桃花粉进行处理。
进一步，具体包括以下处理步骤：
a)用浓度为10mg/L的ClO2溶液处理猕猴桃花粉30～60min；
b)经步骤a)处理后向花粉溶液中加入中和剂；
c)经中和剂中和后将花粉悬浊液用液体授粉技术对猕猴桃雌花进行授粉。
进一步，所述步骤a)先将猕猴桃花粉悬浮于授粉液中形成花粉悬浊液，再向花粉悬浊液中加入ClO2溶液处理花粉。
进一步，花粉悬浊液配制方法为：称取过200目筛的花粉0.5g，加入到1000ml含有1g硼砂、3g蔗糖和500μL柔水通的溶液中制成。
进一步，所述步骤b)中和剂配制方法为：将0.5g硫代硫酸钠和2mL吐温80加入100mL磷酸缓冲液中混匀制成。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明用ClO2水溶液对猕猴桃花粉进行处理，能有效杀灭花粉中Psa，但对花粉的活力影响较小。由试验证明，10mg/L的ClO2水溶液处理30-60min，对Psa的杀灭率达到98.2-100％，花粉活力比对照略有降低，坐果率下降12％，总产量下降5.6％，种子数与对照组相比无显著性差异，ClO2处理组能够有效延缓果实硬度的降低(p<0.01)，提高果实的贮藏品质；果实Vc含量与对照组相比没有显著差异。所以，本发明方法可以有效杀灭花粉中Psa，但花粉活力及猕猴桃果实的产量及贮藏品质影响较小。
本发明还具有以下优点：
首先，杀死猕猴桃花粉中的Psa，有效控制Psa的传播，减少溃疡病的发生，保障猕猴桃产业持续发展。
其次，ClO2被联合国卫生组织(WHO)列为A1级安全防腐剂，能高效地杀灭猕猴桃花粉中Psa，可以减少硫磺、甲醛、可杀得三千、噻霉酮等多种杀菌剂的应用，减少农药残留，减少“二次污染”，保障猕猴桃果品食用安全。
最后，本发明采用ClO2水溶液处理方法是结合液体授粉前配制花粉悬浊液进行，在花粉悬浊液中加入适量ClO2水溶液杀死Psa，操作简单，不需要复杂的设备，成本低。
附图说明
图1是三种药剂处理对猕猴桃坐果率的柱形图；
图2是三种药剂处理对猕猴桃总产量的影响的柱形图；
图3是三种药剂处理对贮藏期猕猴桃果单果重的影响柱形图；
图4是三种药剂处理对贮藏期猕猴桃果实种子数的影响柱形图；
图5是三种药剂处理对猕猴桃果实硬度的影响柱形图；
图6是三种药剂处理对猕猴桃果实可溶性固形物含量的影响柱形图；
图7是三种药剂处理对猕猴桃果实可滴定酸含量的影响柱形图；
图8是三种药剂处理对猕猴桃果实Vc含量的影响柱形图。
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于以下实施例。
本发明杀灭猕猴桃花粉中Psa的方法，具体包括以下处理步骤：
a)用浓度为10mg/L的ClO2溶液处理猕猴桃花粉30～60min；
b)经步骤a)处理后向花粉溶液中加入中和剂；
c)经中和剂中和后将花粉悬浊液用液体授粉技术对猕猴桃雌花进行授粉。
进一步，所述步骤a)先将猕猴桃花粉悬浮于授粉液中形成花粉悬浊液，再向花粉悬浊液中加入ClO2溶液处理花粉。花粉悬浊液配制方法为：称取过200目筛的花粉0.5g，加入到1000ml含有1g硼砂、3g蔗糖和500μL柔水通的溶液中制成。
杀灭猕猴桃花粉中Psa的方法，所述步骤b)中和剂配制方法为：将0.5g硫代硫酸钠和2mL吐温80加入100mL磷酸缓冲液中混匀制成。
以下通过具体实施例和对比例对本发明内容和效果进行说明。
实施例一
二氧化氯水溶液、噻霉酮、可杀得三千对Psa的杀菌作用
(1)Psa培养
(2)三种杀菌药剂及浓度
ClO2溶液浓度为为20mg/L、10mg/L、1mg/L；噻霉酮为500μL/L、250μL/L、100μL/L；可杀得三千溶液浓度为50mg/L、25mg/L、10mg/L。
(3)三种药剂对Psa的杀菌作用
试验组：用移液枪吸取1mL制备的菌悬液于10mL离心管中，再分别加入不同浓度的以上三种药剂4mL于离心管内，充分混匀。设置各溶液于菌悬液的作用时间梯度为15min、30min、45min、60min，作用后(ClO2处理组作用后取该样液0.5mL加入0.5mL中和剂，中和10min，最终计数时注意稀释倍数换算)吸取最终样液20μL，涂布于King’s B固体培养基中。倒置于24℃培养箱中，培养2d。
对照组：用移液枪吸取1mL制备的菌悬液于10mL离心管中，再加入4mL无菌水于离心管内，充分混匀后，吸取20μL，涂布于King’s B固体培养基中。倒置于24℃培养箱中，培养2d。
杀灭率(％)＝(对照组菌落数-试验组菌落数)/对照组菌落数×100％
处理结果如表1：使用10mg/L的ClO2溶液处理菌悬液45min、500μL/L的噻霉酮溶液处理菌悬液30min、10mg/L可杀得三千溶液处理菌悬液15min，对Psa杀灭率均达到99％以上。
表1 三种药剂作用浓度和作用时间对Psa杀灭效果的影响
实施例二
三种药剂对花粉生活力影响的研究
(1)三种药剂的浓度及处理时间
10mg/L的ClO2溶液处理45min；500μL/L的噻霉酮溶液处理30min；10mg/L可杀得三千溶液处理15min。
(2)三种药剂处理花粉
试验组：用移液枪吸取1mL花粉悬浊液于10mL离心管中，再分别加入不同浓度的以上三种药剂1mL于离心管内，充分混匀。设置作用时间梯度为15min、30min、45min，(ClO2处理组作用后取该样液0.5mL加入0.5mL中和剂，中和10min，最终计数时注意稀释倍数换算)
对照组：用移液枪吸取1ml花粉悬浊液于10ml离心管中，加1mL无菌水于离心管内，充分混匀。分别静置30min和60min。
(3)花粉活力检测
用胶头滴管吸取1滴最终样液于载玻片上，再滴1滴TTC染色剂加盖玻片，置载玻片于35℃鼓风干燥箱中15min，计数。
花粉生活力(％)＝有生活力的花粉数/花粉总数×100％
处理结果如表2：使用10mg/L的ClO2溶液处理菌悬液45min、500μL/L的噻霉酮溶液处理菌悬液30min、10mg/L可杀得三千溶液处理菌悬液15min花粉活力分别比对照降低0.5、19、21个百分点。
表2 三种药剂作用浓度和作用时间对花粉生活力的影响
实施例三
ClO2溶液处理花粉对猕猴桃产量及贮藏品质的影响
(1)浓度与处理时间
ClO2溶液浓度为10mg/L，处理时间45min，到达设定时间后，立即加入中和剂。
(2)授粉
在猕猴桃种植园内选择五年生健康无病害且树势相近的‘海沃德’猕猴桃果树4棵，采用液体授粉技术将ClO2溶液处理花粉进行授粉，盛花期解袋授粉，在花开达60％、85％、100％时各进行一次，授粉后立即再套袋。
(对照组)果树1-4号，喷授花粉溶液正常配制，配置好后静置半小时后立即利用喷雾器进行果树喷授。
(3)坐果率调查
授粉结束后一个月，统计坐果率。
(4)猕猴桃产量调查
十月中旬，待果实成熟后，分棵采收本试验所选用的8棵猕猴桃果树，每棵树的果实采收于同一框中，电子天平称量，获得每棵果树的总产量。四棵树为一个实验组，最终结果为各试验组的平均总产量。
(5)猕猴桃果形大小调查
根据每棵树的总产量和果品个数计算每棵果树的果实单果重，然后以四棵树为一个实验组，最终结果为各试验组的平均单果重。
(6)猕猴桃果实种子数量调查
每棵树的果实中，选取大、中、小三个规格的猕猴桃各三个，置于常温中使其成熟变软，然后去皮、去芯柱，将果肉包在纱布中反复揉搓后，将果渣倒入装有半杯水的烧杯中摇匀后静置10min，然后倒掉残渣，取出种子，计算种子数。
(7)果实贮藏品质调查
1)贮藏条件：采后调查统计果实的产量及果型后的果实，当天放入温度为0±0.5℃，相对湿度为85％-90％的冷库中贮藏备用；2)果实硬度测定：采用果蔬硬度计测定；3)果实可溶性固形物测定：采用折光仪测定；4)猕猴桃果实Vc含量测定：采用2,6－二氯靛酚法测定：5)猕猴桃果实可滴定酸测定：采用氢氧化钠滴定法。
处理结果如图1-8：ClO2处理组坐果率下降12％，平均产量下降5.6％，对果实的种子数没有影响；ClO2处理组均能够有效延缓果实硬度的降低(p<0.01)，提高果实的贮藏品质，而对果实Vc含量、可溶性固形物、可滴定酸无显著性影响。
实施例四
噻霉酮处理花粉对猕猴桃产量及贮藏品质的影响
(1)浓度与处理时间
向花粉悬浊液中加入噻霉酮，使之浓度达到500μL/L，加入适量花粉，上下颠倒摇匀，处理30min。
(2)授粉
在猕猴桃种植园内选择五年生健康无病害且树势相近的‘海沃德’猕猴桃果树4棵，采用液体授粉技术将噻霉酮溶液处理的花粉授粉。盛花期解袋授粉，在花开达60％、85％、100％时各进行一次，授粉后立即再套袋。
(对照组)果树1-4号，花粉悬浊液正常配制，配置好后静置半小时后立即利用喷雾器进行果树喷授。
(3)坐果率调查、(4)猕猴桃产量调查、(5)猕猴桃果形大小调查、(6)猕猴桃果实种子数量调查、(6)果实贮藏品质调查同实施例三。
处理结果如图1-8：噻霉酮处理组坐果率下降15.5％，平均产量下降8.4％，但对果实种子数的影响较大，导致果实种子数降低达35％以上；噻霉酮处理组在贮藏后期，能够有效延缓果实硬度的降低(p<0.01)，提高果实的贮藏品质；而对果实Vc含量、可溶性固形物、可滴定酸无显著性影响。
实施例五
可杀得三千处理花粉对猕猴桃产量及贮藏品质的影响
(1)浓度与处理时间
向花粉悬浊液中加入可杀得三千，使之浓度达到10mg/L，加入适量花粉，上下颠倒摇匀，处理30min。
(2)授粉
在猕猴桃种植园内选择五年生健康无病害且树势相近的‘海沃德’猕猴桃果树4棵，采用液体授粉技术将噻霉酮溶液处理的花粉授粉。盛花期解袋授粉，在花开达60％、85％、100％时各进行一次，授粉后立即再套袋
(对照组)果树1-4号，喷授花粉溶液正常配制，配置好后静置半小时后立即利用喷雾器进行果树喷授。
(3)坐果率调查、(4)猕猴桃产量调查、(5)猕猴桃果形大小调查、(6)猕猴桃果实种子数量调查、(6)果实贮藏品质调查同实施例三。
处理结果如图1-8：可杀得三千处理组坐果率下降19.5％，总产量下降11.2％，对果实种子数的影响较大，导致果实种子数降低达35％以上；可杀得三千处理组的果实在贮藏期内硬度均小于对照组，不利于果实的长期贮藏保鲜，可杀得三千处理组Vc含量极显著低于对照(p<0.01)，且下降趋势最快，表明可杀得三千处理不利于贮藏期内果实Vc含量的维持。
将实施例四和实施例六五处理组的测试结果分别与实施例三中处理组的测试结果进行对比，可以知道，相对实施例三，实施例四中的处理能够有效延缓果实硬度的降低(p<0.01)，提高果实的贮藏品质，果实Vc含量、可溶性固形物、可滴定酸无显著性影响，但处理组坐果率下降15.5％，平均产量下降8.4％，尤其对果实种子数的影响较大，导致果实种子数降低达35％以上，综合考虑猕猴桃产量及贮藏品质不如实施例三；实施例五中处理组坐果率下降19.5％，总产量下降11.2％，对果实种子数的影响较大，导致果实种子数降低达35％以上，果实在贮藏期内硬度均小于对照组，不利于果实的长期贮藏保鲜，处理组Vc含量极显著低于对照(p<0.01)，且下降趋势最快，不利于贮藏期内果实Vc含量的维持，总之实施例五对猕猴桃产量及贮藏品质影响最大。
结论：杀死猕猴桃花粉中的Psa的有效方法是：ClO2溶液浓度为10mg/L，处理时间45min，到达设定时间后，立即加入中和剂，用液体授粉技术对猕猴桃雌花进行授粉；在此条件下本发明的杀死猕猴桃花粉中的Psa，可以有效杀死猕猴桃花粉中的Psa，花粉活力只下降了0.5个百分点；对果实的种子数没有影响；并能够有效延缓果实硬度的降低(p<0.01)，提高果实的贮藏品质，而对果实Vc含量、可溶性固形物、可滴定酸无显著性影响。
实施例六
(1)浓度与处理时间
ClO2溶液浓度为10mg/L，处理时间30min，到达设定时间后，立即加入中和剂。
(2)授粉
在猕猴桃种植园内选择五年生健康无病害且树势相近的‘海沃德’猕猴桃果树4棵，采用液体授粉技术将ClO2溶液处理花粉进行授粉，盛花期解袋授粉，在花开达60％、85％、100％时各进行一次，授粉后立即再套袋。
实施例七
(1)浓度与处理时间
ClO2溶液浓度为10mg/L，处理时间60min，到达设定时间后，立即加入中和剂。
(2)授粉
在猕猴桃种植园内选择五年生健康无病害且树势相近的‘海沃德’猕猴桃果树4棵，采用液体授粉技术将ClO2溶液处理花粉进行授粉，盛花期解袋授粉，在花开达60％、85％、100％时各进行一次，授粉后立即再套袋。

Claims (1)

1.一种杀灭猕猴桃花粉中Psa的方法，其特征在于，具体包括以下处理步骤：
a)用浓度为10mg/L的ClO2溶液处理猕猴桃花粉30～60min；
b)经步骤a)处理后向花粉溶液中加入中和剂；
c)经中和剂中和后将花粉悬浊液用液体授粉技术对猕猴桃雌花进行授粉；
所述步骤a)先将猕猴桃花粉悬浮于授粉液中形成花粉悬浊液，再向花粉悬浊液中加入ClO2溶液处理花粉；花粉悬浊液配制方法为：称取过200目筛的花粉0.5g，加入到1000ml含有1g硼砂、3g蔗糖和500μL柔水通的溶液中制成；
所述步骤b)中和剂配制方法为：将0.5g硫代硫酸钠和2mL吐温80加入100mL磷酸缓冲液中混匀制成。
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