CN105998316B - 一种治疗老年性痴呆的中药组合物及其具体制备方法和相关应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗老年性痴呆的中药组合物及其具体制备方法和相关应用。本发明的一种用于治疗阿尔茨海默病的中药组合物,由以下重量份的各原料药组成:白术8‑18份,龙眼肉10‑20份,阿胶3‑13份,鱼鳔15‑25份,败酱草3‑13份,地锦草5‑20份,地肤子5‑20份,夏枯草5‑20份,莲米5‑20份,皂刺3‑13份,白蒺藜3‑15份以及威灵仙3‑13份。本发明的中药组合物具有益气养血、补血补肾、清热利湿、补脾消毒、祛风通络等功效。同时,本发明通过研究该中药组合物对阿尔茨海默病动物模型的综合治疗效果,证明该中药组合物对阿尔茨海默病治疗有效并且无副作用,因此本发明的提出为阿尔茨海默病的治疗提供了一种新的有效技术手段,在阿尔茨海默病的治疗领域将具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药组合物及其制备方法和应用,特别涉及一种用于治疗阿尔茨海默病的中药组合物及其制备方法和应用,本发明属于中药技术领域。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD),又叫老年性痴呆,是一种老年性、退行性、进行性的中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)常见疾病之一(Gontier G,George C,Chaker Z,et al.Blocking IGF Signaling in Adult Neurons AlleviatesAlzheimer's Disease Pathology through Amyloid-βClearance[J].J Neurosci,2015,35(33):11500-11513.)。AD主要表现为患者学习能力、记忆能力、分析能力、推理能力及其判断能力减退,还可以伴有精神障碍及其意识模糊等等。AD影响患者的生活质量,甚至威胁患者的生命安全,AD对家庭、社会和国家都带来了极大的挑战性。目前,AD已经成为心脑血管疾病、肿瘤、脑中风之后,死亡率排在第四位的重要疾病。随着全球人口老龄化的必然趋势,AD理所当然成为国家和社会常见的老年性、神经性、退行性疾病之一。AD几乎分布于世界的各个角落,在发展中国家和较不富裕发达国家内,AD的发病率和死亡率也在迅速地增加。我们国家人口较多,老龄人口也较多,因此探寻AD的发病机制和防治AD的新药组方就显得尤为重要。
AD病理特征包括很多,例如AD脑组织出现老年斑(Senile plaques,SP)沉积,SP核心主要是β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)、小胶质细胞(Microglia,MG)、星形胶质细胞(Astrocytes,As)和变性的轴索等;神经元信息传递部位突触出现损伤或者数量减少;MG、As产生介导炎症反应的炎症介质;神经元内部神经原纤维不规则排列形成神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFTs);海马锥体细胞出现桃红色平野小体;脑组织神经元数量减少,颗粒空泡变性(Granulo vacuolar degeneration,GVD)(Latta CH,Sudduth TL,Weekman EM,et al.Determining the role of IL-4 induced neuroinflammation inmicroglial activity and amyloid-βusing BV2 microglial cells and APP/PS1transgenic mice[J].J Neuroin flammation,2015,4(12):41.;Tang Z,Ioja E,BereczkiE,et al.mTor mediates tau localization and secretion:Implication forAlzheimer's disease[J].Biochim Biophys Acta,2015,1853(7):1646-1657.;Agosta F,Dalla Libera D,Spinelli EG,et al.Myeloid microvesicles in cerebrospinal fluidare associated with myelin damage and neuronal loss in mild cognitiveimpairment and Alzheimer disease[J].Ann Neurol,2014,76(6):813-825.)等等。
AD发病机制还不清楚,研究者们提出多种关于AD的学说或者假说,例如Aβ蛋白学说、炎症介质学说、神经血管假说、自由基损伤学说等等。Aβ蛋白学说是AD发病机制中最重要的学说之一。在正常的情况下,脑组织Aβ是β-淀粉样蛋白前体蛋白(Amyloid-βprecursorprotein,APP)通过β、γ-分泌酶水解产生的一种多肽,Aβ主要包括Aβ1-40和Aβ1-42。Aβ1-42是脑组织内Aβ沉淀物形成的最关键组成部分,Aβ1-42参与构成SP的核心成分(Yang H,Yang H,Xie Z,et al.Self-assembling nanofibers alter the processing of amyloidprecursorprotein ina transgenic mouse model of Alzheimer's disease[J].NeurolRes,2015,37(1):84-91.)。Aβ1-42对神经元产生神经毒性,Aβ1-42还可以形成可溶性、扩散性Aβ寡聚体(Amyloid beta-derived diffusible ligands,ADDLs),脑组织ADDLs(Liu X,TengZ,Cui C,et al.Amyloid beta-derived diffusible ligands(ADDLs)induce abnormalexpression of insulin receptors in rat hippocampal neurons[J].J Mol Neurosci,2014,52(1):124-130.)具有更大的神经毒性,Aβ1-42和ADDLs均可以引起脑组织神经元损伤,造成神经元数量减少,尤其是海马神经元侵犯最为严重,Aβ1-42和ADDLs还可以降低AD动物模型的学习记忆水平。研究表明,AD模型小鼠学习记忆能力下降(Li T,Yu Y,CaiH.Effects of brain-derived neurotrophic factor-pretreated neuron stem celltransplantation on Alzheimer's diseasemodel mice[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(11):21947-21955.),基于这些,评价AD的治疗效果需要检测脑组织海马APP、Aβ1-42、Aβ1-40和血清Aβ1-40水平,并观察脑组织海马的超微结构。
炎症介质学说与Aβ蛋白学说密切相关,AD中脑组织Aβ少量增加时,脑组织MG可以吞噬少量Aβ,而当脑组织Aβ大量增加时,Aβ就会激活脑组织MG及As的分泌功能,脑组织Aβ促进MG及As产生大量炎症介质,例如肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)等等(Gao J,He H,Jiang W,et al.Salidroside ameliorates cognitive impairment in a d-galactose-induced rat model of Alzheimer's disease[J].Behav Brain Res,2015,15(293):27-33.;Zhao L,Zhao Q,Zhou Y,et al.Atorvastatin May Correct Dyslipidemia in AdultPatients at Risk for Alzheimer's Disease Through an Anti-Inflammatory Pathway[J].CNS Neurol Disord Drug Targets,2016,15(1):80-85.)。另外,AD伴有脑组织抗氧化水平的低下、自由基产生增加、氧化产物积聚等等(Wang C,He L,Yan M,et al.Effects ofpolyprenols from pine needles of Pinus massoniana on ameliorating cognitiveimpairment in a D-galactose induced mouse model[J].Age(Dordr),2014,36(4):9676.),例如AD可以表现为总抗氧化能力(Total antioxidative capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(Super oxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathioneperoxidase,GSH-PX)含量降低及氧化产物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量增加,基于这些,评价AD治疗效果需要检测脑组织海马IL-1β、TNF-α、IL-6、T-AOC、SOD、GSH-PX和MDA水平。
神经血管假说与Aβ蛋白学说也是密切相关的,血脑屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)通透性的改变可以影响Aβ的清除和转运(Zlokovic BV.Neuro vascular pathways toneurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders[J].Nat RevNeurosci,2011,12(12):723-738.),改善脑组织BBB通透性有助于AD的治疗(Makani V,Jang YG,Christopher K,et al.BBB-Permeable,Neuroprotective,and Neuro trophicPolysaccharide,Midi-GAGR[J].PLoS One,2016,11(3):e0149715.)。Aβ降解与脑组织对Aβ转运密切相关,晚期糖基化终末产物受体(Receptor for advanced glycation end-products,RAGE)可以表达于脑组织神经元、MG、血管内皮细胞等,脑组织RAGE可与配体Aβ结合,促进NF-κB通路活化,加速Aβ进入脑组织;脑组织Aβ可以和载脂蛋白J(ApolipoproteinJ,Apo J)、载脂蛋白E(Apolipoprotein E,Apo E)等多种蛋白结合,Aβ的这种结合可以被低密度脂蛋白相关蛋白1(Lipoprotein receptor-related protein1,LRP1)识别,从而介导Aβ转出脑组织(Kim DK,Park JD,Choi BS.Mercury-induced amyloid-beta(Aβ)accumulation in the brain is mediated by disruption of Aβtransport[J].JToxicol Sci,2014,39(4):625-635.;Wan W,Chen H,Li Y.The potential mechanisms ofAβ-receptor for advanced glycation end-products interaction disrupting tightjunctions of the blood-brain barrier in Alzheimer's disease[J].Int JNeurosci,2014,124(2):75-81.)。研究表明,脑组织RAGE通过NF-κB信号通路介导机体的脑组织神经性、无菌性炎症反应,引起TNF-α和IL-1β等炎症介质含量增加(Wang SY,Liu JP,Ji WW,et al.Qifu-Yin attenuates AGEs induced Alzheimer-likepathophysiological changes through the RAGE/NF-κB pathway[J].Chin J Nat Med,2014,12(12):920-928.),脑组织RAGE/NF-κB通路还介导D-半乳糖诱导的脑组织记忆障碍和神经变性(Ali T,Badshah H,Kim TH,et al.Melatonin attenuates D-galactose-induced memory impairment,neuroinflammation and neurodegeneration via RAGE/NF-κB/JNK signaling pathway in aging mouse model[J].J Pineal Res,2015,58(1):71-85.),另外AD伴有脑组织线粒体细胞凋亡途径相关的Bcl-2和Bax表达异常,引起脑组织Bcl-2/Bax比值改变,促进脑组织神经元细胞凋亡(Cai C,Dai X,Zhu Y,et al.A specificRAGE-binding peptide biopanning from phage display random peptide librarythat ameliorates symptoms in amyloidβpeptide-mediated neuronal disorder[J].Appl Microbiol Biotechnol,2016,100(2):825-35.)。基于这些,评价AD治疗效果需要检测脑组织BBB通透性,脑组织海马RAGE、NF-κBp65、LRP1、Apo J、Apo E、Bcl-2和Bax等表达水平。
随着科学技术的迅速发展,临床上出现了许多治疗AD的药物,但是并没有特别有效的药物,很多药物都是改善AD学习记忆能力(Learning and memory),例如乙酰胆碱酯酶(Acetylcholin esterase,AChE)抑制剂、抗神经元细胞凋亡(Apoptosis)药物、抗氧化剂、抗精神病药物、雌激素、神经营养因子(Neurotrophic Factor)、神经干细胞(Neural stemcells)和抗Aβ药物等等。虽然这些药物的治疗效果较好,但是这些药物具有一定的不良反应,对机体身心健康造成一定的影响,因此探寻不良反应小并且有效的药物十分重要。祖国中医药的明显优势是中医药成分较多、成分之间存在协同作用、不良反应较小,同时还具有整体调节等等,因此,祖国中医药的中药组合物(Chinese medicinal composition)在AD治疗中就具有独特优势。基于此,寻找中医药新组方且有效的中药组合物开展AD的治疗就显得尤为重要。
发明内容
针对现有问题,本发明所要解决的技术问题是提供一种能够用于治疗AD的中药组合物及其制备方法,该中药组合物具有益气养血、补血补肾、清热利湿、补脾消毒、祛风通络等功效,并且无副作用。
为了达到上述目的,本发明所采用的技术手段为:
本发明中药组合物包括十二种药材,分别是中药材白术、龙眼肉、阿胶、鱼鳔、败酱草、地锦草、地肤子、夏枯草、莲米、皂刺、白蒺藜和威灵仙。其中白术(Atractylodes),性温,味苦、甘,归脾经、胃经,具有益气健脾、燥湿利水等功效;龙眼肉(Longan),性温,味甜,具有补益心脾、养血安神等功效;阿胶(Gelatin),味微甘,具有补血滋阴、润燥止血等功效;鱼鳔(Maw),性平,味甘,归肾经,具有补肾益精、滋养筋脉、散瘀消肿等功效;败酱草(Patrina),性凉,味辛、苦,具有清热解毒、祛瘀排脓等功效;地锦草(Humifusa),性平,味辛,归肺经、肝经、胃经、大肠经、膀胱经,具有清热解毒、利湿退黄、活血止血等功效;地肤子(Fructus),性寒,味辛、苦,归肾经、膀胱经,具有清热利湿、祛风止痒等功效;夏枯草(Prunella),性寒,味辛、苦,归肝经、胆经,具有清热泻火、明目散结、消肿等功效;莲米(Lotus seeds),性平,味甘、涩,归脾经、肾经、心经,具有补脾止泻、补肾涩精、养心安神等功效;皂刺(Soap thorn),性温,味辛,归肝经、肺经,具有消毒、透脓等功效;白蒺藜(Tribulus terrestris),性平,味苦、辛,入肝经,具有祛风明目、平肝解郁等功效;威灵仙(Clematis),性温,味辛、咸,归膀胱经、肝经,具有祛风除湿、通络止痛等功效。本发明中药组合物具有益气养血、补血补肾、清热利湿、补脾消毒、祛风通络等基本功效,说明中药组合物可以补气、补脾、补肾、补血、活血,促进气旺血行,还可以散结清热、通络养阴,尤其是针对AD的本虚标实、气虚血瘀,就会有较好的治疗效果。
基于以上的综合分析,本发明选择中药材白术、龙眼肉、阿胶、鱼鳔、败酱草、地锦草、地肤子、夏枯草、莲米、皂刺、白蒺藜和威灵仙,共十二种药材组成中药组合物。具体的,本发明的一种用于治疗AD的中药组合物,由以下重量份的各原料药组成:白术8-18份,龙眼肉10-20份,阿胶3-13份,鱼鳔15-25份,败酱草3-13份,地锦草5-20份,地肤子5-20份,夏枯草5-20份,莲米5-20份,皂刺3-13份,白蒺藜3-15份以及威灵仙3-13份。
在本发明中,优选的,所述的中药组合物由以下重量份的各原料药组成:白术13份,龙眼肉15份,阿胶8份,鱼鳔20份,败酱草8份,地锦草12份,地肤子12份,夏枯草12份,莲米12份,皂刺8份,白蒺藜9份以及威灵仙8份。
一种临床上适宜的用于防治AD的中药制剂,其由本发明所述的中药组合物加入制剂成型所需的辅料,按照制备药物制剂的常规方法制成。
其中,优选的,所述的制剂为水煎剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、片剂或口服液。
进一步的,本发明还提出了一种制备所述的中药组合物的方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)按照本发明所述的重量份称取各原料药,将各原料药混合均匀后放入高颈圆底烧瓶中,加入药物重量8-15倍的蒸馏水,浸泡1-2h后,煎煮1-2h,冷却;
(2)将步骤(1)冷却后的药液用纱布过滤,得到第一次滤液;
(3)步骤(2)剩余的药物残渣放入高颈圆底烧瓶中,重复步骤(1)和(2)得到第二次滤液,合并二次滤液;
(4)干燥,得到所述中药组合物的干膏。
其中,优选的,还包括将得到的干膏放在粉碎机内粉碎,研磨,分子筛处理,得到所述中药组合物的干粉。
为了说明本发明中药组合物的使用效果,本发明使用免疫组织化学方法和Real-time-PCR方法测定了与AD密切相关的脑组织海马RAGE、NF-κBp65、LRP1、Apo J和Apo E蛋白的表达量,以此评价中药组合物防治AD的效果及其相关分子作用机制。实验结果表明,模型组AD小鼠脑组织海马LRP1、Apo J和Apo E蛋白平均光密度值和mRNA的相对表达量降低,预示模型组AD小鼠脑组织海马LRP1、Apo J和Apo E蛋白和基因表达减少,说明模型组AD小鼠脑组织海马可以与Aβ结合的蛋白质减少,降低了Aβ转出脑组织,Aβ沉积于脑组织,同时脑组织海马RAGE、NF-κBp65蛋白平均光密度值和mRNA的相对表达量增加,预示模型组AD小鼠脑组织海马RAGE、NF-κBp65蛋白和基因表达上调,利于Aβ从血清中进入脑组织,增加脑组织Aβ与神经元RAGE的结合,激活多种通路加重脑组织神经元的损伤,以此促进AD的发展。经过中药组合物治疗后,中药组合物高、中剂量可以增加AD小鼠LRP1、Apo J和Apo E平均光密度值和mRNA的相对表达量,预示中药组合物高、中剂量增加小鼠脑组织海马LRP1、Apo J和Apo E蛋白和基因表达,减少脑组织Aβ的积聚,同时中药组合物高、中剂量可以使小鼠脑组织海马RAGE、NF-κBp65蛋白平均光密度值和mRNA相对表达量减少,预示中药组合物高、中剂量可以使小鼠脑组织海马RAGE、NF-κBp65蛋白和基因表达下调,减少脑组织Aβ与神经元RAGE的结合,减弱多种通路的活化,减轻脑组织神经元的损伤,以此治疗AD。但是中药组合物低剂量对AD小鼠脑组织海马RAGE、NF-κBp65、LRP1、Apo J和Apo E蛋白和mRNA相对表达量的改变不明显,预示中药组合物低剂量对AD小鼠脑组织海马RAGE、NF-κBp65、LRP1、Apo J和Apo E表达的影响不明显。本实验免疫组织化学方法和Real-time-PCR方法测得的脑组织海马RAGE、NF-κBp65、LRP1、Apo J和Apo E蛋白和基因表达实验结果的变化趋势与AD小鼠学习记忆能力,海马超微结构,海马APP、Aβ1-42、Aβ1-40和血清Aβ1-40水平,海马炎症介质IL-1β、TNF-α和IL-6水平,海马Bcl-2、Bax水平、海马T-AOC、SOD、GSH-PX和MDA水平,脑组织BBB通透性等等变化趋势有关,这提示脑组织海马RAGE、NF-κBp65、LRP1、Apo J和Apo E是防治AD的靶点蛋白。本实验预示中药组合物通过下调海马RAGE、NF-κBp65表达且上调海马LRP1、Apo J、ApoE表达,以此改善AD小鼠学习记忆能力,海马超微结构,海马APP、Aβ1-42、Aβ1-40和血清Aβ1-40水平,海马炎症介质IL-1β、TNF-α和IL-6水平,海马Bcl-2、Bax水平、海马T-AOC、SOD、GSH-PX和MDA水平及其BBB通透性等等。
AD伴有机体免疫功能的低下及其脑组织的萎缩。免疫器官脾产生B细胞和巨噬细胞等等,其中B细胞可转化成浆细胞后分泌大量抗体,抗体参与体液免疫;免疫器官胸腺可以产生T细胞和胸腺素等等,其中T细胞参与细胞免疫。另外AD还伴有脑组织神经元数量减少,脑组织相对质量减轻,进而出现脑组织萎缩。因此本发明测定了小鼠的脾、胸腺和脑指数,以此评价中药组合物对AD小鼠免疫功能和脑萎缩程度的影响。实验结果表明,模型组小鼠脾、胸腺和脑指数降低,预示模型组脾和胸腺相对质量降低,参与体液免疫的浆细胞(B细胞转化)和参与细胞免疫的T细胞减少,进而预示模型组小鼠免疫力降低;同时脑组织相对质量降低,预示模型组AD小鼠脑萎缩,脑组织的基本功能可能退化。经过中药组合物治疗后,中药组合物高、中剂量改善小鼠的脾、胸腺和脑指数,预示中药组合物高、中剂量脾和胸腺相对质量增加,参与体液免疫的浆细胞(B细胞转化)和参与细胞免疫的T细胞增加,中药组合物高、中剂量可以使小鼠免疫功能增强;同时中药组合物高、中剂量小鼠脑组织相对质量增加,说明脑萎缩程度得到改善,提示脑组织的基本功能可能部分恢复。但是中药组合物低剂量对小鼠的脾、胸腺和脑指数的影响不明显,预示中药组合物低剂量对小鼠的免疫功能和脑萎缩程度改善效果较差。以上显示中药组合物高、中剂量可以增强AD小鼠的免疫功能并改善AD小鼠脑组织萎缩的程度。
为了初步评价中药组合物高、中、低剂量对小鼠的副作用,本发明还使用电子天平测定了小鼠的心、肺、肝、肾指数和小鼠的体重变化。实验结果表明,与对照组比较,模型组小鼠心、肺、肝、肾指数和体重改变不明显,预示对照组和模型组小鼠的重要器官指数和体重变化不明显。经过中药组合物治疗后,与模型组比较,中药组合物高、中、低剂量组小鼠的心、肺、肝、肾指数和体重改变也不明显,提示中药组合物高、中、低剂量治疗AD不会改变小鼠的心、肺、肝、肾指数和体重,预示中药组合物高、中、低剂量组小鼠的重要器官指数和体重变化不明显,说明中药组合物高、中、低剂量对小鼠无副作用。
综上所述,本发明提出了一种能够有效治疗AD的中药组合物,实验证明该中药组合物对AD治疗有效并且无副作用。本发明的提出为进一步研发治疗AD的中药新药提供了客观依据。
附图说明
图1为中药组合物对AD小鼠潜伏期的影响;
图2为中药组合物对AD小鼠游泳距离的影响;
图3为中药组合物对AD小鼠目标象限停留时间和跨平台次数的影响;
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05;
图4为中药组合物对AD小鼠脑组织海马CAI区神经元超微结构的影响(TEM,×2550)的影响;
图5为中药组合物对AD小鼠海马CA1区神经元细胞质超微结构影响(TEM,×16500);
图6为中药组合物对AD小鼠脑组织海马APP、Aβ1-42、Aβ1-40和血清Aβ1-40的影响;
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05;
图7为中药组合物对AD小鼠脑组织海马IL-1β、TNF-α和IL-6含量的影响;
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05;
图8为中药组合物对AD小鼠脑组织海马Bcl-2/Bax比值的影响;
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05;
图9为中药组合物对AD小鼠脑组织海马T-AOC含量的影响;
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05;
图10为中药组合物对AD小鼠脑组织海马SOD含量的影响;
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05;
图11为中药组合物对AD小鼠脑组织海马GSH-PX含量的影响;
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05;
图12为中药组合物对AD小鼠脑组织海马MDA含量的影响;
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05;
图13为中药组合物对AD小鼠脑组织BBB通透性的影响;
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05;
图14为中药组合物对海马RAGE、NF-κBp65、LRP1、Apo J和Apo E蛋白表达影响;
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05;
图15为中药组合物对海马RAGE、NF-κBp65、LRP1、Apo J和Apo E mRNA影响;
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05;
图16为中药组合物对AD小鼠脾、胸腺和脑指数的影响;
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05;
图17为中药组合物对AD小鼠心、肺、肝和肾指数的影响;
注:与对照组比较,*P>0.05;与模型组比较,#P>0.05;
图18为中药组合物对AD小鼠体重的影响。
注:与对照组比较,*P>0.05;与模型组比较,#P>0.05。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1一种用于防治AD的中药组合物的制备
由以下重量的各原料药组成:白术13g,龙眼肉15g,阿胶8g,鱼鳔20g,败酱草8g,地锦草12g,地肤子12g,夏枯草12g,莲米12g,皂刺8g,白蒺藜9g以及威灵仙8g。
实施例2一种用于防治AD的中药组合物的制备
由以下重量的各原料药组成:白术10g,龙眼肉15g,阿胶8g,鱼鳔22g,败酱草10g,地锦草12g,地肤子15g,夏枯草12g,莲米13g,皂刺10g,白蒺藜10g以及威灵仙9g。
实施例3一种用于防治AD的中药组合物的制备
由以下重量的各原料药组成:白术8g,龙眼肉10g,阿胶3g,鱼鳔15g,败酱草7g,地锦草10g,地肤子10g,夏枯草12g,莲米10g,皂刺10g,白蒺藜10g以及威灵仙10g。
实施例4一种用于防治AD的中药组合物的制备
由以下重量的各原料药组成:白术12g,龙眼肉15g,阿胶10g,鱼鳔18g,败酱草10g,地锦草10g,地肤子12g,夏枯草10g,莲米10g,皂刺7g,白蒺藜8g以及威灵仙8g
实施例5一种用于防治AD的中药组合物的制备
由以下重量的各原料药组成:白术15g,龙眼肉20g,阿胶10g,鱼鳔25g,败酱草12g,地锦草12g,地肤子14g,夏枯草12g,莲米12g,皂刺8g,白蒺藜12g以及威灵仙9g。
实施例6一种用于防治AD的中药组合物(干膏)的制备
(1)分别称取原药材白术13g、龙眼肉15g、阿胶8g、鱼鳔20g、败酱草8g、地锦草12g、地肤子12g、夏枯草12g、莲米12g、皂刺8g、白蒺藜9g和威灵仙8g,每份中药组合物的原药材重量137g。
(2)配制4倍中药组合物的原药材,即548g中药组合物,将548g中药组合物放入20000ml高颈圆底烧瓶中,加入蒸馏水7000ml,将中药组合物浸泡2h,煎煮中药组合物2h,10层白色纱布过滤后得到第一次中药组合物滤液;
(2)中药组合物残渣放到20000ml高颈圆底烧瓶中,加入蒸馏水7000ml,浸泡中药组合物残渣2h,煎煮中药组合物2h,10层白色纱布过滤后得到第二次中药组合物残渣滤液;
(3)合并第一次中药组合物滤液和第二次中药组合物残渣滤液,干燥箱70℃干燥5d后,得到中药组合物的干膏148.75g。
中药组合物出膏率=(干膏/中药组合物)×100%,经过计算得到(148.75/548)×100%=27.14%,显示该中药组合物出膏率为27.14%。
实施例7一种用于防治AD的中药组合物(干粉)的制备
使用粉碎机将实施例6制备得到的中药组合物干膏粉碎,研磨,分子筛处理,得到中药组合物干粉145.36g,中药组合物出粉率=(干粉/中药组合物)×100%,经过计算得到(145.36/548)×100%=26.53%,显示该中药组合物出粉率为26.53%。
实验配制中药组合物原药材重量为548g,最终得到中药组合物干粉145.36g,经过计算可以知道,1g中药组合物干粉相当于中药组合物原药材3.77g;分装中药组合物干粉,20g/袋,-80℃冰箱内保存用于以下研究。
实施例8本发明的中药组合物在治疗AD中的应用
1材料
1.1实验动物
7月龄清洁级雄性C57BL/6小鼠,体重(22±2)g,购买于北京维通利华实验动物技术有限公司,动物合格证:SCXK(京)2012-0001。C57BL/6小鼠由黑龙江中医药大学实验动物中心李宝龙副主任、博士后负责日常管理和处理。
1.2主要仪器设备
Morris水迷宫(安徽淮北正华生物仪器设备有限公司),6100型RT-雷杜酶标仪(美国RT公司),脑立体定位SN-2(日本仪器公司),组织脱水机和展片机(德国Leica公司),TECNAI G2型透射电子显微镜(FEI/Philips公司),101-0AB型电热恒温鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司),HMIAS高清晰度彩色医学图文分析系统(武汉千屏影像技术有限公司),SIMF124制冰机、-80℃冰箱(日本SANYO),PLZOZ-S电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司),TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)等等。
2方法
2.1复制AD小鼠模型
抓取健康7月龄C57BL/6小鼠,10%水合氯醛麻醉小鼠,小鼠头部固定于脑立体定位仪器SN-2(日本仪器公司),剪去毛发,消毒,剪开皮肤,暴露颅骨,无菌微量加样器于小鼠双侧脑室一次性注入5μl凝聚态Aβ1-42(80pmol/μl),留下针头2min,封闭颅骨孔,滴庆大霉素消毒,包扎小鼠,消毒,肌肉注射青霉素10万/d,小鼠单笼饲养,避免小鼠感染和相互撕咬。小鼠苏醒后,第2d开始,每d小鼠腹腔注射D-半乳糖(180mg/kg)和灌胃给予三氯化铝(AICI3)17mg/kg,持续42d。以此Aβ1-42、D-半乳糖、AICI3三个因素综合处理C57BL/6小鼠,复制AD模型小鼠。同时对照组C57BL/6小鼠双侧脑室、腹腔注射和灌胃等量的生理盐水。
2.2药物剂量的设定
2.2.1中药组合物剂量的设定
中药组合物包括白术13g、龙眼肉15g、阿胶8g、鱼鳔20g、败酱草8g、地锦草12g、地肤子12g、夏枯草12g、莲米12g、皂刺8g、白蒺藜9g和威灵仙8g,每份中药组合物137g/成人标准体重。经过评定后,137g/成人标准体重是该中药组合物临床患者安全有效剂量。另外,依据小鼠和人的体表面积比值0.0026:1,求得标准体重小鼠的中药组合物剂量是[(137g×0.0026)/20g小鼠]×50,即(17.81g/kg小鼠)。17.81g/kg为中药组合物中剂量,中药组合物高剂量是中药组合物中剂量的两倍,而中药组合物低剂量是中药组合物中剂量的二分之一。因此本实验设定了中药组合物的高、中、低剂量分别是35.62g/kg、17.81g/kg、8.91g/kg。
2.2.2阳性药物剂量的设定
临床上AD患者使用多奈哌齐安全有效剂量是(5-10)mg,依据小鼠和人的体表面积比值为0.0026:1,得到小鼠给予多奈哌齐进行治疗的多奈哌齐安全有效剂量是(5×0.0026×50-10×0.0026×50)mg/kg,即(0.65-1.3)mg/kg,换算成分子是单位g,即(0.00065-0.0013)g/kg,经过黑龙江中医药大学附属第一医院内分泌科栗明副主任医师、博士后评定,本实验选择0.001g/kg多奈哌齐治疗AD模型小鼠。
2.3实验动物分组及其给药
实验选择Aβ1-42、D-半乳糖和AICI3制备AD模型小鼠,确定40只AD模型小鼠,将AD模型小鼠随机分成模型组,治疗组,中药组合物高、中、低剂量组(分别简称高、中、低剂量组),每组8只。另设定同月龄、同背景、健康C57BL/6小鼠8只为对照组。对照组、模型组小鼠分别给予生理盐水灌胃,治疗组给予多奈哌齐0.001g/kg灌胃,按照1g中药组合物干粉相当于中药组合物原药材3.77g计算,中药组合物高、中、低剂量组分别给予相当于中药组合物原药材35.62g/kg、17.81g/kg、8.91g/kg的中药组合物干粉(实施例7制备)灌胃,灌胃时将干粉溶解于与对照组、模型组等量的生理盐水中,灌胃持续42d。
2.4定位航行能力实验
定位航行能力实验用于检测小鼠学习能力,采用Morris水迷宫(MWM)仪器进行测定定位航行能力。MWM主要结构包括圆形水池、水下平台、电脑、摄像机和数据分析软件系统。实验设定实验室内的基本条件包括水温(23±2)℃,水深20cm,水下平台放于第IV象限,室内外参照物一致,无外界噪音干扰,水池内放上奶粉及白色素,每次MWM测试后需用吹干机吹干小鼠,避免小鼠生病,MWM水池边缘标记四个象限如第I象限、第II象限、第III象限、第IV象限,实验者不要说话等等。MWM实验设定的时间是5d,其中第1-4d为小鼠的训练时间,第5d为小鼠的测试时间。每次小鼠训练时间为60s,若小鼠60s内未找到第IV象限水下平台,则将小鼠引至第IV象限水下平台停留15s,此时小鼠潜伏期为60s。第5d开始测试小鼠的学习能力,记录小鼠到达第IV象限水下平台位置的潜伏期,以此评价小鼠学习能力。
2.5空间探索能力实验
空间探索能力实验用于检测各组小鼠记忆能力,MWM实验过程及其注意事项同上(2.4),在测试第5d时候撤去第IV象限水下平台,测试在60s内小鼠找到第IV象限水下平台的游泳距离,以此来评价小鼠记忆能力。
2.6跨越平台试验
跨越平台实验用于检测小鼠学习记忆保持能力,MWM实验过程及注意事项同上(2.4),在测试第5d时撤去第IV象限水下平台,测试在60s内小鼠跨越平台所在位置次数(跨平台次数)及其小鼠在原第IV象限移动平台所在象限的游泳时间(目标象限停留时间),以此来评价小鼠学习记忆保持能力。
2.7透射电子显微镜(TEM)观察海马CA1区结构
MWM实验结束后,小鼠水合氯醛(10%)腹腔注射麻醉后,固定小鼠四肢和头部,剪开胸腔,暴露心脏,输液器针头直接刺入小鼠左心室心尖搏动最明显的地方,剪开右心耳,缓慢匀速点滴生理盐水90ml,小鼠肝脏逐渐变白为止,且右心耳流出白色清亮液体,使用2.5%戊二醛溶液缓慢匀速灌注约80ml,直到各组小鼠四肢及其尾巴僵硬为止,确定小鼠心脏灌注成功。将小鼠放到超净工作台上,取材各组小鼠脑组织,寻找海马,将小鼠脑组织海马CA1区切成1-3mm3小块,2.5%戊二醛固定小鼠脑组织海马CA1区、四氧化锇固定、脱水、包埋、CM1900冰冻切片机切片、染色,TECNAI G2型TEM(FEI/Philips公司)观察各组小鼠脑组织海马CA1区的超微结构,以此评价中药组合物对AD小鼠脑组织海马超微结构的影响。
2.8酶联免疫吸附法(ELISA)测定AD小鼠脑组织海马APP、Aβ1-42、Aβ1-40、IL-1β、TNF-α、IL-6、Bcl-2、Bax和血清Aβ1-40水平
MWM实验结束后,抓取各组小鼠,眼科镊子快速摘除小鼠眼球,获得小鼠眼眶的混合血。断头处死小鼠,使用超净工作台迅速在冰上取材小鼠脑组织,去除小脑和脑干,取材小鼠脑组织海马,匀浆,4℃冰箱静置匀浆液1h。TGL-16G台式离心机3000rpm/min离心20min,取上清液,分装,检测小鼠脑组织海马样品蛋白和血清样品蛋白含量。余下小鼠脑组织海马样品蛋白和小鼠血清样品蛋白保存于-80℃冰箱备用。设置空白孔、标准品孔及样品孔。各孔中加入相应的物质。采用6100型RT-雷杜酶标仪进行测定450nm的波长下的吸光度值。根据标准曲线的方程及其各孔的吸光度值计算出小鼠脑组织海马APP、Aβ1-42、Aβ1-40、IL-1β、TNF-α、IL-6、Bcl-2、Bax和血清Aβ1-40含量,以此评价中药组合物对AD小鼠脑组织海马APP相关蛋白、炎症介质、细胞凋亡的影响。
2.9测定脑组织T-AOC、SOD、GSH-PX和MDA含量
MWM实验结束后,水合氯醛(10%)麻醉小鼠,取材小鼠脑组织,分离小鼠脑组织海马,匀浆,静置海马1h,TGL-16G台式离心机3000rpm/min离心20min,取上清液,分装,按照试剂盒说明书测定小鼠脑组织海马T-AOC、SOD、GSH-PX和MDA含量,以此评价中药组合物对AD小鼠抗氧化能力的影响。
2.10测定小鼠脑组织BBB通透性
小鼠脑组织BBB通透性用脑组织伊文氏蓝(EB)渗出量进行表示,按照倍比稀释方法依次配成8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml的EB标准溶液,45℃避光孵育72h,使用6100型RT-雷杜酶标仪检测630nm的吸光度值(A)。以EB浓度为横坐标,吸光度值(A)为纵坐标,求出EB浓度的标准曲线方程。MWM实验结束后,小鼠尾静脉注射2%EB,麻醉各组小鼠,输液器针头扎入左心室心尖搏动最明显的部位,缓慢灌注生理盐水约90ml,剪开右心耳,将小鼠放到超净工作台迅速解剖,取小鼠脑组织,记录小鼠脑组织重量为脑组织湿重,浸泡甲酰胺溶液,45℃避光孵育72h,匀浆脑组织,TGL-16G台式离心机3000rpm/min离心10min。使用6100型RT-雷杜酶标仪630nm处测定脑组织上清液吸光度值(A)。根据EB标准曲线求出EB含量,EB含量计算公式为:EB含量(μg/g)=EB浓度/脑组织湿重。
2.11免疫组织化学(IHC)测定小鼠脑组织海马RAGE、NF-κBp65、LRP1、Apo J和ApoE蛋白表达
2.11.1心脏灌注
MWM实验结束后,水合氯醛麻醉小鼠,剪开胸腔,暴露心脏,剪开右心耳,左心室心尖处搏动最明显的地方缓慢匀速点滴生理盐水100ml,直到小鼠肝脏组织完全变白为止,4%多聚甲醛缓慢匀速灌注大约50ml,小鼠四肢及尾巴僵硬,确定各组小鼠心脏灌注成功。
2.11.2石蜡切片
小鼠心脏灌注好后,超净工作台上准备取材全脑,去除小鼠的小脑和脑干,将小鼠脑组织修整齐后,放到含有4%多聚甲醛的固定容器中24h。使用从低浓度逐渐过渡到高浓度的乙醇进行脱水,二甲苯透明,小鼠脑组织放到融化的液态石蜡中,液态石蜡凝固后,石蜡块放到冷水30min,切片机对小鼠脑组织进行连续切片,脑组织切片的厚度是5μm,切片裱于经过多聚赖氨酸处理过的玻片上,切片烘烤2h,保存于4℃冰箱中。
2.11.3IHC测定小鼠脑组织海马RAGE、NF-κBp65、LRP1、Apo J和Apo E蛋白的表达
采用IHC测定海马RAGE、NF-κBp65、LRP1、Apo J和Apo E蛋白表达。IHC基本过程包括石蜡切片脱蜡、3%H2O2处理、加入一抗、4℃冰箱过夜、PBS洗涤、加入二抗、37℃孵育、PBS洗涤、DAB显色、光学显微镜下观察切片、蒸馏水冲洗、苏木精复染、PBS洗涤、分化、蓝化、脱水、透明、封片等基本过程。同时设立阴性对照组和阳性对照组排除本实验假阳性和假阴性,采用HMIAS高清晰度彩色医学图文分析系统进行分析切片,计数各组小鼠脑组织海马平均光密度值,比较分析小鼠脑组织海马RAGE、NF-κBp65、LRP1、Apo J和Apo E蛋白的平均光密度值,以此评价中药组合物对RAGE、NF-κBp65、LRP1、Apo J和Apo E蛋白的表达水平。
2.12实时定量-PCR(RT-PCR)测定小鼠脑组织海马RAGE、NF-κBp65、LRP1、Apo J和Apo E mRNA的表达
取新鲜小鼠脑组织海马(Hippocampus)样品放入预冷的研钵中,加入液氮进行充分的研磨,将小鼠脑组织海马粉末移入EP管中,提取总RNA。检测提取的小鼠脑组织海马总RNA浓度,测定OD260/280的值为1.8-2.0之间,说明所提取的小鼠脑组织海马RNA纯度符合要求,同时将总RNA进行琼脂糖(Agarose)电泳,验证小鼠脑组织海马总RNA的完整性(28S、18S两条带)。将小鼠脑组织海马总RNA于冰箱中进行保存,以备后面的实验使用。使用TaKaRa反转录试剂盒,按组成配制RT-PCR的反转录反应液,进行检测小鼠脑组织(Braintissue)海马样品。设定引物序列,包括RAGE、NF-κBp65、LRP1、Apo J、Apo E和β-actin的正反向引物(表1所示)。
表1引物名称和序列
RT-PCR反应参数为:50℃2min,95℃10min,1Cycle。50℃2min,95℃10min,95℃15s,60℃1min,40Cycles。本实验的所有数据均采用2-ΔΔCt法计算。ΔCt1=(中药组合物未处理样品)基因Mean Ct值-β-actin基因Mean Ct值。ΔCt2=(中药组合物处理样品)基因Mean Ct值-β-actin基因Mean Ct值。ΔΔCt=ΔCt1(中药组合物处理样品)-ΔCt2(中药组合物未处理样品),本实验采用2-ΔΔCt法评价小鼠脑组织(Brain tissue)海马目的基因表达的水平,2-ΔΔCt法表示的RT-PCR实验结果数值越大,则目的基因表达越强,以此评价中药组合物对小鼠脑组织海马RAGE、NF-κBp65、LRP1、Apo J和Apo E mRNA的表达水平。
2.13测定小鼠体重和脏器指数
中药组合物给药过程中,平均每7d使用电子天平测定小鼠体重。MWM实验结束后,断头处死小鼠,超净工作台上解剖各组小鼠,取材小鼠脾、胸腺、脑、心、肺、肝和肾,洗涤小鼠的脾、胸腺、脑、心、肺、肝和肾,吸干脏器水分,电子天平称量小鼠脾、胸腺、脑、心、肺、肝和肾脏器质量,计算小鼠脾、胸腺、脑、心、肺、肝和肾指数,比较各组小鼠的体重和脏器指数差异,以此评价中药组合物的副作用。脏器指数(mg/g)=脏器质量(mg)/小鼠体重(g)。
2.14统计学分析
采用统计学软件SPSS19.0分析处理实验数据,实验数据使用进行表示,实验数据符合正态分布(Normal Distribution)及其方差齐等统计学的基本标准,单因素方差分析(One way ANOVA)多组间的实验数据,P<0.05表示差异有统计学意义,P>0.05表示差异无统计学意义。
3结果
3.1中药组合物对AD小鼠潜伏期的影响
实验使用潜伏期评价小鼠定位航行能力,随着各组小鼠训练时间延长,各组小鼠的潜伏期均表现出下降趋势,预示各组小鼠寻找第IV象限水下平台的能力逐渐增强,说明小鼠定位航行能力逐渐增强。统计分析训练第4d和测试第5d潜伏期,实验结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠潜伏期明显延长(P<0.05),差异有统计学意义,预示模型组AD小鼠寻找第IV象限水下平台比较困难,说明AD模型小鼠学习能力下降,模型建立成功,适合选择该模型开展抗AD的实验研究;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠潜伏期明显缩短(P<0.05),差异有统计学意义,预示中药组合物高、中剂量可以促进小鼠较快地寻找到第IV象限水下平台,搜寻第IV象限水下平台的时间缩短,说明中药组合物高、中剂量可以改善各组小鼠的学习能力;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠潜伏期改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义,预示中药组合物低剂量组小鼠寻找第IV象限水下平台的能力较弱,说明中药组合物低剂量改善AD模型小鼠的学习能力较差。见表2、图1。
表2中药组合物对AD小鼠潜伏期的影响(n=8)
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.2中药组合物对AD小鼠游泳距离的影响
实验使用小鼠的游泳距离评价小鼠的空间探索能力,随着小鼠训练时间的延长,各组小鼠的游泳距离均表现出下降的趋势,预示第IV象限移动平台的位置在小鼠脑组织内部已经存储、加工、提取,说明小鼠的空间探索能力逐渐增强。统计分析训练第3-4d和测试第5d游泳距离,结果表明,对照组比较,模型组AD小鼠游泳距离明显增加(P<0.05),差异有统计学意义,预示小鼠寻找第IV象限水下移动平台比较困难,说明模型组小鼠的记忆能力不佳,提示AD模型稳定;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠游泳距离明显减少(P<0.05),差异有统计学意义,预示中药组合物高、中剂量可以促进小鼠较快寻找到第IV象限水下平台,提示第IV象限水下平台的位置已经在小鼠的脑组织记忆脑区存储、加工、提取,说明小鼠的记忆能力逐渐得到改善;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠游泳距离改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义,预示中药组合物低剂量改善AD模型小鼠的记忆能力较差。见表3、图2。
表3中药组合物对AD小鼠游泳距离的影响(n=8)
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.3中药组合物对AD小鼠目标象限停留时间和跨平台次数的影响
通过检测小鼠的目标象限停留时间和跨平台次数,以此评价各组小鼠的学习记忆保持能力。实验结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠目标象限停留时间明显缩短,且跨平台次数明显降低(P<0.05),差异有统计学意义,预示模型组AD小鼠对第IV象限移动平台的学习记忆保持能力不佳,说明模型组AD小鼠的学习记忆保持能力较弱;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠目标象限停留时间明显延长,且跨平台次数明显增加(P<0.05),差异有统计学意义,预示中药组合物高、中剂量组小鼠的学习记忆保持能力逐渐改善;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠目标象限停留时间和跨平台次数改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义,预示中药组合物低剂量对小鼠学习记忆保持能力影响不明显。见表4、图3。
表4中药组合物对AD小鼠目标象限停留时间和跨平台次数的影响(n=8)
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.4中药组合物对AD小鼠脑组织海马CA1区超微结构的影响
TEM观察对照组小鼠脑组织海马CA1区神经元形态较规则,胞体较大,核椭圆形且清晰,线粒体和粗面内质网丰富,核膜较清晰,预示对照组小鼠脑组织海马CA1区神经元结构正常;模型组AD小鼠脑组织海马CA1区神经元不规则,细胞器不丰富,细胞核小而椭圆,粗面内质网较少,高尔基复合体较少,预示模型组小鼠脑组织海马CA1区神经元结构欠佳;治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑组织海马CA1区神经元形态规则,胞体较大,核较大且椭圆形,粗面内质网、高尔基复合体较多,预示中药组合物高、中剂量改善小鼠脑组织海马CA1区神经元的基本结构;中药组合物低剂量组小鼠脑组织海马CA1区神经元细胞核圆形,细胞质内线粒体较少,预示中药组合物低剂量对小鼠脑组织海马CA1区神经元的结构影响不明显。见图4、图5。
3.5中药组合物对AD小鼠脑组织海马APP含量的影响
结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠脑组织海马APP含量明显增加(P<0.05),差异有统计学意义,预示模型组AD小鼠脑组织产生Aβ的原材料APP增加,有利于脑组织APP生成Aβ;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑组织海马APP含量明显降低(P<0.05),差异有统计学意义,预示中药组合物高、中剂量可以减少脑组织Aβ的原材料,减少脑组织Aβ的生成,进而减轻AD的症状和体征;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠脑组织海马APP含量改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义,说明中药组合物低剂量对小鼠脑组织海马APP含量影响较弱。见表5、图6。
表5中药组合物对AD小鼠脑组织海马APP含量的影响
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.6中药组合物对AD小鼠脑组织海马Aβ1-42含量的影响
结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠脑组织海马Aβ1-42含量明显增加(P<0.05),差异有统计学意义,预示模型组AD小鼠脑组织可以形成SP和ADDLs的Aβ水平增加,有利于模型组AD小鼠脑组织SP和ADDLs的形成,加重AD的症状和体征;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑组织海马Aβ1-42含量明显降低(P<0.05),差异有统计学意义,预示中药组合物高、中剂量可以减少小鼠脑组织SP和ADDLs的形成,有利于AD的治疗;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠脑组织海马Aβ1-42含量改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义,预示中药组合物低剂量对小鼠脑组织海马Aβ1-42含量影响较弱。见表6、图6。
表6中药组合物对AD小鼠脑组织海马Aβ1-42含量的影响
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.7中药组合物对AD小鼠脑组织海马Aβ1-40含量的影响
结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠脑组织海马Aβ1-40含量明显增加(P<0.05),差异有统计学意义,预示模型组AD小鼠脑组织可以进行跨BBB转运的Aβ含量增加,脑组织容易形成SP;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑组织海马Aβ1-40含量明显降低(P<0.05),差异有统计学意义,预示中药组合物高、中剂量可以减少小鼠脑组织Aβ1-40含量;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠脑组织海马Aβ1-40含量改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义。见表7、图6。
表7中药组合物对AD小鼠脑组织海马Aβ1-40含量的影响
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.8中药组合物对AD小鼠血清Aβ1-40含量的影响
结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠血清Aβ1-40含量明显增加(P<0.05),差异有统计学意义,预示肝、肾、脾、胃等器官对Aβ1-40代谢较少,或者血清中可以结合Aβ1-40的可溶性LRP1蛋白含量减少而导致游离的Aβ1-40水平增加;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠血清Aβ1-40含量明显减少(P<0.05),差异有统计学意义,预示肝、肾、脾、胃等器官对Aβ1-40代谢较多,或者血清中可以结合Aβ1-40的可溶性LRP1蛋白含量增加而导致游离的Aβ1-40水平减少;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠血清Aβ1-40含量改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义,预示中药组合物低剂量干扰肝、肾、脾、胃等器官对Aβ1-40代谢不明显。见表8、图6。
表8中药组合物对AD小鼠血清Aβ1-40含量的影响
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.9中药组合物对AD小鼠脑组织海马IL-1β含量的影响
结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠脑组织海马IL-1β含量明显增加(P<0.05),差异有统计学意义,预示模型组AD小鼠脑组织海马MG活跃,分泌大量炎症介质IL-1β,介导脑组织神经性、无菌性炎症反应;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑组织海马IL-1β含量明显降低(P<0.05),差异有统计学意义,预示中药组合物高、中剂量可以降低脑组织海马MG的活跃程度,减少炎症介质IL-1β释放,进而减轻小鼠脑组织海马神经性、无菌性炎症反应;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠脑组织海马IL-1β含量改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义,预示中药组合物低剂量对小鼠脑组织海马MG的活跃程度影响不明显。见表9、图7。
表9中药组合物对AD小鼠脑组织海马IL-1β含量的影响
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.10中药组合物对AD小鼠脑组织海马TNF-α含量的影响
结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠脑组织海马TNF-α含量明显增加(P<0.05),差异有统计学意义,预示模型组AD小鼠脑组织神经胶质细胞释放炎症介质TNF-α增加,加重脑组织海马区域的神经性、无菌性炎症反应;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑组织海马TNF-α含量明显降低(P<0.05),差异有统计学意义,预示中药组合物高、中剂量可以降低脑组织神经胶质细胞的活跃程度,降低小鼠脑组织海马TNF-α水平,从而减轻小鼠脑组织海马神经性炎症反应;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠脑组织海马TNF-α含量改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义,预示中药组合物低剂量对小鼠脑组织海马神经胶质细胞的活跃程度影响不明显。见表10、图7。
表10中药组合物对AD小鼠脑组织海马TNF-α含量的影响
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.11中药组合物对AD小鼠脑组织海马IL-6含量的影响
结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠脑组织海马IL-6含量明显增加(P<0.05),差异有统计学意义,预示模型组AD小鼠海马神经性、无菌性炎症反应明显;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑组织海马IL-6含量明显降低(P<0.05),差异有统计学意义,预示中药组合物高、中剂量可以改善脑组织海马神经性、无菌性炎症反应;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠脑组织海马IL-6含量改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义,预示中药组合物低剂量对小鼠脑组织海马神经性、无菌性炎症反应的影响不明显。见表11、图7。
表11中药组合物对AD小鼠脑组织海马IL-6含量的影响
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.12中药组合物对AD小鼠脑组织海马Bcl-2和Bax含量的影响
实验采用ELISA方法检测小鼠脑组织海马Bcl-2和Bax含量。实验结果表明,与对照组比较,模型组小鼠脑组织海马Bcl-2/Bax的比值明显降低(P<0.05),提示Bcl-2-Bax异二聚体减少,Bax-Bax同二聚体增加,预示AD小鼠脑组织海马神经元的线粒体细胞凋亡较为明显。与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑组织海马Bcl-2/Bax的比值明显升高(P<0.05),显示小鼠脑组织海马抗凋亡蛋白表达明显上调,而促凋亡蛋白表达改变不明显,预示Bcl-2-Bax异二聚体增加,Bax-Bax同二聚体减少,进而导致了Bcl-2/Bax的比值升高,预示不同剂量中药组合物可通过增加小鼠脑组织海马Bcl-2/Bax的比值来发挥抗凋亡的积极作用。见表12、图8。
表12中药组合物对AD小鼠脑组织海马Bcl-2/Bax比值的影响(n=8)
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.13中药组合物对AD小鼠脑组织海马T-AOC含量的影响
结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠脑组织海马T-AOC含量明显降低(P<0.05),差异有统计学意义,预示模型组AD小鼠脑组织海马的抗氧化能力减弱,导致脑组织自由基的产生增加;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑组织海马T-AOC含量明显升高(P<0.05),差异有统计学意义,说明中药组合物高、中剂量可以增强AD小鼠脑组织海马的抗氧化能力,减轻自由基对机体脑组织的干扰;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠脑组织海马T-AOC含量改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义,预示中药组合物低剂量对小鼠脑组织海马的抗氧化能力影响不明显。见表13、图9。
表13中药组合物对AD小鼠脑组织海马T-AOC含量的影响
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.14中药组合物对AD小鼠脑组织海马SOD含量的影响
结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠脑组织海马SOD含量明显降低(P<0.05),差异有统计学意义,预示模型组AD小鼠脑组织海马自由基的清除能力减弱;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑组织海马SOD含量明显升高(P<0.05),差异有统计学意义,预示中药组合物高、中剂量组小鼠脑组织海马清除自由基的能力增强;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠脑组织海马SOD含量改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义,说明中药组合物低剂量对小鼠脑组织海马自由基的清除能力影响不明显。见表14、图10。
表14中药组合物对AD小鼠脑组织海马SOD含量的影响
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.15中药组合物对AD小鼠脑组织海马GSH-PX含量的影响
结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠脑组织海马GSH-PX含量明显降低(P<0.05),差异有统计学意义,预示模型组AD小鼠脑组织海马抗氧化能力减弱;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑组织海马GSH-PX含量明显增加(P<0.05),差异有统计学意义,预示中药组合物高、中剂量明显提高小鼠脑组织清除自由基的能力,增强小鼠脑组织海马抗氧化能力;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠脑组织海马GSH-PX含量改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义,预示中药组合物低剂量对小鼠脑组织海马的抗氧化能力影响不明显。见表15、图11。
表15中药组合物对AD小鼠脑组织海马GSH-PX含量的影响
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.16中药组合物对AD小鼠脑组织海马MDA含量的影响
结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠脑组织海马MDA含量明显增加(P<0.05),差异有统计学意义,预示模型组AD小鼠脑组织海马氧化产物增加,抗氧化能力减弱;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑组织海马MDA含量明显降低(P<0.05),差异有统计学意义,预示中药组合物高、中剂量组小鼠脑组织海马氧化产物减少,抗氧化能力增强,说明中药组合物高、中剂量可以改善小鼠脑组织海马氧化产物的堆积,增强抗氧化能力;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠脑组织海马MDA含量改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义,预示中药组合物低剂量不能改善小鼠脑组织海马氧化产物的堆积。见表16、图12。
表16中药组合物对AD小鼠脑组织海马MDA含量的影响
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.17中药组合物对AD小鼠脑组织BBB通透性的影响
小鼠脑组织BBB的通透性使用小鼠脑组织EB浓度和EB含量来表示,实验测定小鼠脑组织EB浓度的标准曲线方程为Y=0.2414X+0.1997,R2=0.9874。结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠脑组织EB浓度和EB含量明显增加(P<0.05),差异有统计学意义,预示模型组AD小鼠脑组织EB的渗出量增加,说明模型组AD小鼠脑组织BBB的通透性增加,促进异常的小分子物质进入脑组织;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑组织EB浓度和EB含量明显降低(P<0.05),差异有统计学意义,预示脑组织EB的渗出量减少,说明中药组合物高、中剂量可以改善AD小鼠脑组织的BBB通透性,减少异常的小分子物质进入脑组织;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠脑组织EB浓度和EB含量改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义,预示中药组合物低剂量对小鼠脑组织的BBB通透性影响不明显。见表17、图13。
表17中药组合物对AD小鼠脑组织BBB通透性的影响
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.18中药组合物对AD小鼠脑组织海马RAGE蛋白表达的影响
RAGE表达于海马神经元细胞膜和/或细胞质内,统计分析小鼠脑组织海马RAGE平均光密度值,结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠脑组织海马RAGE平均光密度值明显增加(P<0.05),差异有统计学意义,预示模型组AD小鼠脑组织海马RAGE蛋白表达增加,提示模型组AD小鼠脑组织海马神经元与Aβ结合较多,模型组AD小鼠脑组织海马神经性炎症反应、氧化应激反应和细胞凋亡较强,加重了模型组AD小鼠脑组织海马的损伤;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑组织海马RAGE平均光密度值明显减少(P<0.05),差异有统计学意义,预示中药组合物高、中剂量组小鼠脑组织海马RAGE蛋白表达减弱,提示中药组合物高、中剂量组小鼠脑组织海马神经元与Aβ结合较少,海马神经性炎症反应、氧化应激反应和细胞凋亡较弱,说明中药组合物高、中剂量可以改善小鼠脑组织海马的神经性、无菌性炎症反应等,进而减轻了小鼠脑组织海马的损伤;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠脑组织海马RAGE平均光密度值改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义,预示中药组合物低剂量对小鼠脑组织海马RAGE蛋白表达影响不明显。见表18、图14。
表18中药组合物对AD小鼠脑组织海马RAGE蛋白表达的影响
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.19中药组合物对AD小鼠脑组织海马NF-κBp65蛋白表达的影响
NF-κBp65表达于小鼠脑组织海马神经元细胞质和/或细胞核等等,统计分析小鼠脑组织海马NF-κBp65的平均光密度值,实验结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠脑组织海马NF-κBp65的平均光密度值明显增加(P<0.05),预示模型组AD小鼠脑组织海马NF-κBp65表达增加,提示模型组AD小鼠脑组织海马神经性炎症反应、氧化应激反应、细胞凋亡明显,进而导致脑血流量减少,促进小鼠脑组织损伤;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑组织海马NF-κBp65平均光密度值明显减少(P<0.05),预示中药组合物高、中剂量小鼠脑组织海马NF-κBp65表达减弱,提示中药组合物高、中剂量可以改善小鼠脑组织海马神经性炎症反应和脑组织血流量等等;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠脑组织海马NF-κBp65平均光密度值改变不明显(P>0.05),预示中药组合物低剂量对小鼠脑组织海马NF-κBp65蛋白表达影响不明显。见表19、图14。
表19中药组合物对AD小鼠脑组织海马NF-κBp65蛋白表达的影响
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.20中药组合物对AD小鼠脑组织海马LRP1蛋白表达的影响
LRP1表达于小鼠脑组织海马神经元、血管内皮细胞等细胞质和/或细胞核内,统计分析小鼠脑组织海马LRP1平均光密度值,结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠脑组织海马LRP1平均光密度值明显减少(P<0.05),差异有统计学意义,预示模型组AD小鼠脑组织海马LRP1表达减弱,提示模型组AD小鼠脑组织海马清除Aβ的能力减弱,容易造成海马Aβ积聚,促进AD的发生发展;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑组织海马LRP1平均光密度值明显增加(P<0.05),差异有统计学意义,预示中药组合物高、中剂量组小鼠脑组织海马LRP1表达增强,说明中药组合物高、中剂量小鼠脑组织海马清除Aβ的能力增强,有利于治疗AD;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠脑组织海马LRP1平均光密度值改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义,预示中药组合物低剂量对小鼠脑组织海马清除Aβ的能力影响不明显。见表20、图14。
表20中药组合物对AD小鼠脑组织海马LRP1蛋白表达的影响
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.21中药组合物对AD小鼠脑组织海马Apo J蛋白表达的影响
Apo J蛋白表达于小鼠脑组织海马神经元细胞核内,统计分析小鼠脑组织海马ApoJ平均光密度值,结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠脑组织海马Apo J平均光密度值明显减少(P<0.05),差异有统计学意义,预示模型组AD小鼠脑组织海马Apo J表达减弱,提示模型组AD小鼠脑组织海马Aβ清除率降低;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑组织海马Apo J平均光密度值明显增加(P<0.05),差异有统计学意义,预示中药组合物高、中剂量组小鼠脑组织海马Apo J表达增强,提示中药组合物高、中剂量组小鼠脑组织海马Aβ清除率增加;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠脑组织海马Apo J平均光密度值改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义,预示中药组合物低剂量对小鼠脑组织海马Aβ清除率影响不明显。见表21、图14。
表21中药组合物对AD小鼠脑组织海马Apo J蛋白表达的影响
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.22中药组合物对AD小鼠脑组织海马Apo E蛋白表达的影响
统计分析小鼠脑组织海马Apo E平均光密度值,结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠脑组织海马Apo E平均光密度值明显减少(P<0.05),预示模型组AD小鼠脑组织海马Apo E表达减弱,不利于小鼠脑组织Aβ清除;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑组织海马Apo E平均光密度值明显增加(P<0.05),预示中药组合物高、中剂量可以增强小鼠脑组织海马Apo E表达,有利于小鼠脑组织Aβ清除;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠脑组织海马Apo E平均光密度值改变不明显(P>0.05),预示中药组合物低剂量对小鼠脑组织海马Apo E的表达改变不明显。见表22、图14。
表22中药组合物对AD小鼠脑组织海马Apo E蛋白表达的影响
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.23中药组合物对AD小鼠脑组织海马RAGE mRNA表达的影响
统计分析小鼠脑组织海马RAGE mRNA相对表达量,结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠脑组织海马RAGE mRNA相对表达量明显增加(P<0.05),预示模型组AD小鼠脑组织海马RAGE基因表达增强,加重模型组AD小鼠脑组织海马的神经性炎症反应等等;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑组织海马RAGE mRNA相对表达量明显降低(P<0.05),预示中药组合物高、中剂量减弱小鼠脑组织海马RAGE基因表达,减轻小鼠脑组织海马的神经性炎症反应等等;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠脑组织海马RAGE mRNA相对表达量改变不明显(P>0.05),预示中药组合物低剂量对小鼠脑组织海马RAGE基因影响不明显。见表23、图15。
表23中药组合物对AD小鼠脑组织海马RAGE mRNA表达的影响(n=8)
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.24中药组合物对AD小鼠脑组织海马NF-κBp65mRNA表达的影响
统计分析小鼠脑组织海马NF-κBp65mRNA相对表达量,结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠脑组织海马NF-κBp65mRNA相对表达量明显增加(P<0.05),预示模型组AD小鼠脑组织海马NF-κBp65基因表达增加,提示模型组AD小鼠脑组织海马出现神经性炎症反应和细胞凋亡等等;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑组织海马NF-κBp65mRNA相对表达量明显降低(P<0.05),预示中药组合物高、中剂量改善小鼠脑组织海马神经性炎症反应和细胞凋亡等等;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠脑组织海马NF-κBp65mRNA相对表达量改变不明显(P>0.05),预示中药组合物低剂量对小鼠脑组织海马NF-κBp65基因的影响不明显,说明中药组合物低剂量对小鼠脑组织海马神经性炎症反应和细胞凋亡等影响不明显。见表24、图15。
表24中药组合物对AD小鼠脑组织海马NF-κBp65mRNA表达的影响(n=8)
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.25中药组合物对AD小鼠脑组织海马LRP1 mRNA表达的影响
统计分析小鼠脑组织海马LRP1 mRNA相对表达量,结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠脑组织海马LRP1 mRNA相对表达量明显降低(P<0.05),预示模型组AD小鼠脑组织海马LRP1基因表达增加,不利于神经元代谢Aβ,减少脑组织Aβ外流,促进AD的发生发展;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑组织海马LRP1mRNA相对表达量明显增加(P<0.05),差异有统计学意义,预示中药组合物高、中剂量组小鼠脑组织海马LRP1表达上调,利于神经元代谢Aβ,增加脑组织Aβ外流,减缓AD的发生发展;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠脑海马LRP1 mRNA相对表达量改变不明显(P>0.05),预示中药组合物低剂量对小鼠脑海马LRP1基因表达影响不明显。见表25、图15。
表25中药组合物对AD小鼠脑组织海马LRP1 mRNA表达的影响(n=8)
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.26中药组合物对AD小鼠脑组织海马Apo J mRNA表达的影响
统计分析小鼠脑组织海马Apo J mRNA相对表达量,结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠脑组织海马Apo J mRNA相对表达量明显降低(P<0.05),差异有统计学意义,预示模型组AD小鼠脑组织海马Apo J基因表达减弱,降低了小鼠脑组织海马Aβ的清除率;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑组织海马Apo J mRNA相对表达量明显增加(P<0.05),差异有统计学意义,预示中药组合物高、中剂量组小鼠脑组织海马Apo J基因表达增强,增加了小鼠脑组织海马Aβ的清除率;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠脑组织海马Apo J mRNA相对表达量改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义,预示中药组合物低剂量对小鼠脑组织海马Apo J基因表达影响不明显。见表26、图15。
表26中药组合物对AD小鼠脑组织海马Apo J mRNA表达的影响(n=8)
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.27中药组合物对AD小鼠脑组织海马Apo E mRNA表达的影响
统计分析小鼠脑组织海马Apo E mRNA相对表达量,结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠脑组织海马Apo E mRNA相对表达量明显降低(P<0.05),差异有统计学意义,预示模型组AD小鼠脑组织海马Apo E基因表达减弱,不利于小鼠脑组织海马Aβ清除;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脑组织海马Apo E mRNA相对表达量明显增加(P<0.05),差异有统计学意义,预示中药组合物高、中剂量组小鼠脑组织海马Apo E基因表达增强,有利于小鼠脑组织海马Aβ清除;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠脑组织海马Apo E mRNA相对表达量改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义,预示中药组合物低剂量不利于小鼠脑组织海马Aβ的清除。见表27、图15。
表27中药组合物对AD小鼠脑组织海马Apo E mRNA表达的影响(n=8)
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.28中药组合物对AD小鼠脾、胸腺和脑指数的影响
统计分析各组小鼠脾、胸腺和脑指数,结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠脾、胸腺和脑指数明显降低(P<0.05),差异有统计学意义,预示模型组AD小鼠脾、胸腺和脑相对质量减轻,产生B细胞和T细胞水平低下,体液免疫和细胞免疫较弱,伴有脑组织相对质量减轻而出现脑萎缩,说明模型组AD小鼠免疫功能降低和脑组织出现萎缩;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组小鼠脾、胸腺和脑指数明显增加(P<0.05),预示中药组合物高、中剂量可以增加脾、胸腺和脑的相对质量,促进B细胞和T细胞水平上调,说明中药组合物高、中剂量可以改善小鼠的免疫功能,并且减轻脑萎缩的程度;与模型组比较,中药组合物低剂量组小鼠脾、胸腺和脑指数改变不明显(P>0.05),预示中药组合物低剂量对小鼠的免疫功能和脑萎缩的影响不明显。见表28、图16。
表28中药组合物对AD小鼠脾、胸腺和脑指数的影响(n=8)
注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05,&P>0.05
3.29中药组合物对AD小鼠心、肺、肝和肾指数的影响
统计分析小鼠的心、肺、肝和肾指数,结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠的心、肺、肝和肾指数改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义,提示模型组AD小鼠的重要脏器指数改变不明显,预示模型组与对照组重要脏器的相对质量改变不明显;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物低剂量组小鼠的心、肺、肝和肾指数改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义,说明中药组合物高、中、低剂量对各组小鼠无副作用。见表29、图17。
表29中药组合物对AD小鼠心、肺、肝和肾指数的影响(n=8)
注:与对照组比较,*P>0.05;与模型组比较,#P>0.05
3.30中药组合物对AD小鼠体重的影响
中药组合物不同剂量给药处理小鼠过程中,每7d测定各组小鼠体重,并且得到各组小鼠的体重变化,显示中药组合物不同剂量给药42d时间内,小鼠体重逐渐增加,预示中药组合物不同剂量对小鼠无副作用。统计分析各组间小鼠体重的实验数据,实验结果表明,与对照组比较,模型组AD小鼠体重改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义;与模型组比较,治疗组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物低剂量组小鼠体重改变不明显(P>0.05),差异无统计学意义,预示中药组合物不同剂量对小鼠无副作用。见表30、表31、图18。
表30中药组合物对AD小鼠0、7、14、21d体重的影响(n=8)
注:与对照组比较,*P>0.05;与模型组比较,#P>0.05
表31中药组合物对AD小鼠28、35、42d体重的影响(n=8)
注:与对照组比较,*P>0.05;与模型组比较,#P>0.05
以上实验综合表明,中药组合物高、中剂量可以提高AD小鼠学习记忆能力,改善AD小鼠海马超微结构,降低AD小鼠脑组织海马APP、Aβ1-42、Aβ1-40及血清Aβ1-40水平,降低海马炎症介质IL-1β、TNF-α和IL-6水平,增强AD小鼠脑组织海马Bcl-2表达且减弱Bax表达,增加海马T-AOC、SOD、GSH-PX水平且降低MDA水平,改善AD小鼠脑组织BBB的通透性,减弱AD小鼠脑组织海马RAGE和NF-κBp65表达且增强海马LRP1、Apo J和Apo E表达,改善AD模型小鼠脾、胸腺和脑指数,而中药组合物不同剂量对AD小鼠其他脏器指数和体重无影响,基于这些,说明中药组合物高、中剂量治疗AD有效并且无副作用。
Claims (7)
1.一种用于治疗阿尔茨海默病的中药组合物,其特征在于该中药组合物由以下重量份的各原料药组成:白术8-18份,龙眼肉10-20份,阿胶3-13份,鱼鳔15-25份,败酱草3-13份,地锦草5-20份,地肤子5-20份,夏枯草5-20份,莲米5-20份,皂刺3-13份,白蒺藜3-15份以及威灵仙3-13份。
2.如权利要求1所述的中药组合物,其特征在于该中药组合物由以下重量份的各原料药组成:白术13份,龙眼肉15份,阿胶8份,鱼鳔20份,败酱草8份,地锦草12份,地肤子12份,夏枯草12份,莲米12份,皂刺8份,白蒺藜9份以及威灵仙8份。
3.一种临床上适宜的用于防治阿尔茨海默病的中药制剂,其特征在于由权利要求1或2所述的中药组合物加入制剂成型所需的辅料,按照制备药物制剂的常规方法制成。
4.如权利要求3所述的中药制剂,其特征在于所述的制剂为水煎剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、片剂或口服液。
5.一种制备权利要求1或2所述的中药组合物的方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)按照权利要求1或2所述的重量份称取各原料药,将各原料药混合均匀后放入高颈圆底烧瓶中,加入药物重量8-15倍的蒸馏水,浸泡1-2h后,煎煮1-2h,冷却;
(2)将步骤(1)冷却后的药液用纱布过滤,得到第一次滤液;
(3)步骤(2)剩余的药物残渣放入高颈圆底烧瓶中,重复步骤(1)和(2)得到第二次滤液,合并二次滤液;
(4)干燥,得到所述中药组合物的干膏。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于还包括将得到的干膏放在粉碎机内粉碎,研磨,分子筛处理,得到所述中药组合物的干粉。
7.权利要求1或2所述的中药组合物在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
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