CN113368182A - 一种预防或治疗糖尿病脑病的中药组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种预防或治疗糖尿病脑病中药组合物及其用途。所述中药组合物由知母、黄柏、肉苁蓉制成；所述中药组合物能够明显改善糖尿病脑病海马损伤，抑制海马区小胶质细胞活化，减少糖尿病脑血管和神经细胞损伤，增强脑内类淋巴系统清除功能，增加脑血管新生数目以及稳定性，减少小肠粘膜损伤。

Description

一种预防或治疗糖尿病脑病的中药组合物及其用途
技术领域
本发明属于中药领域，具体地涉及一种预防或治疗糖尿病脑病中药组合物。
背景技术
传统医学认为消渴基本病机主要在于阴津亏虚，燥热偏盛。清·陈士铎在《石室秘录·消渴证治》中指出：“消渴之症，虽分上中下，而肾虚以致渴则无不同。”《外台秘要》认为：“消渴者，原其发动，此则肾虚所致。”《严氏济生方·消渴门》曰：“消渴之疾，皆起于肾。”糖尿病脑病与中医消渴合并痴呆密切相关。近年来，糖尿病对中枢神经系统的影响也逐渐引起了人们的重视。糖尿病认知功能障碍是20世纪60年代由Miles等首先报道并在糖尿病动物模型上得以证实，其特征为获得性认知和行为缺陷。糖尿病性脑病属中医“健忘”、“呆症”的范畴，表现为智力减退、善忘、呆钝少言、倦怠、嗜卧等。糖尿病造成认知障碍的确切机制尚不清楚。人们不断总结创新对糖尿病认知功能障碍的病机也有了新的认识。王永炎院士在总结历代中医药研究成果和存在问题的基础上，提出了“毒损脑络”是糖尿病性认知功能障碍的关键病机。岳仁宋等指出在糖尿病认知功能障碍整个发病环节中，肾虚是消渴呆病最本质的特征。因此，肾虚是糖尿病脑病的基本病理。
糖尿病脑病可以分为两种类型：一是由高血糖和胰岛素功能受损引起的认知功能障碍；二是指高血糖导致缺氧进而导致脑微血管病变，然而脑微血管损伤与认知功能障碍之间有着密切关系。糖尿病能影响中枢神经系统，急性和慢性代谢紊乱会损伤糖尿病病人大脑结构和功能的完整性。作为糖尿病严重并发症之一的糖尿病脑病主要表现为认知损伤以及痴呆。
脑损伤及神经退行性疾病主要包括脑出/缺血损伤、中风、缺血性痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病以及脑外伤等，具有致残率高、死亡率高、复发率高以及并发症多的特点。脑损伤后早期一般都伴随脑内神经元缺失，意识、语言、肢体功能以及学习记忆能力下降等症状。后遗症期主要表现为病情平稳，失去的功能不再有明显好转。中药及其有效成分常用于脑损伤及神经退行性疾病的治疗。中药及其有效成分不仅可以在脑损伤早期改善血液循环，保护神经细胞及提高神经元的抗损伤能力，对于脑损伤恢复期及后遗症的治疗也具有明确的疗效。
小胶质细胞起源于单核吞噬细胞系，是中枢神经系统中固有的吞噬细胞，约占所有胶质细胞的20％，因此，它被作为大脑中免疫防御的第一道防线。小胶质细胞被激活后释放炎性因子加重神经炎症。小胶质细胞激活是一种由损伤和释放各种神经毒性物质引起的早期持续性的变化，特别会出现在严重的神经损伤中。这些神经毒性物质包括一氧化氮(NO)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)，和白介素1β(IL-1β)等。Hwang I K等将2型糖尿病大鼠分为12(糖尿病早期阶段)、20和30周龄(慢性糖尿病阶段)，处死后发现在30周龄(慢性糖尿病阶段)2型糖尿病大鼠海马中干扰素γ(IFN-γ)和白介素1β(IL-1β)的蛋白水平显著高于12和20周龄糖尿病大鼠海马中二者的含量。将脑切片后进行免疫组化染色后发现，在30周龄的糖尿病大鼠海马中作为小胶质细胞标记物离子钙接头蛋白的Iba-1出现了细胞核固缩的现象，表明了小胶质细胞被激活的状态。白细胞介素-1β在之前的研究中已证明是星形胶质细胞和神经元中诱导多重炎症介质的一种重要的免疫调节细胞因子，然而Hwang I K等却在被激活的小胶质细胞标记物Iba-1和神经胶质原纤维酸性蛋白周围观察到了白介素1β(IL-1β)的免疫反应，这些形态特征也许能够说明IL-1β可能是由神经胶质细胞和小胶质细胞分泌的，Iba-1阳性小胶质细胞被激活后会升高衰老、糖尿病大鼠海马CA1区和齿状回中IFN-γ和IL-1β的水平，这表明慢性糖尿病会加速海马的老化过程。
其次，糖尿病往往伴随着血管病变，其中脑微血管病变与认知功能障碍有关系密切。糖尿病脑微血管病变可造成毛细血管基底膜增厚，内皮细胞增生，管腔狭窄，引起脑组织血流灌注减少。糖尿病脂代谢紊乱、且多伴有血小板聚集功能增强、红细胞聚集能力过强，造成血粘度增加，脑血流量降低，而海马、丘脑内侧核和大脑皮层等认知中枢对缺血较敏感，因此大脑对信息的识别、加工、整合处理等过程发生障碍，导致认知功能下降。此外脑微血管内皮的损伤会导致BBB通透性增加以及完整性遭到破坏，BBB受损后会导致血清衍生物透过BBB，其中的有害成分会对中枢神经造成一定程度的损伤，导致认知功能障碍。
另外，近年来在认知能力下降和神经退行性疾病危险因素研究中描述一种生物分子清理系统，该系统利用脑脊液和间隙液体对流来清除大脑中有毒代谢物，其具有与淋巴系统相似的功能，以及依赖星形胶质细胞水通道蛋白的特性，被称为“类淋巴系统”。研究发现DM可抑制海马内组织间液的清除，损伤类淋巴系统功能，反过来类淋巴功能障碍会加重DM的认知障碍。与非DM相比，DM的脑内清除率显著下降，并且脑血管周围间隙明显增大，导致大量溶质Aβ聚集。DM与皮质厚度之间相关联的脑脊液中的磷酸化tau蛋白减弱了15％。DM大脑海马中溶质残留的升高可能会增加Aβ和其他可能诱发认知障碍的分子的积累。
肠道菌群也与认知功能障碍具有密切联系。在机体肠道腔内表层，有一层主要由黏蛋白组成的黏液屏障在肠道上皮细胞与肠腔内消化液，肠内容物，微生物及其代谢产物之间形成一道以保护性膜性屏障，防止内源性肠分泌物消化自身上皮细胞。黏蛋白由肠道上皮杯状细胞分泌，形成易脱落外层和鲜有微生物定殖的黏膜内层。黏膜外层被微生物降解为肠道上皮细胞提供能量，对肠腔表面也起到保护作用。葛根芩连汤通过调节肠道黏膜层厚度来调节肠道屏障功能。GABA(γ-氨基丁酸)作为抑制性神经物质在人的大脑中枢神经系统中起作用。主要由乳酸菌属和双歧杆菌属分泌，如果分泌异常会导致神精系统的焦虑或者抑郁。研究表明,给予阿兹海默症小鼠益生菌治疗后，γ-氨基丁酸表达下降，小鼠学习记忆能力提高显著，改善抑郁焦虑症状。羟色胺，多巴胺，去甲肾上腺素主要由链球菌属、埃希菌属、乳球菌属、乳杆菌属芽孢杆菌属埃希菌属、乳杆菌属，链球菌属分泌。作为一种神经递质，参与运动、认知、记忆、情绪控制与内分泌等多种中枢神经系统活动，分泌反常与帕金森病、AD与抑郁相关。乙酰胆碱，组胺主要由肠道内芽孢杆菌属，乳杆菌属，乳球菌属，链球菌属，肠球菌属分泌。乙酰胆碱作用于中枢与外周神经系统的神经递质，与认知功能、尤其与学习和记忆密切相关调节性神经递质，组胺与睡眠和认知功能有关，AD患者脑内组胺水平下降。
肠道菌群失调与肠黏膜机械屏障的功能存在关联，肠道菌群失调伴随着肠黏膜组织的破坏，紧密连接蛋白表达的降低，肠黏膜通透性的升高等病理变化。保护肠道屏障的干预措施包括益生菌疗法，恢复肠道微生态平衡及改善肠黏膜通透性对于治疗引发肠黏膜屏障损伤的原发病至关重要，也是评估临床疗效重要的指标。口服中药可以通过调节肠道菌群以降低过高的肠黏膜通透性并维持肠黏膜组织的完整性，增加肠黏膜的血流量和促进肠蠕动，从而保护肠黏膜机械屏障的功能。其中，肠黏膜免疫屏障(gut mucosal immunebarrier)已被认为是最重要的屏障之一。肠黏膜免疫屏障主要由肠相关淋巴组织(GALT)组成，在肠黏膜中，25％是淋巴组织，它们可以利用体液免疫和细胞免疫的作用，从而避免致病性抗原对机体的损伤。是机体免疫系统的最前线。GALT主要以两种形式存在：一是呈弥散分布的淋巴组织，包括肠道黏膜上皮内淋巴细胞(IEL)及固有层内散在的淋巴细胞(LPL)。二是组织化的淋巴组织，包括派伊尔氏结(Peyer’s Pathes，PP)、肠系膜淋巴结(MLN)及孤立的淋巴滤泡。其作用是产生限制细菌穿透的分泌黏液，并且通过产生抗微生物肽和蛋白质来杀死或抑制与上皮接近的细菌生长。肠道中产生了大量分泌型IgA，其主要来源于肠道抗原，尤其是当肠道中进入菌群后，肠道在刺激作用下分泌型IgA逐渐增加，并且主要通过凝集作用从上皮表面排除细菌。除了SIgA之外，这些保护性屏障因子的表达主要受先天信号传导机制的控制，识别受体信号反应保守微生物分子配体的结合。过度反应受内在反馈机制和模式识别受体在上皮细胞中的受控表达调控。另外，黏膜通过LP和黏膜淋巴组织中黏膜调节性T细胞和耐受性树突状细胞的稳态诱导而维持明显的非炎性紧张性。这些机制共同促进了肠屏障功能和黏膜免疫的稳态。肠道菌群在调节肠黏膜免疫屏障中发挥着重要作用，恢复肠道微生态平衡对于治疗引发肠黏膜免疫屏障损伤的原发病至关重要。
然而目前的中药对于糖尿病脑病的治疗并不全面，缺少有效的的治疗方式。本发明旨在提供一种预防或治疗糖尿病脑病中药组合物以更全面解决上述技术问题，以发挥中医药在治疗慢性疾病的整体优势。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种预防或治疗糖尿病脑病中药组合物，以发挥中医药在治疗慢性疾病的整体优势。
本发明的技术方案概述如下：
一种预防或治疗糖尿病脑病的口服中药组合物，按重量份数由下述原料制成：知母6-60份，黄柏6-60份、肉苁蓉6-60份。
进一步优选，知母8-56份，黄柏8-56份、肉苁蓉8-56份；
进一步优选，知母15-48份，黄柏15-48份、肉苁蓉10-20份；
进一步优选，知母15-36份，黄柏15-36份、肉苁蓉10-20份；
进一步优选，知母20份，黄柏20份、肉苁蓉20份；
或者其中知母的重量份优选9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55份。
或者其中黄柏的重量份优选9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55份。
或者其中肉苁蓉的重量份优选9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55份。
本发明的中药组合物的制备方法包括以下步骤：将各原料药粉碎后，加水或低级醇或低级醇和水的混合溶剂提取。
所述低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇中的一种或多种，更优选乙醇。
其进一步包括过滤、浓缩步骤，或进一步包括干燥的步骤。
本发明的中药组合物剂型选自散剂、汤剂、合剂、颗粒剂、胶囊、片剂、配方颗粒。
本发明还提供一种其制药用途，上述中药组合物在制备预防或者治疗糖尿病脑病物中的应用，所述糖尿病为2型糖尿病。优选，所述脑病为痴呆。所述痴呆为血管痴呆、阿尔茨海默。
本发明进一步提供一种其制药用途，上述中药组合物在制备抑制糖尿病脑病患者脑血管和神经细胞损伤药物中的应用，优选预防或者治疗糖尿病脑病海马损伤药物中的应用，所述海马为海马区神经细胞或海马齿状回区。
本发明还提供一种制药用途，上述中药组合物在制备预防或者治疗糖尿病脑病的海马区小胶质细胞活化药物中的应用。上述中药组合物在制备预防或者治疗糖尿病脑病的神经炎症药物中的应用。优选抑制脑内神经毒性的KYN、3-HK和QUIN含量，促进神经保护作用的KYNA分泌。
本发明还提供一种制药用途，上述中药组合物在制备减少糖尿病脑血管和神经细胞损伤药物的应用，进一步优选在制备减少糖尿病脑病的脑血管和神经细胞损伤药物的应用。
本发明还提供一种制药用途，上述中药组合物在制备减少类淋巴系统清除功能障碍药物的应用，进一步优选在制备减少糖尿病脑病的类淋巴系统清除功能障碍药物的应用，或优选在制备改善糖尿病认知障碍的类淋巴系统清除功能障碍药物中的应用。
本发明还提供一种制药用途，上述中药组合物在制备糖尿病认知障碍的脑血管新生障碍药物中的应用。
本发明还提供一种其制药用途，上述中药组合物在制备预防或者治疗糖尿病认知障碍药物中的应用，优选在制备预防或者治疗糖尿病认知障碍中改善学习记忆能力药物中的应用。
本发明进一步提供一种其制药用途，上述中药组合物在制备降低糖尿病脑病患者炎症反应药物中的应用。优选在抑制BDNF、IL-1、IL-6、TNF-α的应用。
本发明还提供一种其制药用途，上述中药组合物在制备预防或者治疗糖尿病患者肠道菌群失调药物中的应用，进一步优选在制备糖尿病患者肠道益生菌减少和肠道致病菌增加药物中的应用，所述肠道益生菌选自Faecalibacterium，Lactobacillus(乳酸杆菌)，Ruminococcus(瘤胃)属，普氏菌，酪酸梭菌中的一种或多种，优选普氏菌和酪酸梭菌，所述肠道致病菌选自Streptococcus，Macrococcus，Acinetobacter属菌的一种或多种。所述糖尿病患者为糖尿病脑病患者。
本发明还提供一种其制药用途，上述中药组合物在制备预防或者治疗在制备预防或者治疗糖尿病患者肠粘膜损伤药物中的应用，优选肠粘膜损伤为小肠黏膜屏障损伤，进一步优选小肠黏膜免疫屏障损伤或小肠黏膜机械屏障损伤。所述糖尿病患者为糖尿病脑病患者。优选在提高小肠粘液SIgA含量、MUC2的表达中的应用。
说明书附图：
图1本发明中药对糖尿病小鼠海马病理形态的影响
图2本发明中药对脑犬尿氨酸通路代谢物KYN,3-HK,QUIN,KYNA的影响
图3本发明中药对血清犬尿氨酸通路代谢物KYN,3-HK,QUIN,KYNA的影响
图4本发明中药对糖尿病认知障碍小鼠类淋巴系统清除功能的影响
图5本发明中药对糖尿病认知障碍小鼠类淋巴系统清除功能的影响(3D图)
图6：本发明中药组合物对水迷宫逃避潜伏期的影响。
图7：本发明中药组合物对首次到达平台的时间的影响
图8：本发明中药组合物对平台象限停留的时间的影响
图9：本发明中药组合物对穿越平台次数的影响
图10：本发明中药组合物对小鼠炎性因子的影响
图11：本发明中药组合物对肠道菌群的影响
图12：本发明中药组合物对糖尿病小鼠小肠粘液SIgA的影响
图13：本发明中药组合物对糖尿病小鼠回肠黏蛋白MUC2的影响
图14：本发明中药组合物对糖尿病小鼠回肠杯状细胞光密度值的影响
有益效果：
(1)本发明的中药组合物能够有效预防或治疗糖尿病性脑病，提高学习记忆力。
(2)本发明的中药组合物能够明显改善糖尿病脑病海马损伤，抑制海马区小胶质细胞活化，减少糖尿病脑血管和神经细胞损伤，增强脑内类淋巴系统清除功能，增加脑血管新生数目以及稳定性。
(3)发明的中药组合物能够有效预防或治疗糖尿病患者肠道菌群失调，以及糖尿病患者肠粘膜损伤，增加益生菌，提高肠道黏膜的机械屏障和免疫屏障功能，减少有害致病因子对患者的进一步全身损伤。
(4)本发明的中药组合物组方简单有效，易于临床应用，大幅降低副作用，利于慢性疾病的长期服药，提高患者用药的依从性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种预防或治疗糖尿病脑病组合物，由下述原料制成：知母20份，黄柏20份、肉苁蓉20份。
制备方法为：
称取上述原料，按照1g：10mL的比例，向原料中加入体积浓度为80％的乙醇水溶液，加热回流，过滤，提取两次，每次2h，滤液合并，浓缩至1.5g/mL。
实施例2
一种预防或治疗糖尿病脑病物组合物，由下述原料制成：知母10份，黄柏20份、肉苁蓉20份。
将上述原料粉碎，过80目筛，制成散剂。
实施例3
一种预防或治疗糖尿病脑病药物组合物，由下述原料制成：知母35份，黄柏20份，肉苁蓉5份。
称取上述原料，向原料中加入10倍量的水，加热回流，过滤，提取两次，每次1.5h，滤液合并，浓缩干燥，加入糊精制成颗粒剂。
实施例4
一种预防或治疗糖尿病脑病药物组合物，由下述原料制成：知母5份，黄柏15份、肉苁蓉20份。
称取上述原料，向原料中加入15倍量的水，加热回流，过滤，提取两次，每次2h，滤液合并，浓缩干燥，加入糊精制成颗粒，再加入润滑剂制成片剂。
实施例5
一种预防或治疗糖尿病脑病药物组合物，由下述原料制成：知母20份，黄柏6份、肉苁蓉30份。
称取上述原料，向原料中加入15倍量的水，加热回流，过滤，提取两次，每次2h，滤液合并，浓缩后，加入甜味剂制成合剂。
对比例1
组方：知母20份，黄柏20份。
制备方法为：
称取上述原料，按照1g：10mL的比例，向原料中加入体积浓度为80％的乙醇水溶液，加热回流，过滤，提取两次，每次2h，滤液合并，浓缩至1.5g/mL。
实验例1
将12周龄雄性健康C57BL/6J小鼠适应3天后，称重并随机分为正常对照组和高脂饲料组(HFD12492)，正常组仍以普通饲料喂养，其余各组小鼠均以高脂饲料喂养，3周后，单次腹腔注射小剂量的链脲霉素(streptozocin，STZ，120mg/kg)溶液，对照组小鼠注射等量新鲜柠檬酸钠缓冲液(0.1mol/L，pH4.5)。继续以普通饲料和高脂饲料分别喂养对照组和其余各组小鼠，并每隔一周检测小鼠空腹血糖和体重值，三周后选择血糖值>11.1mmol/L的小鼠，视为建模成功，称量体重并分组，用于后续实验。将小鼠分为6组，即：正常组(CON)、模型组(MOD)、知柏组(ZB)(对比例1)、知柏地黄丸组(ZBDH)、实施例1组(QRZSF)、肉苁蓉锁阳组(RS)(肉苁蓉和锁阳组分比例1:1)，每组15只。正常(CON)、模型组(MOD)灌胃给予蒸馏水，其余各给药组灌胃给予提取液，每日一次，连续给药6周。此后采用血糖仪检测各组小鼠的空腹血糖值，并记录体重变化情况。其中，知柏地黄组(ZBDH)提取：将知柏地黄丸组方中各药材按照1:1比例混匀后，用50％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，浓缩至含1g生药/ml的浓缩液，放-20℃冰箱保存。肉苁蓉锁阳组(RS)提取：将肉苁蓉、锁阳药材按照1:1比例混匀后，用50％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，浓缩至含1g生药/ml的浓缩液，放-20℃冰箱保存。
药物治疗期间采用血糖仪检测各组小鼠的空腹血糖值，并记录体重变化情况。正常对照组小鼠体重呈稳定快速增长趋势，模型组实验小鼠体重增长较正常组缓慢，但各给药组与模型组无显著性差异，结果见表1；模型组小鼠血糖较正常组有显著性差异(P<0.01)，治疗六周后知柏地黄丸组与实施例1组可见明显降低小鼠血糖，与模型组比较有极显著性差异(P<0.01)，结果见表2。
表1各组方对糖尿病小鼠体重的影响
Figure BDA0003150448200000081
*与正常组比较P＜0.05；**与正常组比较P＜0.01
#与模型组比较P＜0.05；##与模型组比较P＜0.01
表2各组方对糖尿病小鼠血糖的影响
Figure BDA0003150448200000082
Figure BDA0003150448200000091
*与正常组比较P＜0.05；**与正常组比较P＜0.01
#与模型组比较P＜0.05；##与模型组比较P＜0.01
实验例2
糖尿病小鼠学习记忆能力的考察
给药6周后，采用Morris水迷宫考察各组方对糖尿病小鼠学习记忆能力的影响。
定位航行实验，于实验前l天让动物在不含平台的水池中自由游泳1分钟，使其熟悉迷宫环境。实验时平台位置固定不变，分别使小鼠从不同象限的入水点入水，训练时将动物面朝池壁轻轻放入水中，记录小鼠从入水到找到平台的游泳路线的长度及找到平台的时间。如果60s内找不到平台，潜伏期记为60s，并将小鼠置于平台上休息10s。训练结束后将鼠置于笼中。计算各组动物潜伏期平均值，共进行5天(根据实验动物数目，每天选择训练2～4次)。
空间探索实验，隐蔽平台实验结束24h后，撤除平台，从原平台对侧象限入水点将鼠放入水中，记录大鼠在60s内的游泳路径，对大鼠在原平台象限的停留时间、穿越原平台位置的次数及其运动速度进行统计分析，并记录其运动轨迹。
在Morris水迷宫(Morris Water Maze)实验中，实验动物随着训练时间的延长，会逐渐学习并记住逃生平台的位置，平均逃避潜伏时间可以反映模型动物的学习记忆能力，平均逃避潜伏时间逐渐缩短，表明实验动物的学习记忆能力越强。本次实验共训练5天，小鼠第一天的游泳轨迹较分散、无规律性，各组间没有差异；第五天时，正常组小鼠能快速找到平台，模型组小鼠较正常组小鼠寻找平台的速度明显减慢，实施例1药组小鼠较其他给药组找到平台速度明显增快，结果见表3。随着训练次数的增加，各组小鼠的平均逃避潜伏时间总体呈逐渐下降趋势。与模型组比较，正常组小鼠平均逃避潜伏时间呈快速减少的趋势。知柏组、实施例1组、肉苁蓉锁阳组均能显著降低小鼠潜伏期时间，与模型组比较均有极显著性差异(P<0.01)，但实施例1组降低小鼠逃避潜伏期的趋势较其余三组更明显(结果见表3)。实验结果表明，本发明中药能够明显增强糖尿病小鼠学习能力。
表3各组方对糖尿病小鼠逃避潜伏时间的影响
Figure BDA0003150448200000092
Figure BDA0003150448200000101
*与正常组比较P＜0.05；**与正常组比较P＜0.01；
#与模型组比较P＜0.05；##与模型组比较P＜0.01；
随着定位航行实验训练时间的延长，实验小鼠会对逃生平台的空间位置产生记忆。穿越平台的次数、首次跨越原平台时间、在平台象限停留时间可以反映实验动物的学习记忆能力。穿越平台的次数越多、首次跨越原平台时间越短、在平台象限停留时间越长表明实验小鼠的记忆能力越强。
各组小鼠穿越平台次数的结果见表4，模型组小鼠穿越平台位置次数为1.00±0.77次，正常组为2.45±1.13次，模型组小鼠穿越次数较正常组明显减少，结果有极显著性差异(P<0.01)；实施例1组小鼠穿越平台位置的次数为2.09±1.04次，较模型组明显增加(P<0.05)。各组小鼠首次穿越平台的时间结果表4，模型组小鼠首次穿越平台的时间为35.46±14.65秒，正常组为15.06±6.98秒，模型组小鼠首次穿越平台的时间较正常组明显延长(P<0.01)。结果表明，糖尿病小鼠出现了学习记忆功能下降的病理状态，实施例1组能明显改善其学习记忆功能。
表4各组方对糖尿病小鼠记忆力的影响
Figure BDA0003150448200000102
*与正常组比较P<0.05；**与正常组比较P<0.01；
#与模型组比较P<0.05；##与模型组比较P<0.01；
实验例3
给药6周后，对小鼠用生理盐水灌注后，用4％多聚甲醛灌注，将脑组织固定，并做成冰冻切片。采用HE和甲酚紫染色方法观察本发明中药对糖尿病小鼠海马区神经细胞形态的影响；采用免疫组织化学染色方法考察本发明中药对糖尿病小鼠小胶质细胞形态的影响。
结果如附图1，对小鼠海马组织冰冻切片采用甲酚紫染色和HE染色，观察各组方对糖尿病小鼠海马区神经细胞形态的影响。染色结果显示，正常组小鼠海马齿状回区神经细胞完整、排列规则，模型组小鼠海马齿状回区大量神经细胞固缩，胞体减小，实施例1组海马区细胞固缩状态较模型组明显减轻，细胞形态较完整。
免疫组织化学染色方法考察本发明中药对小胶质细胞标记物Iba-1的影响，小胶质细胞标记物离子钙接头蛋白(Iba-1)在巨噬细胞和小胶质细胞中表达，并在这些细胞的活化过程中表达升高。为了进一步探讨本发明中药对糖尿病小鼠海马区小胶质细胞活化的影响，本实验采用免疫组织化学染色的方法考察了实施例1组对糖尿病小鼠海马区Iba-1表达的影响，结果显示，模型组小鼠海马小胶质细胞标记物Iba-1阳性细胞数为21.3±3.2个较正常组11.7±1.1个有极显著性差异(P<0.01)，实施例1组的小胶质细胞标记物Iba-1阳性细胞数为15.3±1.5个，较模型组显著减少(P<0.05)，结果见表5。实验结果进一步表明，本发明中药能抑制糖尿病小鼠小胶质细胞活化。
表5对糖尿病小鼠海马区Iba-1阳性细胞数的影响(
Figure BDA0003150448200000111
n＝6)
Figure BDA0003150448200000112
*与正常组比较P＜0.05；**与正常组比较P＜0.01；
#与模型组比较P＜0.05；##与模型组比较P＜0.01；
实验例4
1、ELISA法检测血清及脑组织KYN、3-HK、QUIN、KYNA含量
采用实验例1中的动物实验方法，将小鼠分为4组，即：正常组(CON)、模型组(MOD)、实施例1高剂量组(ZBH)、实施例1低剂量组(ZBL).给药结束后，无水乙醚麻醉小鼠，摘眼球采血，置于4℃离心机3000转/分钟离心15分钟，小心吸取上次上清液获得血清。脑匀浆制备：将脑组织放入塑料小皿，按照1:5(mg/μL)的比例加入生理盐水，初步剪碎后转移到1.5mL ep管中，超声匀浆仪匀浆，35％的力度，30s匀浆两次。随后4℃，3000rpm/min，离心15min，吸取上清液。采用ELISA试剂盒分别检测实验各组小鼠血清以及脑组织KYN、KYNA、3-HK、QUIN的含量。
附图2、3结果表明，糖尿病模型小鼠脑组织KYN、3-HK、QUIN升高，KYNA降低，与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；给药后，与模型组相比，实施例1高剂量组能显著降低脑组织KYN、3-HK、QUIN含量，升高KYNA(P<0.05)。以上结果提示本发明中药能显著减少脑内具有神经毒性的KYN、3-HK和QUIN含量，增加有神经保护作用的KYNA水平。
2、对糖尿病认知功能障碍小鼠脑皮层AGEs含量的影响
采用给药结束后，乙醚麻醉小鼠，快速用预冷的生理盐水约200mL灌洗脑组织，之后剪开头部皮肤和颅骨，暴露全脑小心将全脑取出，分离各组小鼠双侧大脑皮层，以生理盐水作匀浆介质，按l g:9mL比例在冰盘中用匀浆器充分研磨，以3000r/min离心10min后取上清液，ELisa试剂盒检测糖尿病认知功能障碍小鼠脑皮层AGEs的含量。
有文献报道糖尿病状态下脑内AGEs含量有所增加，其在糖尿病认知功能障碍的发展中扮演着重要作用，大量研究表明晚期糖基化终末产物(AGEs)水平升高是糖尿病慢性并发症发生的主要机制之一，参与了糖尿病认知功能障碍的发生，AGEs升高会损伤脑血管、神经细胞，进而导致认知功能障碍。本实验结果显示模型组小鼠脑内AGEs含量明显升高，与正常组相比有显著性差异(P<0.01)；与模型组相比较，实施例1高、低剂量组AGEs含量明显降低，有显著性差异(P<0.01)，表明本发明中药能明显的降低糖尿病认知功能障碍小鼠脑内AGEs含量，抑制糖尿病认知功能障碍小鼠脑血管和神经细胞损伤(表6)。
表6对糖尿病认知功能障碍小鼠皮层AGEs含量的影响(
Figure BDA0003150448200000121
n＝10)
Figure BDA0003150448200000122
*与正常组比较：P<0.05；**与正常组比较：P<0.01；
#与模型组比较：P<0.05；##与模型组比较：P<0.01；
实验例5
对糖尿病认知障碍小鼠类淋巴系统清除功能的影响
将10％的水合氯醛腹腔注射(0.01ml/10g)麻醉小鼠后，用刀片将小鼠头颈部的毛发刮干净(尽量不要刮破皮肤)然后将鼠固定在脑立体定位仪上，并尽量使头朝下固定好与颈部成一定的角度(暴露寰状骨)类似于取脑脊液的角度，并在鼠身体下垫好热垫以便在整个操作过程中使小鼠体温保持在37℃左右，并且头部与身体角度大于135℃，然后将毛细玻璃管用微电极拉制仪拉伸成直径在30-60mm的针头，将拉制好的针头套在微量注射器的针尖，用热熔胶枪将两个针头连接处的空隙填满以隔绝空气。接着在避光条件下用生理盐水将Gd-DTPA粉末配制成21mmol/L的液体，然后将Gd-DTPA用微量注射泵以1ul/min的速度吸10ul的Gd-DTPA到微量注射器里，设置好注射速度为1.6ul/min后将注射器固定在脑立体定位仪上。然后剪开头层皮肤，在体视显微镜下用镊子分离头部肌肉层找到小脑延髓池(介于小脑和延髓之间的透明的小三角区域)用止血钳固定好两侧肌肉，调整脑立体定位仪，直到微量注射器的针头垂直对准小脑延髓池。将10μL的Gd-DTPA以1.6μL/min的速度注射入小脑延髓池，在注射完成后留针头5分钟(防止液体外流)，拔出针头并立刻将小鼠固定在小动物核磁共振固定槽里，设置参数重复参数(TR)为16.63ms，回波时间(TE)为2.4ms，翻转角度(flip angle)为20℃，NA＝3FOV＝2.0*2.0*1.0cm，扫描时间：8min 4s，产生图像：0.14*0.14*0.14mm。设置好参数后分别在注射后的15min，25min，35min，45min，60min做连续的扫描，扫描结束后保存图片，并将小鼠伤口缝合放在热垫上保持体温。将MRI结果用SPM8软件将获取的T1加权磁共振成像导出为DICOM文件，并转换为3D NIFTI图像格式。进行头部强度校正，强度归一化，平滑处理，在T1加权磁共振成像上测量的信号变化随时间在预选解剖区来获得顺磁性造影剂的ROI。从近中线矢状面磁共振成像中，在每个半球的4个矢状面切片上绘制ROI，并使用Paravision6.0软件统计平均每个解剖区域的ROI信号值。ROI摄取的区域包括脑桥核、腹侧盖带、嗅球、锥体束四个脑区域。
对糖尿病认知障碍小鼠脑内Dd-DTPA流向及分布的影响：脑组织在核磁影像上显示的是黑色或暗灰色，造影剂钆喷酸葡甲胺(Gd-DTPA)在核磁影像中显示亮白色，颜色越白亮表示剂量越多，因此可以根据Gd-DTPA的流向与分布分辨判断脑脊液的分布与流向。从核磁结果来看Gd-DTPA是沿着椎动脉、基底动脉、大脑前动脉、脑额外侧动脉、脑前内侧动脉、脑前奇动脉和胼胝体周围动脉分布的，这也证实了脑类淋巴系统是伴随脑动脉旁间隙进入脑实质的。从附图4、5结果看，三组Gd-DTPA的分布和流向基本保持一致。与正常CON组相比，模型组(MOD)的Gd-DTPA存留的量更多更集中，并且亮度也更亮，与MOD组相比，实施例1(ZSWF)组的Gd-DTPA量明显减少，亮度也比MOD组暗并接近于CON组。说明在同一时间段Gd-DTPA在DCI组中流速缓慢，给药后Gd-DTPA的流速增加，图4结果显示，各组随时间延长，在4个脑区Gd-DTPA总体呈下降趋势，在脑桥核、腹侧盖带下降速率最快，与CON组相比，MOD组的Gd-DTPA下降趋势较缓，与MOD组相比，实施例1组在脑桥核、腹侧盖带、锥体束脑区下降趋势明显，与CON组相比，在脑桥核、腹侧盖带、嗅球和锥体束脑区，MOD组的Gd-DTPA的ROI明显升高(P<0.05或P<0.01)，与MOD组相比，实施例1组的Gd-DTPA的ROI明显下降并且接近CON组(P<0.05或P<0.01)，结果表明本发明中药能通过改善脑脊液的流速从而改善糖尿病认知障碍小鼠类淋巴系统清除功能障碍。
实验例6
对糖尿病认知障碍小鼠脑血管数目及稳定性的影响
糖尿病导致的脑血管数目和结构的异常变化在认知障碍的发生过程中扮演着重要的角色，遂检测本发明中药对脑血管数目及稳定性的影响。
采用免疫组织化学染色法检测，结果显示，与正常组(CON)相比，模型组小鼠脑组织CD31阳性细胞明显增加(p<0.01)；与模型组相比，实施例1组CD31阳性细胞数量亦显著增加(p<0.01)，本发明中药可增加糖尿病认知障碍小鼠脑微血管数目。
表7对糖尿病认知障碍小鼠脑血管数目的影响
Figure BDA0003150448200000141
免疫组织化学结果显示，相比于正常组(CON)，模型组小鼠脑α-SMA的光密度值显著降低(p<0.01)；与糖尿病认知障碍小鼠相比较，实施例1组脑α-SMA的光密度值明显升高(p<0.01)。WB实验结果显示，与正常组比较，糖尿病认知障碍组小鼠脑α-SMA蛋白显著降低(p<0.01)，而给予实施例1组治疗可以明显增加糖尿病认知障碍小鼠脑α-SMA蛋白表达(p<0.01)。以上实验结果提示，在糖尿病认知障碍状态下，脑新生血管的稳定性降低，而本发明中药可以增加新生血管稳定性，使其发展为成熟稳定功能性血管。
表8对糖尿病认知障碍小鼠脑血管稳定性的影响
Figure BDA0003150448200000151
实验例7
本发明采用链脲霉素复合高脂饮食方法复制糖尿病脑病模型。实验选取12周龄健康雄性C57BL/6J小鼠，适应性饲养后，初步筛除部分不符合水迷宫游泳实验的小鼠，剔除比例20％。然后其中15只小鼠给予正常饲料，其余实验小鼠给予高脂饲料喂养3周后，单次腹腔注射链脲霉素120mg每千克体重，正常对照组注射等量缓冲盐溶液(0.1mol/L新鲜柠檬酸钠缓冲液，pH 4.5)，给药体积为0.1mL/10g。给予链脲霉素一周后，选择空腹血糖值大于11.1mmol/L的小鼠进行后续实验。除正常组外，其余组小鼠继续给高脂饲料8周后水迷宫实验筛选脑病小鼠入组。小鼠随机分为模型组(Mod组)、实施例1组(ZBH组)，抗生素组(ATM组)，实施例1与抗生素合用组(ZBH+ATM组)共4组，正常组(CON)。其中抗生素组为新霉素5mg/ml、游霉素5mg/ml和杆菌肽1.25ug/ml。每组15只。
各组小鼠在10周末进行水迷宫测试。Morris水迷宫设置及实验方法：
1)定位航行实验：首先，在正式开展实验前一天给小鼠试游以适应环境，水温控制在23摄氏度左右。
正式开始水迷宫实验后，在水迷宫底部放置一个直径为十公分的站台，站台没入水下1公分左右。使小鼠看不见站台位置只能依靠记忆力找到站台后才可以上台。将小鼠面朝水迷宫壁放入水中，入水点保持一致，排除噪音干扰的情况下，用电脑记录小鼠上台时间。正常小鼠在经过5天训练后能够学会以最优的轨迹搜索至站台位置。然而模型组小鼠学习记忆能力受损，不能记住平台的具体位置，上台时间缓慢或者不上台。
2)空间探索实验：记录鼠在1min内的移动轨迹，记录实验小鼠在目标象限的停留时间以及穿越目标象限次数，检测实验小鼠的空间定位能力，及在空间探索过程中的变化规律。
数据采集由图像自动监视和处理系统完成。
实验结果如附图6-9所示，第1次水迷宫定位航行实验模型组小鼠与实施例1组小鼠的逃避潜伏期未见有明显差异。从第4次起，与正常小鼠相比，模型组小鼠的逃避潜伏期显著增长(P<0.05)；与模型组相比，实施例1组小鼠的逃避潜伏期则有不同程度缩短。结果提示本发明中药具有改善认识障碍小鼠学习记忆能力的作用。加入抗生素后治疗效果减弱。
首次到达平台时间：与正常组相比模型组首次达到平台时间明显延长，与模型组相比服用实施例1药物后，首次达到平台时间明显缩短，其余各组间无显著差异。
平台象限停留时间：与正常组相比模型组平台象限停留时间显著缩短，与模型组相比服用实施例1药物后，有延长平象限停留时间的趋势但无统计学差异。
穿越平台次数：与正常组相比模型组穿越平台次数显著减少，与模型组相比，服用实施例1药物后，有增加穿越平台次数的趋势但无统计学差异。
水迷宫结果结论：本发明中药能增强糖尿病小鼠学习记忆功能，改善糖尿病小鼠认知障碍,而抗生素能减弱药物的作用。
实验例8
将上述实验例7实验中，各组小鼠在取材之前禁食12小时，采取目内眦取血的方法，取1ml左右血液注入消毒后的离心管中，3000r/min离心15min。取上层血清分装于50μl消毒离心管中，做好号码标记，-80℃储存。采用ELISA试剂盒分别检测BDNF、IL-1、IL-6、TNF-α的含量水平，考察本发明中药对糖尿病小鼠血清生长因子的影响。
实验结果如附图10所示，与正常组相比，2型糖尿病小鼠血清中的炎性因子水平明显升高，给药后血清炎性因子BDNF、IL-1、IL-6、TNF-α的含量水平下降明显。因而，本发明中药具有抗炎作用。
实验例9
本实验样本为实验7给药后期所取各组实验小鼠的粪便。事先将收集所用器械及耗材经过高压灭菌或紫外照射，收集过程于超净台中进行，抓取小鼠时，用镊子取其应激反应产生的新鲜粪便，及时放置于灭菌后的1.5mL离心管中，盖上标记置于冰盒中，每更换小鼠需将镊子经过酒精灯进行灭菌处理。后将样本转置-80℃冰箱保存待用。对粪便菌群进行16S rDNA的V3-V4的PCR扩增和高通量测序，通过BLAST比对或者是将16SrDNA序列聚类成分类操作逻辑单元(OTU)，根据OTU的数目和序列数分析得出微生物多样性和物种的丰度，并估计微生物群落的物种构成。
实验结果如附图11所示，服用实施例1组小鼠肠道中Faecalibacterium，Lactobacillus(乳酸杆菌)，Ruminococcus(瘤胃)属，普氏菌，酪酸梭菌等益生菌大量增加。Streptococcus，Macrococcus，Acinetobacter属菌等条件治病菌或病原菌较模型组大量减少，研究证实此类菌属具有破坏肠黏膜屏障，促炎症发应的作用。因此，本发明中药具有保护肠粘膜，降低炎症反应的作用。药物对肠道菌群的调节，尤其是增加普氏菌，酪酸梭菌等益生菌，降低炎症反应。
实验例10
对糖尿病小鼠肠黏膜免疫屏障的影响
采用实验例7方法制备2型糖尿病模型小鼠，随机分为5组：模型组(MOD组)，知母黄柏(对比例1)组(ZB组)，通关丸组(由知母、黄柏和肉桂组成)(TGW组)，实施例1组(ZSW组)，小檗碱组(BBR组)每组15只。模型组及正常组(CON组)给予等量蒸馏水，每日一次，连续灌胃给药10周。分别采用ELISA法检测小肠粘液SIgA、ELISA法检测小肠黏蛋白MUC2的含量、AB-PAS染色检测回肠杯状细胞光密度值。
ELISA法检测小肠粘液SIgA：取靠近回盲部小肠肠段5cm，平铺在滤纸上，纵向剖开，然后刮取肠道内容物及黏液于EP管中，加入500μl的0.9％Nacl充分匀浆，12000r/min，15min，4℃取上清，按ELISA试剂盒说明书进行粘液SIgA的测定。
ELISA法检测小肠黏蛋白MUC2的含量：肠组织匀浆：将组织切成小块，均匀的放进放置在冰上的装有新鲜裂解缓冲液的玻璃均质器中(质量体积比＝1:20-1:50，例如：1ml裂解缓冲液中加入20-50mg组织样本。)将得到的悬浊液经过超声处理至澄清。将制备好的匀浆液10000r/min离心5分钟，弃沉淀，上清即可用于检测。
结果如图12所示，与正常组相比，模型组、知柏组、小檗碱组小鼠小肠粘液SIgA含量均显著降低(P＜0.01或P＜0.05)，实施例1组无显著性差异；与模型组比较，通关丸组和实施例1组均显著升高(P＜0.05)；与知柏组比较，实施例1组极显著升高(P＜0.01)。
结果如图13所示，与正常组相比，模型组、知柏组、通关丸组、小檗碱组小鼠回肠黏蛋白MUC2含量均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，实施例1组无显著性差异；与知柏组比较，实施例1组显著升高(P＜0.05)；与通关丸组比较，实施例1组极显著升高(P＜0.01)。
结果如图14所示，应用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件，在相同的放大倍数下进行图像分析，对AB-PAS染色的切片选取4个绒毛上的杯状细胞来检测其染色的平均光密度值Density Mean分析，选取的绒毛大小基本一致。
与正常组相比，模型组和知柏组小鼠回肠杯状细胞光密度值均极显著降低(P＜0.01)，实施例1组极显著升高(P＜0.01)；与模型组比较，知柏组、通关丸组无显著性差异，实施例1组极显著升高(P＜0.01)；与知柏组比较，实施例1组极显著升高(P＜0.01)；与通关丸组比较，实施例1组极显著升高(P＜0.01)。
因此，糖尿病模型组小鼠小肠黏膜分泌SIgA的含量、MUC2以及杯状细胞光密度值，明显降低，小肠黏膜免疫功能遭到严重损伤；给药组中的通关丸组和实施例1组均对其有改善作用，但是只有实施例1组与正常对照组相比无显著性差异。相对现有的组方，本发明的中药组方可以显著提高小肠粘液SIgA含量、MUC2的表达以及杯状细胞光密度值的增加，保护小肠黏膜免疫屏障。

Claims (10)

1.一种预防或治疗糖尿病脑病的口服中药组合物，其特征在于：按重量份数由下述原料制成：知母6-60份，黄柏6-60份、肉苁蓉6-60份 。
2.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于：其重量份优选知母8-56份，黄柏8-56份、肉苁蓉8-56份；或者知母15-48份，黄柏15-48份、肉苁蓉10-20份；或者知母15-36份，黄柏15-36份、肉苁蓉10-20份。
3.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：将各原料药粉碎后，加水或低级醇或低级醇和水的混合溶剂提取。
4.如权利要求4所述的中药组合物，其特征在于：所述低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇中的一种或多种，优选乙醇。
5.如权利要求1-4任意一项所述的中药组合物，其特征在于：所述中药组合物剂的型选自散剂、汤剂、合剂、颗粒剂、胶囊、片剂、配方颗粒。
6.权利要求1-4任意一项所述的中药组合物在制备预防或治疗糖尿病脑病药物中的应用。
7.如权利要求6所述应用，其特征在于：所述脑病为痴呆，所述痴呆为血管痴呆、阿尔茨海默。
8.权利要求1-4任意一项所述的中药组合物在制备预防或治疗糖尿病脑病海马损伤、糖尿病脑病的神经炎症药物中的应用。
9.权利要求1-4任意一项所述的中药组合物在制备减少糖尿病脑病的脑血管和神经细胞损伤、改善糖尿病脑病的脑血管新生障碍、改善糖尿病脑病的类淋巴系统清除功能障碍、抑制糖尿病脑病的海马区小胶质细胞活化、改善糖尿病脑病的小肠黏膜屏障损伤、和/或改善小肠黏膜免疫屏障损伤或小肠黏膜机械屏障损伤药物中的应用。
10.权利要求1-4任意一项所述的中药组合物在制备预防或治疗糖尿病脑病患者肠道菌群失调药物，优选糖尿病患者肠道益生菌减少和肠道致病菌增加，所述肠道益生菌选自Faecalibacterium，Lactobacillus（乳酸杆菌），Ruminococcus（瘤胃）属，普氏菌，酪酸梭菌中的一种或多种，优选普氏菌和酪酸梭菌，所述肠道致病菌选自Streptococcus，Macrococcus，Acinetobacter属菌的一种或多种中的应用。
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