CN105954376B - 一种从禽和猪组织中提取哌嗪残留并衍生化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及兽药残留检测领域，具体涉及一种禽和猪组织中哌嗪残留的提取、净化和衍生化的方法。该方法是以纯乙腈为提取剂，正己烷为去脂剂，使用加速溶剂萃取仪(ASE)处理组织样品，在线去脂与哌嗪提取连续进行，所得提取液经固相萃取法净化、真空离心浓缩仪浓缩以及乙酸酐法柱前衍生。经提取、净化和衍生化的样品通过气相色谱串联质谱(GC‑MS/MS)进行确证分析。本发明哌嗪的提取回收率均达到90％以上。

Description

一种从禽和猪组织中提取哌嗪残留并衍生化的方法
技术领域
本发明涉及兽药残留检测领域，具体涉及一种禽和猪组织中哌嗪残留的加速溶剂萃取法提取、固相萃取法净化和乙酸酐法柱前衍生化的方法。
背景技术
在对动物源性食品中的兽药进行检测时，只有将药物从样本中提取出来，才可能建立起高效的检测方法。无水哌嗪为透明针状或叶状结晶，无臭，具有吸湿性和典型的氨臭味，在空气中吸收水分和二氧化碳，易溶于水和甘油，微溶于乙醇，不溶于乙醚。国内外关于哌嗪的提取方法有许多报道，提取剂一般为甲醇、乙腈、三氯乙酸溶液和高氯酸溶液等，且提取方法以传统常温、常压下液-液萃取为主。近年来，前处理方法的优化以萃取溶剂及其比例的优化为主，尚未有加速溶剂萃取法(高温、高压条件下)应用于禽和猪组织中哌嗪残留提取的相关报道。由于哌嗪分子结构中具有两个亚氨基，极性较强，在气相色谱分离中峰形较差，有严重拖尾现象，故直接将哌嗪分子应用于气相色谱串联质谱确证分析的研究与应用尚未见报道。
发明内容
为了对禽和猪组织中哌嗪残留的传统提取方法进行改进，提高效率，提升自动化水平，并适应气相色谱-串联质谱法检测的需求，本试验建立了一种加速溶剂萃取法提取、固相萃取法净化和乙酸酐法衍生化的前处理方法体系，该方法简单、方便、快速，有机试剂用量少，提取回收率高。
本发明的技术方案是：该方法是以纯乙腈为提取剂，正己烷为去脂剂，使用加速溶剂萃取仪(ASE)处理组织样品，在线去脂与哌嗪提取连续进行，所得提取液经固相萃取法净化、真空离心浓缩仪浓缩以及乙酸酐法柱前衍生。
一种从禽和猪组织中提取哌嗪残留并衍生化的方法，包括加速溶剂萃取仪提取、固相萃取净化、柱前乙酸酐法衍生化的步骤。即使用加速溶剂萃取仪在80℃和1500psi压力条件下分两步操作，第一步正己烷去脂，第二步纯乙腈萃取哌嗪；萃取液过SPE固相萃取小柱净化，收集液经真空离心浓缩后复溶并转入玻璃小瓶进行衍生化反应(乙酸酐法)。
加速溶剂萃取仪提取的步骤是：纯乙腈作为提取溶剂，样品依次与无水硫酸钠、硅藻土混匀装填入萃取池，在80℃和1500psi条件下，在线正己烷去脂与哌嗪萃取连续进行，自动化提取。进一步地：将均质好的组织样品，在研钵中与3.0g无水硫酸钠研磨混匀吸收样品水分，再加入3.0g左右硅藻土研磨至粉状混匀，装填入22mL不锈钢萃取池，在80℃和1500psi压力条件下静态萃取5min，氮气吹扫60s，每个萃取池萃取两次，第一次使用正己烷，去脂用，收集液弃掉，第二次萃取液收集于60mL收集瓶，转移至50mL离心管，即得提取液。
固相萃取净化步骤：提取液过Strata-X-C固相萃取小柱，依次用3mL甲醇、3mL2.0％甲酸水溶液将SPE小柱活化平衡，上样后待提取液匀速流干后，再依次用3mL 0.1mol/L的盐酸水溶液、3mL 0.1mol/L的盐酸甲醇淋洗，待小柱干燥后，最终用2mL 5.0％氨水甲醇分两次进行洗脱，收集洗脱液于2mL具塞离心管中。
柱前乙酸酐法衍生化的步骤：将上述装有净化收集液的具塞离心管，置于离心浓缩仪中，40℃真空负压浓缩至干，后加入1.0mL二氯甲烷溶解残渣，涡旋混匀后，转移至10mL玻璃小瓶，并加入50μL乙酸酐和100μL三乙胺，拧紧瓶盖，于50℃温度下衍生30min后取出，冷却至室温，衍生后液体并洗涤液转移至2mL具塞离心管，涡旋振荡使基质混匀，12000×g，常温离心10min，将上层清液过0.22μm滤膜，滤液供GC-MS/MS测定分析。
与传统萃取方式不同，本发明采用加速溶剂萃取技术，即在高温、高压条件下(80℃，1500psi)完成去脂与目标物(哌嗪)的提取过程。高温条件增加了溶剂对样品的溶解能力，提高了样品的扩散速度，降低了溶剂的粘度，这意味着溶剂渗透入基质内空隙更加容易。另外，在高压条件可以加快整体萃取速度，液体泵入填充体内更加容易，从而更充分接触其中的目标萃取物。基于以上内容，高温和高压的结合使得萃取更加快速和完全。
有益效果：对比了液-液提取以及加速溶剂萃取仪(ASE350)不同提取方式，在纯有机试剂作为萃取试剂时的哌嗪的添加回收率，发现常温、常压下，回收率在20～60％左右，而采用加速溶剂萃取仪在一定的温度(80℃)和压力(1500psi)条件下，以二氯甲烷为萃取溶剂时，回收率在90％以上。表明萃取液极性较大时，回收率较高，且高温高压下，乙腈的萃取效率高于二氯甲烷。不同的提取方法和提取试剂对禽(以鸡组织为代表)和猪组织中哌嗪提取回收率的影响(100.00μg/kg哌嗪添加量)见表1。
表1不同提取方法和提取试剂对哌嗪提取回收率的比较(％)
具体实施方式
1.试验家禽和猪的饲养和样品采集
分别选取上市日龄三元杂交猪和家禽，即16周龄京海黄鸡、10周龄扬州鹅、8周龄樱桃谷鸭各12羽以及6月龄杜×长×大三元杂交猪6头，公、母各半，单笼(栏)饲养，饲喂不含任何药物的全价饲料，自由饮水。饲养2周后屠宰时分别取供试动物的肌肉、肝脏、肾脏和皮肤和脂肪组织作为空白组织样品，-35℃保存，使用时将该样品绞碎使之均质。
2.本发明提取、净化与衍生化步骤
1)准确称取(2.0±0.02)g均质好的空白组织样品，在研钵中与3.0g无水硫酸钠研磨混匀吸收样品水分；
2)再加入3.0g左右硅藻土研磨至粉状混匀后，装填入22mL不锈钢萃取池；
3)在80℃和1500psi条件下，静态萃取5min。每个萃取池萃取两次(各5min)，第一次使用正己烷，去脂用，收集液弃掉，第二次使用纯乙腈，萃取用，萃取液收集于60mL收集瓶，转移至50mL离心管使用纯乙腈；
4)依次分别用3.0mL甲醇和3.0mL 2.0％甲酸水溶液将混合阳离子固相萃取小柱(Strata-X-C)活化；
5)向活化后的固相萃取小柱中加入提取液，匀速流干后，依次用3mL 0.1mol/L的盐酸水溶液和3mL 0.1mol/L的盐酸甲醇淋洗；
6)待固相萃取小柱干燥后，用2mL 5.0％氨水甲醇分两次进行洗脱，将哌嗪洗脱至2mL离心管中；
7)将离心管置于离心浓缩仪中，40℃真空负压浓缩至干；
8)加入1.0mL二氯甲烷溶解残渣，涡旋混匀后，转移至10mL玻璃小瓶；
9)加入50μL乙酸酐和100μL三乙胺，拧紧瓶盖，于50℃温度下衍生30min；
10)衍生后液体并洗涤液转移至2mL具塞离心管，涡旋振荡使基质混匀，12000×g，常温离心10min，将上层清液过0.22μm滤膜，滤液供GC-MS/MS测定分析。
3回收率和精密度的测定
准确称取2.0g匀质后的空白组织样品于研钵中，与无水硫酸钠和研磨混匀后，依次添加10.00mg/L浓度标准工作液1、10、20、100、200和400μL(相当于空白组织样品中哌嗪添加浓度为5.00(LOQ)、50.00、100.00、500.00、1000.00和2000.00μg/kg)，并用二氯甲烷补足液体至总体积相等，再次与硅藻土研磨混匀装填入22mL萃取池，每个添加水平设置6个平行，，经提取、净化和衍生化方法处理后，在以下描述的气相色谱和质谱分析条件(3.1)下，进行气相色谱串联质谱(GC-MS/MS)分析。
日内精密度测定：在同日内不同时间用同一条标准曲线及同一台仪器6次重复测定添加浓度分别为5.00(LOQ)、50.00、100.00、500.00、1000.00和2000.00μg/kg的样品，求得日内(批内)精密度。
日间精密度测定：在一周内不同日以不同的标准曲线及同一台仪器6次重复测定上述浓度的样品，求得日间(批间)精密度。
3.1GC-MS/MS分析条件
3.1.1气相色谱条件
色谱柱：色谱柱：TG-5MSAmine(30m×0.25mm i.d.×0.25μm)；载气：高纯氦气(>99.999％，60psi)，载气柱流速：1.0mL/min；程序升温参数：80℃保持1min，20℃/min升至280℃，保持1min。进样口温度：280℃；分流模式：不分流进样，分流流量：50.0mL/min；2min后开阀(载气节省时间2min，载气节省流量20mL/min)；不分流时间：1.0min；进样体积：1.0μL。
3.1.2质谱条件
电离模式：电子轰击(EI)；电子束能量(电离能)：70eV；碰撞气：高纯氩气(>99.999％，40psi)；离子源温度：280℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟：4.0min；采集数据方式：全扫描(SCAN)和选择离子监测(SIM)方式定性，选择反应监测(Auto SRM)方式定量。哌嗪衍生产物的分子量和质谱参数见表2。
表2哌嗪的分子量和质谱参数
注：*定量离子对
将添加样品所得定量子离子(m/z 170.1>68.1)的峰面积代入标准曲线中求得浓度，与实际添加的分析物的浓度相比求得添加回收率。
在此条件下，本发明方法提取禽和猪组织中哌嗪的添加回收率及精密度见表4-7。
表4鸡组织中哌嗪的添加回收率及精密度(n＝6)
表5鸭组织中哌嗪的添加回收率和精密度(n＝6)
表6鹅组织中哌嗪的添加回收率和精密度(n＝6)
表7猪组织中哌嗪的添加回收率和精密度(n＝6)
。

Claims (1)

1.一种从禽和猪组织中提取哌嗪残留并衍生化的方法，其特征在于，包括(1)加速溶剂萃取仪提取、(2)固相萃取净化、(3)柱前乙酸酐法衍生化的步骤；其中：
步骤(1)加速溶剂萃取仪提取是：使用加速溶剂萃取仪在80℃和1500psi压力条件下分两步操作，第一步正己烷去脂，第二步纯乙腈萃取哌嗪；其中纯乙腈作为提取溶剂，样品依次与无水硫酸钠、硅藻土混匀装填入萃取池，在80℃和1500psi条件下，在线正己烷去脂与哌嗪萃取连续进行，自动化提取；
步骤(2)固相萃取净化具体是：经步骤(1)所得的萃取液过Strata-X-C固相萃取小柱，先依次用3mL甲醇、3mL 2.0％甲酸水溶液将SPE小柱活化平衡，上样后待提取液匀速流干后，再依次用3mL 0.1mol/L的盐酸水溶液、3mL 0.1mol/L的盐酸甲醇淋洗，最终待小柱干燥后，用2mL 5.0％氨水甲醇分两次进行洗脱；收集洗脱液于具塞离心管中；
步骤(3)柱前乙酸酐法衍生化是：将装有净化收集液的具塞离心管，置于离心浓缩仪中，40℃真空负压浓缩至干，后加入1.0mL二氯甲烷溶解残渣，涡旋混匀后，转移至10mL玻璃小瓶，并加入50μL乙酸酐和100μL三乙胺，拧紧瓶盖，于50℃温度下衍生30min后取出，冷却至室温，衍生后液体并洗涤液转移至2mL具塞离心管，涡旋振荡使基质混匀，12000×g，常温离心10min，将上层清液过0.22μm滤膜，滤液供GC-MS/MS测定分析。
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