CN105954370B - 一种检测禽和猪组织中哌嗪残留的确证分析方法 - Google Patents
一种检测禽和猪组织中哌嗪残留的确证分析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105954370B CN105954370B CN201610246436.8A CN201610246436A CN105954370B CN 105954370 B CN105954370 B CN 105954370B CN 201610246436 A CN201610246436 A CN 201610246436A CN 105954370 B CN105954370 B CN 105954370B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- piperazine
- tissue
- extraction
- sample
- fowl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
- G01N2030/025—Gas chromatography
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明涉及兽药残留检测领域，具体涉及一种高效检测禽和猪组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮脂)中哌嗪残留的确证分析方法。该方法是将组织样品经过加速溶剂萃取法提取、净化和衍生化处理后，用气相色谱‑串联质谱法(GC/MS‑MS)进行检测。本发明在回收率、精密度和灵敏度三个方面与其他检测方法进行比较，具有简单、快速、准确和灵敏的优点。
Description
技术领域
本发明涉及兽药残留检测领域，具体涉及一种检测禽和猪组织中哌嗪残留的确证分析方法。
背景技术
目前国内外对哌嗪的残留检测方法虽有不少报道，主要有重量分析法、比色法、非水滴定法、气相色谱法、高效液相色谱法和(超)高效液相色谱-串联质谱法等，但重量分析法、比色法和非水滴定法不适合生物样品中哌嗪的检测，灵敏度较低。在液相色谱上，哌嗪无发光基团，不能直接被紫外检测器或荧光检测器检测，故常通过柱前衍生使哌嗪带上特定基团，从而使检测成为可能。而到目前为止，通过较为简单的乙酸酐柱前衍生法检测动物组织中哌嗪残留的气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)的研究国内、外均尚未见报道。
发明内容
为了能检测并确证哌嗪在禽和猪组织中的残留，满足欧盟标准，本发明提供了一种气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)，能快速、准确地检测禽和猪组织中哌嗪的残留。
本发明所采用的技术方案是：一种检测禽和猪组织中哌嗪残留的确证分析方法，是将组织样品经过提取、净化和柱前衍生化后，进行气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)检测。以高纯氦气(99.999％)为载气，流速为1.0mL/min，程序升温模式，不分流进样，进样体积：1.0μL。采用电子轰击(EI)离子源，全扫描(SCAN)和选择离子监测(SIM)方式定性，选择反应监测(Auto SRM)方式定量。
所述的禽和猪组织样品提取、净化和衍生化具体内容是：将均质好的组织样品，在研钵中与3.0g无水硫酸钠研磨混匀吸收样品水分，再加入3.0g左右硅藻土研磨至粉状混匀，装填入加速溶剂萃取仪22mL不锈钢萃取池中，在80℃和1500psi压力条件下静态萃取5min，氮气吹扫60s，每个萃取池萃取两次，第一次使用正己烷，去脂用，收集液弃掉，第二次萃取液收集于60mL收集瓶，转移至50mL离心管，即得提取液。
提取液过Strata-X-C固相萃取小柱，依次用3mL甲醇、3mL 2.0％甲酸水溶液将SPE小柱活化平衡，上样后待提取液匀速流干后，再依次用3mL 0.1mol/L的盐酸水溶液、3mL0.1mol/L的盐酸甲醇淋洗，待小柱干燥后，最终用2mL 5.0％氨水甲醇分两次进行洗脱，收集洗脱液于2mL具塞离心管中。
将上述装有净化收集液的具塞离心管，置于离心浓缩仪中，40℃真空负压浓缩至干，后加入1.0mL二氯甲烷溶解残渣，涡旋混匀后，转移至10mL玻璃小瓶，并加入50μL乙酸酐和100μL三乙胺，拧紧瓶盖，于50℃温度下衍生30min后取出，冷却至室温，衍生后液体并洗涤液转移至2mL具塞离心管，涡旋振荡使基质混匀，12000×g，常温离心10min，将上层清液过0.22μm滤膜，滤液供GC-MS/MS测定分析。
本发明在回收率、精密度和灵敏度三个方面与其他检测方法进行比较，本方法具有简单、快速、准确和灵敏的优点。
附图说明
图1哌嗪衍生后产物(1,4-二乙酰基哌嗪)质谱图。
图2哌嗪标准工作曲线(n＝7)。
图3空白鸡组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品的总离子流图(TIC)和定量离子的质量色谱图(MC)。
图4空白鸡组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品添加100.00μg/kg标准品的混合总离子流图(MIC)和定量离子总离子流图(TIC)。
图5空白鸭组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品的总离子流图(TIC)和定量离子的质量色谱图(MC)。
图6空白鸭组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品添加100.00μg/kg标准品的混合总离子流图(MIC)和定量离子总离子流图(TIC)。
图7空白鹅组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品的总离子流图(TIC)和定量离子的质量色谱图(MC)。
图8空白鹅组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品添加100.00μg/kg标准品的混合总离子流图(MIC)和定量离子总离子流图(TIC)。
图9空白猪组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品的总离子流图(TIC)和定量离子的质量色谱图(MC)。
图10空白猪组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品添加100.00μg/kg标准品的混合总离子流图(MIC)和定量离子总离子流图(TIC)。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
1.试验家禽和猪的饲养和样品采集
分别选取上市日龄三元杂交猪和家禽，即16周龄京海黄鸡、10周龄扬州鹅、8周龄樱桃谷鸭各12羽以及6月龄杜×长×大三元杂交猪6头，公、母各半，单笼(栏)饲养，饲喂不含任何药物的全价饲料，自由饮水。饲养2周后屠宰时分别取供试动物的肌肉、肝脏、肾脏和皮肤和脂肪组织作为空白组织样品，-35℃保存，使用时将该样品绞碎使之均质。
2.本发明提取、净化与衍生化步骤
1)准确称取(2.0±0.02)g均质好的空白组织样品，在研钵中与3.0g无水硫酸钠研磨混匀吸收样品水分；
2)再加入3.0g左右硅藻土研磨至粉状混匀后，装填入22mL不锈钢萃取池；
3)在80℃和1500psi条件下，静态萃取5min。每个萃取池萃取两次(各5min)，第一次使用正己烷，去脂用，收集液弃掉，第二次使用纯乙腈，萃取用，萃取液收集于60mL收集瓶，转移至50mL离心管使用纯乙腈；
4)依次分别用3.0mL甲醇和3.0mL 2.0％甲酸水溶液将混合阳离子固相萃取小柱(Strata-X-C)活化；
5)向活化后的固相萃取小柱中加入提取液，匀速流干后，依次用3mL 0.1mol/L的盐酸水溶液和3mL 0.1mol/L的盐酸甲醇淋洗；
6)待固相萃取小柱干燥后，用2mL 5.0％氨水甲醇分两次进行洗脱，将哌嗪洗脱至2mL离心管中；
7)将离心管置于离心浓缩仪中，40℃真空负压浓缩至干；
8)加入1.0mL二氯甲烷溶解残渣，涡旋混匀后，转移至10mL玻璃小瓶；
9)加入50μL乙酸酐和100μL三乙胺，拧紧瓶盖，于50℃温度下衍生30min；
10)衍生后液体并洗涤液转移至2mL具塞离心管，涡旋振荡使基质混匀，12000×g，常温离心10min，将上层清液过0.22μm滤膜，滤液供GC-MS/MS测定分析。
3试验条件
3.1气相色谱条件
色谱柱：色谱柱：TG-5MSAmine(30m×0.25mm i.d.×0.25μm)；载气：高纯氦气(>99.999％，60psi)，载气柱流速：1.0mL/min；程序升温参数：80℃保持1min，20℃/min升至280℃，保持1min。进样口温度：280℃；分流模式：不分流进样，分流流量：50.0mL/min；2min后开阀(载气节省时间2min，载气节省流量20mL/min)；不分流时间：1.0min；进样体积：1.0μL。
3.2质谱条件
电离模式：电子轰击(EI)；电子束能量(电离能)：70eV；碰撞气：高纯氩气(>99.999％，40psi)；离子源温度：280℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟：4.0min；采集数据方式：全扫描(SCAN)和选择离子监测(SIM)方式定性，选择反应监测(Auto SRM)方式定量。哌嗪衍生产物(1,4-二乙酰基哌嗪)的分子量和质谱参数见表1，质谱图见附图1。
表1哌嗪的分子量和质谱参数
注：*定量离子对
4定量方法与定性方法
4.1标准曲线的绘制
准确吸取10.00mg/L浓度哌嗪标准工作液1、10、20、50、100、200和400μL(复溶后，相当于添加哌嗪浓度为5.00、50.00、100.00、250、500.00、1000.00和2000.00μg/kg)，并用二氯甲烷补足溶液至总体积相等，再依次迅速加入50μL乙酸酐和100μL三乙胺，拧紧瓶盖，50℃烘箱中衍生30min。在优化好的气相色谱和质谱条件下，进行GC-MS/MS检测。以基质标准工作液的浓度为横坐标(x)，定量离子对m/z170.1＞68.1的峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，以此曲线作为待测样品的定量曲线，并得出其回归方程和决定系数见表2，标准曲线见附图2。若待测样品的浓度超出了线性范围，则应将被分析样品进行稀释，所得结果乘稀释倍数得原样品浓度。
表2哌嗪的线性回归方程、决定系数和线性范围
由表2和附图2可见，本发明条件下，在标准品浓度为5.00-2000.00μg/kg范围内，哌嗪的定量子离子(m/z 170.1>68.1)的峰面积(y)与其浓度(x)呈线性相关，且线性关系良好。
4.2回收率及精密度的测定
准确称取2.0g匀质后的空白组织样品于研钵中，与无水硫酸钠和研磨混匀后，依次添加10.00mg/L浓度标准工作液1、10、20、100、200和400μL(相当于空白组织样品中哌嗪添加浓度为5.00(LOQ)、50.00、100.00、500.00、1000.00和2000.00μg/Kg)，并用二氯甲烷补足液体至总体积相等，再次与硅藻土研磨混匀装填入22mL萃取池，每个添加水平设置6个平行，经提取、净化和衍生化方法处理后，在上述优化好的气相色谱和质谱分析条件(3.1、3.2)下，进行GC-MS/MS分析。空白鸡组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品的总离子流图(TIC)和定量离子的质量色谱图(MC)见图3；空白鸡组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品添加100.00μg/kg标准品的混合总离子流图(MIC)和定量离子总离子流图(TIC)见图4；空白鸭组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品的总离子流图(TIC)和定量离子的质量色谱图(MC)见图5；空白鸭组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品添加100.00μg/kg标准品的混合总离子流图(MIC)和定量离子总离子流图(TIC)见图6；空白鹅组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品的总离子流图(TIC)和定量离子的质量色谱图(MC)见图7；空白鹅组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品添加100.00μg/kg标准品的混合总离子流图(MIC)和定量离子总离子流图(TIC)见图8；空白猪组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品的总离子流图(TIC)和定量离子的质量色谱图(MC)见图9；空白猪组织(肌肉、肝脏、肾脏和皮肤+脂肪)样品添加100.00μg/kg标准品的混合总离子流图(MIC)和定量离子总离子流图(TIC)见图10。
日内精密度测定：在同日内不同时间用同一条标准曲线及同一台仪器6次重复测定添加浓度分别为5.00(LOQ)、50.00、100.00、500.00、1000.00和2000.00μg/kg的样品，求得日内(批内)精密度。
日间精密度测定：在一周内不同日以不同的标准曲线及同一台仪器6次重复测定上述浓度的样品，求得日间(批间)精密度。
将添加样品所得定量子离子(m/z 170.1>68.1)的峰面积代入标准曲线中求得浓度，与实际添加的分析物的浓度相比求得添加回收率。
在此条件下，本发明方法提取禽和猪组织中哌嗪的添加回收率及精密度见表3-6。
表3鸡组织中哌嗪的添加回收率及精密度(n＝6)
表4鸭组织中哌嗪的添加回收率和精密度(n＝6)
表5鹅组织中哌嗪的添加回收率和精密度(n＝6)
表6猪组织中哌嗪的添加回收率和精密度(n＝6)
4.3检测限及定量限的确定
每种组织各取6个平行空白样品进行添加回收试验，通过逐级降低哌嗪的浓度，经提取、净化和衍生化后，GC-MS/MS条件进行分析，得出信噪比(S/N)平均值，重复试验，以子离子的信噪比大于等于10(S/N≥10)时所对应的的添加浓度为定量限(LOQ)；以子离子的信噪比大于等于3(S/N≥3)时所对应的的添加浓度为定量限(LOD)，同时对LOQ浓度点的回收率及相对标准偏差(RSD)进行考察。
根据6个平行空白组织样品的添加回收试验，得到哌嗪在现有条件下的定量限为5.0μg/kg，检测限分别为1.5μg/kg
4.4确定限及检测容量的确定
选取20个空白组织样品(2.0g)，添加添加最大残留限量(MRL)浓度水平(100.00μg/Kg)哌嗪，进行回收试验，经提取、净化和衍生化后，进行GC-MS/MS分析，求得标准差(SD)。CCα和CCβ的计算公式分别为CCα＝MRLs+1.64×SD(α＝5％)和CCβ＝CCα+1.64×SD(β＝5％)。CCα和CCβ均在最大残留限量(100.00μg/Kg)的附近，符合欧盟的规定，完全满足药物残留分析要求。各组织确定限和检测容量结果见表7。
表7不同组织100.00μg/Kg添加水平下的确定限和检测容量
。
Claims (1)
1.一种高效检测禽和猪组织中哌嗪残留的新的确证分析方法，其特征在于，将禽和猪组织样品经过提取、净化和衍生化处理后，用气相色谱-串联质谱法检测；
所述的组织样品提取、净化和衍生化的具体步骤是：均质好的组织样品，在研钵中依次与无水硫酸钠和硅藻土研磨混匀，装入萃取池并在80℃和1500psi条件下萃取，第一次使用正己烷，去脂用，收集液弃掉，第二次使用纯乙腈，萃取用，萃取液收集于收集瓶，转移至离心管，即得提取液；所得提取液过Strata-X-C阳离子固相萃取小柱，先依次用甲醇和2.0％甲酸水溶液将SPE小柱活化平衡，上样后待提取液匀速流干后，再依次用0.1mol/L的盐酸水溶液和0.1mol/L的盐酸甲醇淋洗，待小柱干燥后，用5.0％氨水甲醇洗脱，所得洗脱液经离心浓缩仪40℃真空负压浓缩至干，后用二氯甲烷溶解残渣，涡旋混匀后，转移至衍生小瓶，并加入50μL乙酸酐和100μL三乙胺，拧紧瓶盖，于50℃烘箱中衍生30min后取出，冷却至室温，将衍生后液体并洗液转移至2ml具塞离心管，涡旋振荡使基质混匀，12000×g，常温离心10min，过0.22μm滤膜，滤液供GC-MS/MS测定分析；
气相色谱-串联质谱的条件是：
气相色谱条件
色谱柱：TG-5MSAmine，30m×0.25mm i.d.×0.25μm；载气：高纯氦气>99.999％，60psi，载气柱流速：1.0mL/min；程序升温参数：80℃保持1min，20℃/min升至280℃，保持1min；进样口温度：280℃；分流模式：不分流进样，分流流量：50.0mL/min；2min后开阀；不分流时间：1.0min；进样体积：1.0μL；
质谱条件
电离模式：电子轰击；电子束能量：70eV；碰撞气：高纯氩气>99.999％，40psi；离子源温度：280℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟：4.0min；采集数据方式：全扫描和选择离子监测方式定性，选择反应监测方式定量。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610246436.8A CN105954370B (zh) | 2016-04-20 | 2016-04-20 | 一种检测禽和猪组织中哌嗪残留的确证分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610246436.8A CN105954370B (zh) | 2016-04-20 | 2016-04-20 | 一种检测禽和猪组织中哌嗪残留的确证分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105954370A CN105954370A (zh) | 2016-09-21 |
| CN105954370B true CN105954370B (zh) | 2018-01-09 |
Family
ID=56918051
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610246436.8A Active CN105954370B (zh) | 2016-04-20 | 2016-04-20 | 一种检测禽和猪组织中哌嗪残留的确证分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105954370B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109283268A (zh) * | 2018-09-27 | 2019-01-29 | 甘肃出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心 | 一种苦水玫瑰花水中香气成分的分析方法 |
| CN111693639B (zh) * | 2020-06-12 | 2022-11-18 | 扬州大学 | 一种检测禽组织、禽蛋或猪肉中青霉素g残留的确证分析方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104820045A (zh) * | 2015-05-07 | 2015-08-05 | 扬州大学 | 一种从禽肉中提取哌嗪残留的方法 |
| CN104807906A (zh) * | 2015-05-07 | 2015-07-29 | 扬州大学 | 一种高效检测禽肉中哌嗪残留的方法 |
-
2016
- 2016-04-20 CN CN201610246436.8A patent/CN105954370B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105954370A (zh) | 2016-09-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Milne et al. | High-performance liquid chromatographic determination of morphine and its 3-and 6-glucuronide metabolites: improvements to the method and application to stability studies | |
| CN102735768B (zh) | 一种畜禽粪便中雌激素及其结合体的共检测方法 | |
| CN104807906A (zh) | 一种高效检测禽肉中哌嗪残留的方法 | |
| CN105974041A (zh) | 一种固相微萃取与液相色谱-串联质谱联用检测全氟化合物的方法 | |
| CN105954370B (zh) | 一种检测禽和猪组织中哌嗪残留的确证分析方法 | |
| CN104502515A (zh) | 一种四氯虫酰胺残留量的lc-ms/ms测定方法 | |
| CN104155398A (zh) | 一种检测畜禽毛发中抗病毒药物残留量的方法 | |
| CN108614046A (zh) | 水产品中多西环素及代谢产物的快速提取及检测方法 | |
| CN109655551A (zh) | 一种高效同时检测禽蛋、禽肉及猪肉中甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺多残留的分析方法 | |
| CN104849119A (zh) | 鸡肉中8种糖皮质激素类药物残留检测的前处理方法 | |
| CN105954376B (zh) | 一种从禽和猪组织中提取哌嗪残留并衍生化的方法 | |
| CN110887911B (zh) | 一种动物源食品中克霉唑残留的气相色谱-串联质谱检测方法 | |
| CN108287204A (zh) | 一种高效检测鸡组织、鸡蛋及猪肉中哌嗪残留的分析方法 | |
| CN104849383B (zh) | 快速溶剂萃取-凝胶色谱净化-lc/ms/ms结合测定蜂花粉中硝基咪唑类药物的方法 | |
| Zou et al. | Determination of sulphonamides in animal tissues by high performance liquid chromatography with pre‐column derivatization of 9‐fluorenylmethyl chloroformate | |
| CN103278586A (zh) | 乳制品中双氰胺成分的提取及检测方法 | |
| CN114216983B (zh) | 一种液相色谱串联质谱法检测动物性食品中咪多卡的残留量的方法 | |
| CN106770697B (zh) | 一种塑料制品中氯苯类化合物的测定方法 | |
| CN104502505B (zh) | 一种螺虫乙酯残留量的gc-ei-ms测定方法 | |
| CN104535686B (zh) | 一种腈吡螨酯残留量的gc-nci-ms测定方法 | |
| CN110702812B (zh) | 测定偏苯三酸酐的方法 | |
| CN114200062A (zh) | 一种皮革中四乙二醇二甲醚的检测方法 | |
| CN112305127A (zh) | 一种鸡蛋中五氯酚钠残留量的lc-ms/ms测定方法 | |
| CN108680676A (zh) | 定量检测乳制品中β-受体阻断剂类药物的方法 | |
| CN111693639B (zh) | 一种检测禽组织、禽蛋或猪肉中青霉素g残留的确证分析方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |