CN105950758B - 一种检测人类C-Kit基因11号外显子突变的诊断试剂盒和方法 - Google Patents

一种检测人类C-Kit基因11号外显子突变的诊断试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测人类c‑kit基因突变类型的试剂盒，它包括SEQ ID NO.1～283所示的引物对和SEQ ID NO.284所示的探针。本发明还公开了一种检测人类c‑kit基因11号外显子突变的方法。本发明试剂盒和方法可以准确检测人类c‑kit基因11号外显子的所有突变类型，为GIST患者的用药提供指导，临床应用前景良好。

Description

一种检测人类C-Kit基因11号外显子突变的诊断试剂盒和 方法
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种检测人类C-Kit基因11号外显子突变的诊断试剂盒和方法。
背景技术
胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromaltumors，GIST)是一类起源于胃肠道间叶组织的肿瘤，是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤，多发于中老年患者，男女发病率无明显差异。Mazur等在1983年提出，GIST是一类区别于平滑肌瘤和神经源性肿瘤的独立肿瘤类型，其直接病因是癌基因获得性功能突变。
早期治疗GIST主要依赖手术切除，但是即使肿瘤完全切除，也有很多患者死于肿瘤的复发和转移，而传统的放疗和化疗也没有明显的疗效。靶向药物特别是酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼的出现使得GIST治疗发生了根本性的改变，现在对于GIST的治疗已发展为针对不同病情，采取包括手术、辅助治疗和新辅助治疗的个性化综合治疗。目前临床上治疗GIST的一线靶向药物是格列卫(伊马替尼，诺华制药)，二线药物索坦(舒尼替尼，辉瑞制药)，每个患者年消费均为十余万人民币。
但靶向药物的疗效与有GIST患者有无基因突变及突变位点密切相关，不同的基因突变类型患者，辅助治疗的获益存在差异，因此靶向治疗之前需进行基因检测，以预测靶向治疗的疗效并指导靶向药物种类和剂量的选用。其规范的用药方案已经进入《中国胃肠间质瘤诊断治疗共识》(2013年版)。
GIST患者根据其基因突变类型，可从分子水平分为3类：C-Kit突变型(80～85％)，PDGFRα突变型(5～10％)和野生型GIST(10％)。其中，C-Kit基因位于人染色体4q12-13，全长5230bp，含21个外显子。C-Kit基因的突变形式多样，包括缺失突变、点突变和插入突变，突变位点主要发生在第9号(10％)、11号(70％)、13号(1％)、17号外显子(1％)。
研究表明，C-Kit基因突变不仅可协助明确诊断GIST，而且其突变位点与GIST靶向药物的治疗反应、用药剂量和预后有关。其中，从伊马替尼治疗反应上看，C-Kit基因有突变的GIST病例比C-Kit野生型病例治疗反应效果好，患者肿瘤无明显进展的生存期长；其中，C-Kit基因有突变的GIST病例中，11号外显子突变患者对伊马替尼最敏感，药物疗效最好。因此，检测GIST患者是否出现11号外显子突变，对于指导GIST患者的合理用药，以进行GIST个体化诊疗，具有重要参考价值。
但是，目前检测人类C-Kit基因11号外显子突变，主要是通过传统的测序方式，测序的耗费时间长且成本高，不利用普通的临床检测。即使有少数使用荧光定量PCR法的报道，也是仅对11号外显子的其中某一个位点进行检测，检测位点单一，无法对11号外显子进行多突变位点的全面评估，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的定量PCR检测人类C-Kit基因突变的试剂盒和方法。
C-Kit基因11号外显子是GIST患者中最易发生突变的外显子，突变几乎涉及该外显子的每一个密码子。本发明设计的特定引物，可以用于检出已知11号外显子的所有突变类型。
C-Kit基因11号外显子突变的部分已知突变类型如下：
本发明提供了一种检测人类c-kit基因突变类型的试剂盒，它包括SEQ ID NO.1～283所示的引物对和SEQ ID NO.284所示的探针。
其中，它还包括质控引物与质控探针：SEQ ID NO.285～287所示引物对与SEQ IDNO.284所示的探针。
本发明还提供了上述试剂盒在制备检测人类c-kit基因11号外显子突变的试剂中的用途。
本发明还提供了SEQ ID NO.1～283所示引物对。
本发明还提供了SEQ ID NO.284所示的探针。
本发明还提供了一种检测人类c-kit基因11号外显子突变的方法，它包括如下步骤：
(1)提取样本DNA：取待检组织，提取其中的DNA；
(2)基因扩增：用上述试剂盒对待检样本中的DNA进行扩增；
(3)结果检测：对DNA扩增结果进行检测。
只要本发明检测试剂盒和方法测出有突变，就可以确认C-Kit基因的11号外显子至少存在一种突变。从而可以预测GIST患者对靶向药物的治疗反应。
本发明提供的试剂盒可以同时准确检测待检人群是否出现C-Kit基因的11号外显子上的274种突变位点，更能准确判断待检GIST患者的药物反应，为GIST患者的用药提供指导，且灵敏度高，特异性好，而且检测快速、简便，成本低廉，可以大量推广使用，临床应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为突变型样本测序结果图，所述突变为已知C11D组突变。
图2为特异性检测结果图。
图3为灵敏度检测结果图：编号1-5分别为浓度为8ng/ul、4ng/ul、2ng/ul、1ng/ul、0.5ng/ul的DNA扩增结果。
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
本发明所用的实验试剂与仪器如下：
FastStartTaq DNA Polymerase：购自Roche公司，Cat No.12 032 937 001；
Uracil DNA Glycosylase(UNG),heat labile 200U 2u/l：购自大连Takara公司，Cat No.2820；
dU plus dNTP Mixture(12.5×)(dATP 2.5mM,dGTP 2.5mM,dCTP 2.5mM,dUTP7.5mM,)：购自大连Takara公司，Cat No.4035。
实施例1本发明检测C-Kit基因11号外显子突变的试剂盒和检测方法
一、本发明试剂盒的组成
PCR扩增试剂(1人份)：
水 14.85μl
10XPCR buffer 2.5μl
MgCl2 25mM 0.75μl
UTP PLUS 0.5μl
Primer溶液 1μl
UNG 0.2μl
Taq 0.2μl
总体系 20μl
c-kit基因11号外显子突变的扩增引物以及检测探针：
引物如下：(引物均为5’-3’方向)
(注：编号由三个数字+一个字母组成，其中，前两个数字代表第5XX位氨基酸；第三个数字代表该氨基酸密码子的第几个核苷酸；字母代表突变为某种核苷酸。
例如，471A代表第547位氨基酸的三联密码子第1个核苷酸突变为A。
本发明共涉及30个氨基酸的突变，共计274个突变位点)
探针：
外控引物及探针：
二、采用本发明试剂盒检测C-Kit基因11号外显子突变
1、样本DNA提取：可以使用Qiagen公司、天根公司、Promega公司等DNA提取试剂盒提取。
以石蜡组织样本，用Qiagen公司试剂盒为例，提取DNA。
1)利用手术刀取出组织边界无用的石蜡；
2)将石蜡包埋组织切成4μm厚的薄片；
3)迅速用灭菌小镊子取2—6枚装入DNase/RNase Free EP管中(每张摊开面积500(最大)mm2，即边长1.6cm的正方形大小；
4)加入800μl二甲苯，振荡器上震荡10s，最大转数离心3分钟；
5)加入800μl二甲苯，振荡器上震荡10s，最大转数离心3分钟；
6)弃二甲苯，加入800μl无水乙醇，最大转数离心3分钟；
7)弃无水乙醇，挥干样品；
8)加入180μl ALT buffer及20μl proteinase K，56℃一小时以上，直至清亮；
9)90℃一小时；
10)离心6000g 1min，取上清；(此步骤是防止沉淀物阻塞柱子)
11)加入200μl AL,混匀，加入200μl乙醇，再混匀；
12)简单离心清洁管壁；
13)将全部混合液加入到DNA分离柱，关盖，离心6000g 1min，换新的收集管；
14)加入500μl AW1,6000g离心1min；换收集管；
15)加入500μl AW2，6000g离心1min，换收集管；
16)全速离心3min，干燥柱子；
17)换一只干净的1.5ml收集管，准备收集DNA；加入20-30μl ATE,在室温保持1min以溶解DNA。全速离心1min收集DNA。
2、定量PCR扩增
c-kit基因突变的扩增引物以及检测探针：
C11引物组合共7种，每个突变位点的引物为除开正常碱基序列外的三种碱基(如：471位点正常人为T，则引物最后一个碱基分别为A,G,C)，X则代表三种碱基。
引物母液浓度均为100nM/ml。
C11A引物：
471X 三种，每种2.5μl
472X 三种，每种2.5μl
473X 三种，每种2.5μl
481X 三种，每种2.5μl
562X 三种，每种2.5μl
563X 三种，每种2.5μl
571X 三种，每种2.5μl
572X 三种，每种2.5μl
653X 三种，每种2.5μl
661X 三种，每种2.5μl
662X 三种，每种2.5μl
663X 三种，每种2.5μl
791X 三种，每种2.5μl
792X 三种，每种2.5μl
793X 三种，每种2.5μl
801X 三种，每种2.5μl
893X 三种，每种2.5μl
C11R 5μl
C11P 2.5μl
total 135μl
C11B引物：
C11C引物：
493X 三种，每种2.5μl
501X 三种，每种2.5μl
502X 三种，每种2.5μl
503X 三种，每种2.5μl
591X 三种，每种2.5μl
592X 三种，每种2.5μl
593X 三种，每种2.5μl
601X 三种，每种2.5μl
682X 三种，每种2.5μl
683X 三种，每种2.5μl
691X 三种，每种2.5μl
692X 三种，每种2.5μl
811X 三种，每种2.5μl
C11R 5μl
C11P 2.5μl
total 105μl
C11D引物：
C11E引物：
522X 三种，每种2.5μl
523X 三种，每种2.5μl
531X 三种，每种2.5μl
532X 三种，每种2.5μl
613X 三种，每种2.5μl
621X 三种，每种2.5μl
622X 三种，每种2.5μl
623X 三种，每种2.5μl
741X 三种，每种2.5μl
742X 三种，每种2.5μl
743X 三种，每种2.5μl
761X 三种，每种2.5μl
862X 三种，每种2.5μl
C11R 5μl
C11P 2.5μl
total 112.5μl
C11F引物：
C11G引物：
551X 三种，每种2.5μl
552X 三种，每种2.5μl
553X 三种，每种2.5μl
561X 三种，每种2.5μl
642X 三种，每种2.5μl
643X 三种，每种2.5μl
651X 三种，每种2.5μl
652X 三种，每种2.5μl
773X 三种，每种2.5μl
781X 三种，每种2.5μl
782X 三种，每种2.5μl
783X 三种，每种2.5μl
C11R 5μl
C11P 2.5μl
H<sub>2</sub>O 2.5μl
total 100μl
c-kit外控引物溶液(Primer溶液)配制如下，配制出引物溶液后，在定量PCR体系中加入1ul即可。
1)定量PCR体系配制：
按照如下表格加样入8个PCR管：
管号 检出突变类型
1 c-kit11A
2 c-kit 11B
3 c-kit 11C
4 c-kit11D
5 c-kit11E
6 c-kit 11F
7 c-kit 11G
8 c-kit外控
2)BIO-RAD CFX96机器PCR热循环程序设置：
3、结果判读：
以外控信号为标准，其信号Ct值在15-25，表明上样DNA的量在允许范围以内。所有实验样本的外控曲线均应该升起，否则重新提取DNA检测。读取待检孔(孔号1)Ct值，Ct值为0(或者无扩增曲线)或者大于29判读阴性，判定为无C11突变；Ct值小于28判读该信号孔阳性。28～29重复实验，若仍然在28～29判读C11弱阳性突变。
其中，阳性、弱阳性：代表样品至少有一个位点突变。
以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：
实验例1本发明试剂盒以及方法的准确度检测和特异性检测
1、待检样本
选取已知突变类型为c-kit基因11号外显子突变的临床GIST石蜡组织样本各1例(共计90例，涉及本发明引物能够检测的所有氨基酸；其中第547位氨基酸的突变类型测序结果见图1)和已知野生型临床GIST石蜡组织样本1例，检测人类c-kit基因突变类型。
2、检测方法
本发明方法：采用实施例1的试剂盒，按照实施例1的方法进行检测。
样本DNA提取方法：用Qiagen公司试剂盒提取：
1)利用手术刀取出组织边界无用的石蜡；
2)将石蜡包埋组织切成4μm厚的薄片；
3)迅速用灭菌小镊子取2—6枚装入DNase/RNase Free EP管中(每张摊开面积500(最大)mm2，即边长1.6cm的正方形大小；
4)加入800μl二甲苯，振荡器上震荡10s，最大转数离心3分钟；
5)加入800μl二甲苯，振荡器上震荡10s，最大转数离心3分钟；
6)弃二甲苯，加入800μl无水乙醇，最大转数离心3分钟；
7)弃无水乙醇，挥干样品；
8)加入180μl ALT buffer及20μl proteinase K，56℃一小时以上，直至清亮；
9)90℃一小时；
10)离心6000g 1min，取上清；(此步骤是防止沉淀物阻塞柱子)
11)加入200μl AL,混匀，加入200μl乙醇，再混匀；
12)简单离心清洁管壁；
13)将全部混合液加入到DNA分离柱，关盖，离心6000g 1min，换新的收集管；
14)加入500μl AW1,6000g离心1min；换收集管；
15)加入500μl AW2，6000g离心1min，换收集管；
16)全速离心3min，干燥柱子；
17)换一只干净的1.5ml收集管，准备收集DNA；加入20-30μl ATE,在室温保持1min以溶解DNA。全速离心1min收集DNA。
3、实验结果
如果突变型样本信号Ct值在28以内，则表示样本出现了c-kit基因11号外显子检测突变类型(本发明30个氨基酸的突变)中至少一种突变。
本发明90例突变型样本信号Ct值均在28以内，其中第547位氨基酸突变样本测序结果如图2所示。图2中，曲线1是突变型样本信号；曲线2是外控信号，曲线3是阴性对照(野生型对照)信号，样本信号Ct值在28以内，表示该样本出现了c-kit基因11号外显子的第547位氨基酸发生突变。
实验结果说明，本发明方法和试剂盒的检测结果与已知检测结果比较：结果一致，说明本发明方法和试剂盒可以准确c-kit基因11号外显子突变，准确性强；另外，阴性对照样本Ct值大于30，为阴性，说明了本发明方法和试剂盒的特异性好。
实验例2本发明试剂盒以及方法的灵敏度分析
1、试验方法
取含有人类c-kit基因11号外显子突变的DNA，定量至浓度为8ng/ul，进行等比稀释，稀释后的浓度分别为8ng/ul、4ng/ul、2ng/ul、1ng/ul、0.5ng/ul
用实施例1的试剂盒，按照实施例1的定量PCR扩增进行检测。
2、实验结果
如图3所示，本发明试剂盒可以检测到浓度为0.5ng/ul的低浓度样本，灵敏度高。
综上，本发明提供的试剂盒可以准确检测人类C-Kit基因11号外显子突变，特异性和灵敏度高，检测快速、简便，成本低廉，可以大量推广使用，临床应用前景良好。

Claims (4)

1.一种检测人类c-kit基因突变类型的试剂盒，其特征在于：它包括SEQ ID NO.1～275所示的引物对和SEQ ID NO.276所示的探针。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：它还包括质控引物与质控探针：SEQ IDNO.277～279所示引物对与SEQ ID NO.276所示的探针。
3.权利要求1或2所述的试剂盒在制备检测人类c-kit基因11号外显子突变的试剂中的用途。
4.SEQ ID NO.1～275所示引物对。
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