CN105943569A - 一种青梅有效成分的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种青梅有效成分的提取方法，属于中药活性成分提取领域。为了克服现有技术中青梅提取物活性成分药效较差的技术不足，本发明提供一种青梅有效成分的提取方法，该有效成分通过超临界流体技术制备得到，其药效活性强，特别是在抗肿瘤方面，其显著优于采用现有技术制备得到的青梅提取物，适合制备成相应的药物用于临床。

Description

一种青梅有效成分的提取方法
技术领域
本发明涉及一种青梅有效成分的提取方法，属于中药活性成分提取领域。
背景技术
青梅为龙脑香科植物，多分布于我国福建、广东、海南等省。《神农本草》记载，青梅性味甘平，入肝、脾、肺、大肠经，有收敛生津的作用。在民间长期用作杀菌消毒，治疗肝炎及提取中药龙脑香。青梅是一种常见药食两用的植物。现代医学研究表明，青梅具有消除疲劳、抗肿瘤、改善肠胃功能、抗菌、抗过敏、保护肝脏等功效。
海南青梅叶部分的80％乙醇提取物已证实具有良好抗氧化活性(尹文清，宋鑫明，陈光英，等.青梅叶中多酚含量测定及抗氧化活性研究.食品安全与检测，2009，34:283-286)，但其活性成分是什么尚未确定；而其茎的粗提取物已经被证实具有优良抗HIV(I-W朴，陈光英，韩长日，等.药用植物的提取物及其应用CN102724990)、抗肿瘤(袁媛，王琳，田丽美，等.MTT法筛选青梅对SPCA-1体外增殖抑制作用有效部位的研究，食品工业，2010，1:10-11)、抗炎(陈忠，杨燕，王天山，等.青梅和大叶鱼骨木提取浸膏的抑菌活性.时珍国医国药，2009，20:445-446)等活性。
中国专利申请201410412708.8公开了一种青梅提取物在卷烟中的应用。将青梅洗净、去核后称重，用5～10倍量的高粱酒浸泡，回流提取1～3小时后过滤，即得所需的青梅提取物；将青梅提取物均匀地喷洒在烟丝上，并在恒温恒湿条件下平衡24h；青梅中的有效成分以及其特有的香气在与烟丝复合后，能够有效改善卷烟的品质，提高卷烟的香气质。中国专利申请200910014809.9公开了一种青梅花提取方法以及用途，其通过制备青梅花提取物并将其与其他护肤成分复配，制得一种抗衰老护肤霜，并发现其具有抗氧化并能促进皮肤细胞新陈代谢，延缓肌肤衰老的功效。中国专利申请201410210150.5公开了一种具有清除自由基功能的海南青梅茎提取物及其制备方法，是在海南青梅茎的干燥粉末中加入有机溶剂提取；提取液经过滤、减压浓缩得到总浸膏，加水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，减压回收分别得到石油醚部分、乙酸乙酯部分，所得乙酸乙酯部分经氯仿与甲醇混合溶剂系统梯度洗脱，其中体积比为100:30的氯仿与甲醇洗脱组分具有优良的清除自由基活性，其可应用于抗氧化与清除自由基功能的保健食品、药品和食品中。
超临界流体萃取(Supercritical Fluids Extraction，SFE)是利用超临界状态下的流体作为萃取溶剂，从液体或固体物料中萃取出某种组分的一种新型分离技术。它克服了传统萃取法费时费力、回收率低、污染严重、操作繁琐等问题，特别是消除了有机溶剂对人体和环境的危害，因此被喻为“绿色环保技术”，并已广泛应用于医药、食品、化妆品及香料工业等领域。经过20多年的发展，我国超临界流体萃取技术取得了显著成绩，实现了从理论研究、中小试水平向大规模产业化的转型，使其研究应用同国际接轨。
发明内容
为了克服现有技术中青梅提取物活性成分药效较差的技术不足，本发明提供一种青梅有效成分的提取方法，该有效成分通过超临界流体技术制备得到，其药效活性强，特别是在抗肿瘤方面，其显著优于采用现有技术制备得到的青梅提取物，适合制备成相应的药物用于临床。
本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：
一种青梅有效成分的提取方法，其具体包括如下步骤：
1)预处理：将青梅叶洗净晒干后粉碎成青梅粉后过20目筛，将青梅粉与夹带剂95％乙醇混合制备成提取溶液；
2)超临界萃取：将提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜内输入超临界二氧化碳流体，设置萃取釜压力为20-25MPa，温度为30-50℃，萃取时间为1.5-4h；
3)有效成分分离：溶解有萃出物的超临界二氧化碳流体经减压阀先后进入分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ，设置分离釜Ⅰ压力为7-8MPa，温度为48-52℃，收集萃取液Ⅰ；设置分离釜Ⅱ压力为4-5MPa，温度为34-36℃，收集萃取液Ⅱ；
4)有效成分的浓缩与制备：合并萃取液Ⅰ和萃取液Ⅱ得到萃取液的混合液，采用旋转蒸发仪浓缩至少量液体，50-60℃烘干成膏状即可得到青梅有效成分。
上述所述的青梅有效成分的提取方法中，所述的提取溶液中青梅粉与夹带剂95％乙醇的质量比1：0.8-4，优选为1:2.4。
上述所述的青梅有效成分的提取方法中，所述的超临界萃取工艺中二氧化碳的流量为30-35L/h。
作为本发明所优选的一种实施方式，所述的青梅有效成分的提取方法具体包括如下步骤：
将青梅叶洗净晒干后粉碎成青梅粉后过20目筛，将青梅粉与夹带剂95％乙醇混合制备成提取溶液；将提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜内输入超临界二氧化碳流体，设置萃取釜压力为23MPa，温度为40℃，萃取时间为2.5h；溶解有萃出物的超临界二氧化碳流体经减压阀先后进入分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ，设置分离釜Ⅰ压力为7.5MPa，温度为50℃，收集萃取液Ⅰ；设置分离釜Ⅱ压力为4.5MPa，温度为35℃，收集萃取液Ⅱ；合并萃取液Ⅰ和萃取液Ⅱ得到萃取液的混合液，采用旋转蒸发仪浓缩至少量液体，55℃烘干成膏状即可得到青梅有效成分；其中所述的提取溶液中青梅粉与夹带剂95％乙醇的质量比1:2.4。
本发明还请求保护按照上述提取工艺制备得到的青梅提取物。
发明人将得到的青梅提取物进行药效动物实验，发现上述青梅提取物在药效方面均显著优于采用现有工艺制备得到的青梅提取物，尤其是在抗肿瘤方面，其药效更为优异。基于此，本发明请求保护上述中药提取物在制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明与现有技术相比具有如下有益的技术效果：
本发明青梅有效成分通过超流体萃取技术制备得到，其产品的纯度高，产品的制备工艺简单，易于操作，具有很强的应用前景。采用本发明所述的工艺制备得到的青梅提取物的药效活性强，特别是在抗肿瘤方面，显著优于采用现有技术制备得到的青梅提取物，适合制备成相应的药物用于临床。
具体实施方式
下面采用具体实施例进一步说明本发明的内容。
以下内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
实施例1一种青梅有效成分的提取方法
所述的青梅有效成分的提取方法具体包括如下步骤：
将青梅叶洗净晒干后粉碎成青梅粉后过20目筛，将青梅粉与夹带剂95％乙醇混合制备成提取溶液；将提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜内输入超临界二氧化碳流体，设置萃取釜压力为20MPa，温度为30℃，萃取时间为1.5h；溶解有萃出物的超临界二氧化碳流体经减压阀先后进入分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ，设置分离釜Ⅰ压力为7MPa，温度为48℃，收集萃取液Ⅰ；设置分离釜Ⅱ压力为4MPa，温度为34℃，收集萃取液Ⅱ；合并萃取液Ⅰ和萃取液Ⅱ得到萃取液的混合液，采用旋转蒸发仪浓缩至少量液体，50℃烘干成膏状即可得到青梅有效成分；其中所述的提取溶液中青梅粉与夹带剂95％乙醇的质量比1:0.8。
实施例2一种青梅有效成分的提取方法
所述的青梅有效成分的提取方法具体包括如下步骤：
将青梅叶洗净晒干后粉碎成青梅粉后过20目筛，将青梅粉与夹带剂95％乙醇混合制备成提取溶液；将提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜内输入超临界二氧化碳流体，设置萃取釜压力为25MPa，温度为50℃，萃取时间为4h；溶解有萃出物的超临界二氧化碳流体经减压阀先后进入分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ，设置分离釜Ⅰ压力为8MPa，温度为52℃，收集萃取液Ⅰ；设置分离釜Ⅱ压力为5MPa，温度为36℃，收集萃取液Ⅱ；合并萃取液Ⅰ和萃取液Ⅱ得到萃取液的混合液，采用旋转蒸发仪浓缩至少量液体，60℃烘干成膏状即可得到青梅有效成分；其中所述的提取溶液中青梅粉与夹带剂95％乙醇的质量比1:4。
实施例3一种青梅有效成分的提取方法
所述的青梅有效成分的提取方法具体包括如下步骤：
将青梅叶洗净晒干后粉碎成青梅粉后过20目筛，将青梅粉与夹带剂95％乙醇混合制备成提取溶液；将提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜内输入超临界二氧化碳流体，设置萃取釜压力为23MPa，温度为40℃，萃取时间为2.5h；溶解有萃出物的超临界二氧化碳流体经减压阀先后进入分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ，设置分离釜Ⅰ压力为7.5MPa，温度为50℃，收集萃取液Ⅰ；设置分离釜Ⅱ压力为4.5MPa，温度为35℃，收集萃取液Ⅱ；合并萃取液Ⅰ和萃取液Ⅱ得到萃取液的混合液，采用旋转蒸发仪浓缩至少量液体，55℃烘干成膏状即可得到青梅有效成分；其中所述的提取溶液中青梅粉与夹带剂95％乙醇的质量比1:2.4。
实施例4一种青梅有效成分的提取方法
所述的青梅有效成分的提取方法具体包括如下步骤：
将青梅叶洗净晒干后粉碎成青梅粉后过20目筛，将青梅粉与夹带剂95％乙醇混合制备成提取溶液；将提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜内输入超临界二氧化碳流体，设置萃取釜压力为20MPa，温度为50℃，萃取时间为2.5h；溶解有萃出物的超临界二氧化碳流体经减压阀先后进入分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ，设置分离釜Ⅰ压力为7MPa，温度为52℃，收集萃取液Ⅰ；设置分离釜Ⅱ压力为4MPa，温度为36℃，收集萃取液Ⅱ；合并萃取液Ⅰ和萃取液Ⅱ得到萃取液的混合液，采用旋转蒸发仪浓缩至少量液体，50℃烘干成膏状即可得到青梅有效成分；其中所述的提取溶液中青梅粉与夹带剂95％乙醇的质量比1:3。
实施例5一种青梅有效成分的提取方法
所述的青梅有效成分的提取方法具体包括如下步骤：
将青梅叶洗净晒干后粉碎成青梅粉后过20目筛，将青梅粉与夹带剂95％乙醇混合制备成提取溶液；将提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜内输入超临界二氧化碳流体，设置萃取釜压力为25MPa，温度为30℃，萃取时间为3h；溶解有萃出物的超临界二氧化碳流体经减压阀先后进入分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ，设置分离釜Ⅰ压力为8MPa，温度为48℃，收集萃取液Ⅰ；设置分离釜Ⅱ压力为5MPa，温度为34℃，收集萃取液Ⅱ；合并萃取液Ⅰ和萃取液Ⅱ得到萃取液的混合液，采用旋转蒸发仪浓缩至少量液体，52℃烘干成膏状即可得到青梅有效成分；其中所述的提取溶液中青梅粉与夹带剂95％乙醇的质量比1:2。
对比实施例1按照CN 103961383A实施例所述的制备方法制备得到。
海南青梅茎提取物的制备方法步骤如下：1)取海南青梅的茎于室温阴干后粉碎，过20-80目筛，然后加入甲醇、丙酮或50-95％的乙醇，室温浸泡、加热或超声提取，提取时间为60分钟至7天，料液比为1:1～1:10；2)将提取液过滤、减压回收得到总浸膏，加水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，减压回收分别得到石油醚部分和乙酸乙酯部分；乙酸乙酯部分经氯仿与甲醇混合溶剂体系(梯度为100:0、100:5、100:30、100:40、100:60和100:100，体积比)进行梯度洗脱，薄层色谱检测合并相同组分，得6个组分A-F(A，100:0；B，100:5；C，100:30；D，100:40；E，100:60；F，100:100)；
对比实施例2按照CN 101536967B实施例1所述的制备工艺制备得到。
1)青梅花提取物通过以下方法制备：1)CO2超临界提取青梅花的非极性成分：将含水量≤1.5％干青梅花放入HA121-50-01型超临界CO2萃取釜中，通入35Mpa的CO2，在60℃温度下循环动态萃取2h；然后进行减压分离，分离温度40℃，分离压力4Mpa，得到青梅花中的非极性成分；2)极性成分的提取：将1)步萃取残渣用体积比为30％的乙醇，残渣与乙醇的重量比为1∶15，在80℃的温度下热回流提取2h；然后过滤得到滤液，在78℃温度下蒸馏得青梅花中的极性成分；3)将1)步和2)步所得非极性成分与极性成分混合。
实施例6青梅活性成分的抗肿瘤实验研究
1、材料
1.1 S180小鼠腹水瘤细胞，由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供；RPMI-1640培养基购自GIBCO公司；ICR小鼠4-6周，18-22g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；
1.2受试药物及处理方法：实施例1-5、对比实施例1、对比实施例2所制备得到的青梅提取物，采用生理盐水溶解。
2、方法
2.1 S180细胞株传代培养方法
取体质量(20±2)g健康ICR小鼠，将体外培养良好的S180细胞用生理盐水调节至浓度为1×107个/mL，0.2mL/只注射入小鼠腹腔，每天摄取食、水。每日观察，见腹部胀大，备用。
2.2肿瘤接种、给药方法
无菌条件下抽取生长良好传代小鼠的腹水，生理盐水清洗5遍，去除蛋白等杂质，用生理盐水调节细胞浓度为1×107个/mL，0.2mL/只接种于常规皮肤消毒后的小鼠腋下。
将已成功接种的小鼠按体重随机分组，将各组分按实验设计剂量灌胃给药，模型组给予等剂量生理盐水，1次/d。末次给药24h后，小鼠称重，处死小鼠剥取瘤块，精密称重。
2.3数据处理方法
应用SPSS17.0软件进行统计学分析，实验数据以(x±s)表示，P<0.05为有统计学差异。
抑瘤率＝(模型组平均瘤重－用药组平均瘤重)/模型组平均瘤重×100％
3、结果
结果见表1。
表1抗肿瘤活性成分对S180小鼠腋下实体瘤的抑瘤率
与模型组对照比较，*P<0.05，**P<0.01；与对比实施例1组比较，#P<0.05，##P<0.01；
与对比实施例2组比较，P<0.05，P<0.01。
本发明制备方法所得抗肿瘤活性部位能显著降低S180小鼠腋下实体瘤的瘤重，具有显著的抗肿瘤效果，与对比实施例相比较，其抗肿瘤效果更好。其中以实施例3所对应的的工艺的青梅提取物的抗肿瘤活性最强，为本发明的最优实施例。

Claims (7)

1.一种青梅有效成分的提取方法，其具体包括如下步骤：
1)预处理：将青梅叶洗净晒干后粉碎成青梅粉后过20目筛，将青梅粉与夹带剂95％乙醇混合制备成提取溶液；
2)超临界萃取：将提取溶液置于萃取釜中，向萃取釜内输入超临界二氧化碳流体，设置萃取釜压力为20-25MPa，温度为30-50℃，萃取时间为1.5-4h；
3)有效成分分离：溶解有萃出物的超临界二氧化碳流体经减压阀先后进入分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ，设置分离釜Ⅰ压力为7-8MPa，温度为48-52℃，收集萃取液Ⅰ；设置分离釜Ⅱ压力为4-5MPa，温度为34-36℃，收集萃取液Ⅱ；
4)有效成分的浓缩与制备：合并萃取液Ⅰ和萃取液Ⅱ得到萃取液的混合液，采用旋转蒸发仪浓缩至少量液体，50-60℃烘干成膏状即可得到青梅有效成分。
2.根据权利要求1所述的青梅有效成分的提取方法，其特征在于，所述的提取溶液中青梅粉与夹带剂95％乙醇的质量比1：0.8-4。
3.根据权利要求2所述的青梅有效成分的提取方法，其特征在于，所述的提取溶液中青梅粉与夹带剂95％乙醇的质量比1：2.4。
4.根据权利要求1所述的青梅有效成分的提取方法，其特征在于，所述的超临界萃取工艺中二氧化碳的流量为30-35L/h。
5.根据权利要求1所述的青梅有效成分的提取方法，所述的青梅有效成分的提取方法具体包括如下步骤：
将青梅叶洗净晒干后粉碎成青梅粉后过20目筛，将青梅粉与夹带剂95％乙醇混合制备成提取溶液；将提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜内输入超临界二氧化碳流体，设置萃取釜压力为23MPa，温度为40℃，萃取时间为2.5h；溶解有萃出物的超临界二氧化碳流体经减压阀先后进入分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ，设置分离釜Ⅰ压力为7.5MPa，温度为50℃，收集萃取液Ⅰ；设置分离釜Ⅱ压力为4.5MPa，温度为35℃，收集萃取液Ⅱ；合并萃取液Ⅰ和萃取液Ⅱ得到萃取液的混合液，采用旋转蒸发仪浓缩至少量液体，55℃烘干成膏状即可得到青梅有效成分。
6.一种根据权利要求1-5任一所述的青梅有效成分的提取方法制备得到青梅提取物。
7.权利要求6所述的青梅提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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