CN105935373A - 中药及其提取物用于制备治疗慢性乙肝药物的应用 - Google Patents

中药及其提取物用于制备治疗慢性乙肝药物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中药及其提取物用于制备治疗慢性乙肝药物的应用。具体涉及椿皮用于制备治疗慢性乙肝药物的应用。同时涉及椿皮提取物用于制备治疗慢性乙肝药物的应用。还涉及用于治疗慢性病毒性乙型肝炎的复方方剂，该复方方剂中含有椿皮。椿皮及其提取物对乙型肝炎的疗效优于拉米夫定，不仅对乙肝表面抗原(HBsAg)的具有良好的抑制作用，在e抗原(HBeAg)的抑制方面更显现出更大地优势，而研究表明HBeAg的持续阳性，是患者继发肝硬化，肝癌的高危因素。

Description

中药及其提取物用于制备治疗慢性乙肝药物的应用
技术领域
本发明涉及椿皮作为药物的新用途，具体涉及椿皮及其提取物用于制备治疗慢性病毒性乙型肝炎药物的应用。
背景技术
椿皮为苦木科植物臭椿(樗)的根皮或树皮。主产于山东、辽宁、河南、安徽等地。临床用名有椿皮、樗根皮、樗白皮。【药性】苦、涩，性寒。归大肠、胃、肝经。【功效】清热燥湿、收敛止带、止泻、止血、杀虫。
《药性论》记载本品味苦，微热，无毒。能治赤痢，肠滑痔疾，泻血不住。《本草纲目》记载：“椿皮色赤而香，樗皮色白而臭，多服微利人。盖椿皮入血分而性涩，樗皮入气分而性利，不可不辨。其主治之功虽同，其涩利之效则异，正如茯苓、芍药，赤、白颇殊也。凡血分受病不足者，宜椿皮。气分受病而郁者，多用樗皮，此心得之微也。”《本草分经》认为本品“苦，寒。燥湿，胜热。涩肠。入血分而涩血，兼去肺胃陈痰，治湿热诸病，有断下之功。”
目前椿皮常用于治疗以下疾病：
1、赤白带下本品能入大肠，苦可燥湿，寒以清热，涩能收敛。既可清热燥湿，又能收敛止带，为止带之常用药物。治疗湿热下注，带脉失约而致赤白带下者，常与黄柏等同用。如樗树根丸(《摄生众妙方》)。
2、久泻久痢，湿热泻痢本品入大肠经能收涩止泻，清热燥湿。治久泻久痢，常与柯子、母丁香同用，如柯黎勒丸(《脾胃论》)；治湿热泻痢，常与地榆同用，如椿根散(《鲁府禁方》)。
3、崩漏经多，便血痔血本品入肝经血分，善能收敛止血，因其性寒，尤宜 用于血热崩漏、便血者。治崩漏、月经过多者，常与黄柏、黄芩、白芍、龟甲等同用，如固经丸(《医学入门》)。治便血痔血，可单用本品为丸服；或与侧柏叶、升麻、白芍等同用，如椿皮丸(《丹溪心法》)。
此外，本品尚还有杀虫功效，内服治蛔虫腹痛；外洗治疥廯瘙痒。
关于椿皮的现代药理研究：
1、化学成分：椿皮含苦楝素、鞣质、赭朴酚，根及树干含苦木素。树皮含臭椿苦酮、臭椿苦内酯、乙酰臭椿苦内酯、苦木素、新苦木苦素等。
2、药理作用：⑴椿皮有抗菌作用，椿皮100％煎剂在体外对福氏痢疾杆菌、宋氏痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌等均有抑制作用。对金黄色葡萄球菌中度敏感。
⑵椿皮有抗癌作用，其有效成分是臭椿双内酯及一种未定结构的化合物X，其单体具有很强的抗癌活性，对子宫颈癌有一定作用。
⑶椿皮煎剂(稀释液)有杀灭阴道滴虫的作用；椿皮所含臭椿苦酮有较强的抗阿米巴原虫作用；椿皮有驱蛔虫作用。
⑷椿皮所含鞣质具有收敛作用；椿皮有一定止血作用；干皮的制剂对溃疡病有一定的治疗作用。
发明内容
本发明目的之一是提供了椿皮用于制备治疗慢性乙肝药物的应用。
本发明目的之二是提供了椿皮提取物用于制备治疗慢性乙肝药物的应用。
所述的椿皮提取物为椿皮水提物。
本发明目的之三是提供了一种用于治疗慢性乙肝的复方方剂，该复方方剂中含有椿皮。
本发明的有益效果：
椿皮对乙肝表面抗原(HBsAg)的具有良好的抑制作用，在e抗原(HBeAg)的抑制方面更显现出更大地优势，而研究表明HBeAg的持续阳性，是患者继发肝硬化，肝癌的高危因素。
附图说明
图1为拉米夫定和椿皮水提物不同浓度作用后HBV-DNA的定量测定结果比较；
图2为拉米夫定作用后HBV-DNA定量PCR曲线图；对应药物浓度说明：●指示浓度为10、■指示浓度为1、▲指示浓度为10-1、◆指示浓度为10-2、﹡指示浓度为10-3、○指示细胞对照；
图3为椿皮水提物作用后HBV-DNA定量PCR曲线图，对应药物浓度说明：●指示浓度为6×10-2、■指示浓度为6×10-3、▲指示浓度为6×10-4、◆指示浓度为6×10-5、﹡指示浓度为6×10-6、○指示细胞对照；
图4为拉米夫定作用后HBV-DNA定量PCR的琼脂糖凝胶电泳鉴定；
图5为椿皮水提物作用后HBV-DNA定量PCR的琼脂糖凝胶电泳鉴定。
具体实施方式
(一)临床观察
发明人在长期的临床医疗实践中，通过处方的加减化裁及大量的药物筛查和临床验证发现，含有椿皮的复方制剂对慢性病毒性乙型肝炎具有良好的治疗效果，尤其对于缓解乙肝病毒复制，降低乙肝病毒DNA的滴度具有明显疗效。
自2012年至今临床观察慢性乙肝病毒复制患者32名，病毒DNA检测2.18*102-3.2*108不等，年龄18-45岁，病程2-8年不等，服药疗程1-6月，治疗方法为含椿皮的中药汤剂，具体方剂如下：
椿皮18g，柴胡15g，防风18g，虎杖30g，藁本15g，五味子30g，郁金15g， 刘寄奴20g，红藤25g，地榆15g，六神曲12g，甘草6g。
治疗前32例患者均有不同程度的病毒复制及病毒DNA滴度升高情况，治疗后26例患者出现病毒DNA降低，总有效率81.2％，6例患者病毒DNA滴度无明显降低，其中2例患者出现转氨酶升高，服药分别于服药1周和2周后中止治疗，其中1例患者谷丙转氨酶升高至81IU/L,另一例谷丙转氨酶升高至320IU/L。
典型病例：
患者杨*玲，女，44岁，2012年12月就诊，查乙肝病毒DNA定量3.23*107，服药4月后复查乙肝病毒DNA定量1.72*103，继续服药2月后复查乙肝病毒DNA定量转阴。
患者李*，男，18岁，2014年4月就诊，查乙肝病毒DNA定量2.18*102，服药2月后复查乙肝病毒DNA定量转阴。
基于既往临床药物的多次加减化裁及大量中药筛选的结果,发明人预估本方剂中发挥主要治疗作用的药物为椿皮。
(二)体外实验
发明人于2014年5月-12月进行了椿皮水提物抗HBV的效应进行了体外实验，观察了椿皮水提物对HBsAg、HBeAg及HBV-DNA复制的抑制作用，并进行了定性及定量分析。
该实验以HepG2.2.15细胞为研究对象，HepG2.2.15是抗HBV新药开发的一个良好的体外研究工具，该细胞株是用2个头尾相连的HBVDNA全基因的重组质粒转染受体细胞HepG2而成，可在体外无性繁殖，能够长期稳定的向培养上清中分泌HBsAg,HBeAg和完整的Dane颗粒，而且还能产生大量的复制中间体，是体外筛选抗HBV药物的良好模型。
该研究中椿皮水提物制备方法：椿皮18g,清水400ml浸泡半小时后，大火煎煮5分钟后转小火，煎煮15分钟，最终获得药液置于烘箱，使其容积达300ml，取出至于密闭容器，4℃冷藏备用。
实验方法：
一、药物的细胞毒性测定
1.将拉米夫定(10％FBS+DMEM培养基)配成浓度为10g/L的溶液。
2.将对数生长期细胞用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至2×104cell/ml，加入到96孔板中(100μl每孔)，同时设置阴性对照孔、空白对照孔、每孔设置3个复孔。置于细胞培养箱中，37℃、5％CO2培养过夜。
3.取出培养板，吸弃上清后加入含有不同浓度药物的10％FBS+DMEM培养基，继续37℃、5％CO2培养72小时。
用10％FBS+DMEM培养基稀释拉米夫定和椿皮水提物，药物浓度如下。然后每孔加100μl稀释药液。拉米夫定(g/L)：10、1、0.1、0.01、0.001(即10、1、10-1、10-2、10-3)椿皮(g/L)采取倍比稀释：原液60、6、6×10-1、6×10-2、6×10-3
4.药物作用三天后，在96孔培养板各孔中加入10μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4小时后轻轻吸弃上清，每孔加入150μl DMSO，放置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解
5.在酶联免疫检测仪测570nm处的OD值。
6.根据公式计算出药物对细胞的抑制率及存活率(见附表1、2)
公式中：B＝log＜50％药物浓度
7.结果
从表1、表2看，拉米夫定细胞毒性很小，即使最大浓度10g/L,细胞存活率依然高达87％。椿皮水提物有一定细胞毒性，其半数细胞毒浓度即TC50＝0.665(g/L)。
表1不同拉米夫定浓度对HepG2.2.15细胞增值的影响
表2不同浓度椿皮对HepG2.2.15细胞增殖的影响
TC50＝0.665(g/L)
二、药物对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制作用测定
1.取HepG2.2.15细胞计数后调整细胞浓度至2×104cell/ml，加入到24孔细胞培养板中(1ml每孔)，同时设置复孔、阴性对照孔、空白对照孔。置于 细胞培养箱中，37℃、5％CO2培养过夜。
2.取出24孔细胞培养板，吸出上清后依次加入不同浓度的药物(药物浓度根据细胞毒性实验的结果，分别取对HepG2.2.15细胞抑制率低于15％的浓度作为最大无毒浓度，用培养基倍递减稀释)，1ml每孔，常规培养。椿皮水提物(g/L)采取倍比稀释：6×10-1、6×10-2、6×10-3、6×10-4、6×10-5；拉米夫定药物浓度选择(g/L)：10、1、10-1、10-2、10-3。
3.分别于第3、6、9天更换新鲜含药培养基，并将各孔上清收集至1.5ml的离心管中于-20℃冻存备用。
4.用ELISA试剂盒检测上述收集的上清中的HBsAg量，按照试剂盒中的说明书操作，最后用酶标仪读取波长450nm处的OD值。表面抗原检测操作步骤如下：
(1)根据实验，选择一定量的反应板条。
(2)加入75μl待测样品和阴、阳性对照于反应孔中，空白对照1孔。
(3)用封片纸覆盖反应板后，放置37℃孵育60分钟。
(4)取出反应板，撕去封片，在已加入待测样品和阴性、阳性对照的孔中各加入50μl酶结合物。
(5)在微孔振荡器上震荡10秒钟，用封片纸覆盖反应板后，放置37℃孵育30分钟。
(6)取出反应板，撕去封片纸，洗涤反应板5次。手工洗板：弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置1分钟，甩干，重复5次后，在干净的吸水纸上拍干。
(7)洗涤结束后立即在所有孔内加入显色剂A、B各50μl每孔，在微孔振荡器上震荡10秒钟。
(8)用封片纸覆盖反应板后，37℃孵育30分钟。
(9)在所有孔中加入50μl终止液，震荡反应5秒钟，使之充分混匀。
(10)用酶标仪读取波长450nm处各孔的OD值半数抑制药物浓度(IC50)。
(11)根据测定数据计算药物抗原抑制百分率和。
实验结果：
1.药物对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制作用测定
表3不同浓度拉米夫定对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制效果
IC50＝0.16(g/L)拉米夫定的半数抑制药物浓度为0.16g/L
表4不同浓度椿皮水提物对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制效果
IC50＝7.19×10-2(g/L)椿皮水提物的半数抑制药物浓度为＝7.19×10-2g/L
由上表可以发现拉米夫定和椿皮水提物浓度越大，对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制效果越好。拉米夫定的最大抑制率为76.6％，而椿皮水提物最大抑制率为97％，且椿皮水提物的抑制浓度明显小于拉米夫定的浓度，在同一浓度级别下10-1时，拉米夫定的最大抑制率为45.6％，而椿皮水提物最大抑制率为97％。
三、药物对HepG2.2.15细胞分泌HBeAg的抑制作用测定
1.取HepG2.2.15细胞计数后调整细胞浓度至2×104cell/ml，加入到24孔细胞培养板中(1ml每孔)，同时设置复孔、阴性对照孔、空白对照孔。置于细胞培养箱中，37℃、5％CO2培养过夜。
2.取出24孔细胞培养板，吸出上清后依次加入不同浓度的药物(药物浓度根据细胞毒性实验的结果，分别取对HepG2.2.15细胞抑制率低于15﹪的浓度作为最大无毒浓度，用培养基倍递减稀释)，1ml每孔，常规培养。椿皮水提物(g/L)采取倍比稀释：6×10-1、6×10-2、6×10-3、6×10-4、6×10-5；拉米夫定药物浓度选择(g/L)：10、1、10-1、10-2、10-3。
3.分别于第3、6、9天更换新鲜含药培养基，并将各孔上清收集至1.5ml的离心管中于-20℃冻存备用。
4.用ELISA试剂盒检测上述收集的上清中的HBeAg量，按照试剂盒中的说明书操作，最后用酶标仪读取波长450nm处的OD值。e抗原检测操作步骤如下：
(1)根据实验，选择一定量的反应板条
(2)每孔加入50μl待测样品和阴、阳性对照于反应孔中，空白对照1孔。
(3)每孔加入50μl酶结合物，充分混匀，封片纸覆盖反应板后，置37℃孵育30分钟。
(4)取出反应板，撕去封片纸，洗涤反应板5次。手工洗板：弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置1分钟，甩干，重复5次后，在干净的吸水纸上拍干。
(5)每孔加显色剂A、B液各50μl，充分混匀，封片纸覆盖反应板后，置37℃孵育15分钟。
(6)每孔加入终止液50μl，混匀。
(7)用酶标仪读取波长450nm处各孔的OD值。
(8)根据测定数据计算药物抗原抑制百分率。
表5不同浓度拉米夫定对HepG2.2.15细胞分泌HBeAg的抑制效果
表6不同浓度椿皮水提物对HepG2.2.15细胞分泌HBeAg的抑制效果
IC50＝1.84×10-1(g/L)椿皮水提物的半数抑制药物浓度为1.84×10-1(g/L)
从表5、表6看，椿皮水提物对HepG2.2.15细胞分泌HBeAg的抑制性能优于拉米夫定。拉米夫定在其最大浓度时对HepG2.2.15细胞分泌HBeAg的抑制率最高仅为35％，而椿皮水提物为82％。椿皮水提物和拉米夫定在加药后第3天、第6天、第9天时对细胞分泌HBeAg的抑制率变化不大，说明与作用时间 关联不大，在加药后第3天即已达到了最高抑制率。
四、药物治疗指数
1.椿皮水提物对HBsAg的抑制数据计算其治疗指数。
椿皮水提物的治疗指数(TI)＝TC50/IC50＝0.665/7.19×10-2＝9.25＞2.0
2.从椿皮水提物对HBeAg的抑制数据计算其治疗指数。
椿皮水提物的治疗指数(TI)＝TC50/IC50＝0.665/1.84×10-1＝3.61＞2.0
说明椿皮水提物对抑制HBsAg和HBeAg都有效，而且低毒，进一步研究开发有意义。
五、药物对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg抑制作用的定量测定
1.实验试验所用试剂：乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂盒(电化学发光法)，REF:05957435 190。
2.所用仪器：罗氏-E170电化学发光全自动免疫分析仪。
3.试验方法：双抗体夹心法
(1)将前期收集的药物作用第九天的各孔细胞上清液解冻，以不加药物的空为对照。
(2)离心后取上清200μl加入测量杯。
(3)放入罗氏E-170电化学发光仪，自动分析取得结果如下。
表7两组药物对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg抑制作用的定量测定
IC50拉＝0.25×10-1(g/L)，IC50椿＝1.23×10-1(g/L)
从表7看，拉米夫定和椿皮水提物在其最大浓度时对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制率都超过了50％，分别为67.99％和83.08％，而且椿皮水提物的抑制效果优于拉米夫定；从相同浓度级数(10-1、10-2、10-3)看，椿皮水提物的抑制效果明显优于拉米夫定，相差显著。
六、药物对HepG2.2.15细胞分泌HBeAg抑制作用的定量测定
1.实验试验所用试剂：乙型肝炎病毒E抗原检测试剂盒(电化学发光法)，REF:11820583 122。
2.所用仪器：罗氏-E170电化学发光全自动免疫分析仪。
3.试验方法：双抗体夹心法
(1)将前期收集的药物作用第九天的各孔细胞上清液解冻，以不加药物的空为对照。
(2)离心后取上清200μl加入测量杯。
(3)放入罗氏E-170电化学发光仪，自动分析取得结果如下。
表8药物对HepG2.2.15细胞分泌HBeAg抑制作用的定量测定
IC50椿＝1.32×10-1(g/L)
从表8看，拉米夫定和椿皮水提物在其最大浓度时对HepG2.2.15细胞分泌HBeAg的抑制率相差显著，分别为44.48％和91.72％，差别显著；但随着浓度的降低，椿皮水提物的抑制效果下降显著。
七、药物抑制HBV-DNA复制作用的定量测定
1.试验步骤
(1)提取病毒DNA：试剂使用TaKaRa公司的病毒RNA/DNA快速纯化试剂盒。
1)取200μl细胞上清液加入到2ml离心管中，以不加药物的空为对照。
2)加入200μl butter VGB，20μl的Proteinasek和1.0μl的CarrierRNA，充分混匀于56℃的水浴温浴10分钟；
3)向裂解液中加入200μl无水乙醇，充分吹打混匀后轻微离心；
4)将Spin Column安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12000rpm离心2分钟，弃滤液；
5)将500μl的Butter RwA加入至Spin Column中，12000rpm离心1分钟，弃滤液；
6)将700μl的Butter RwB加入至Spin Column中，12000rpm离心1分钟，弃滤液；
7)重复上步操作1次；
8)将Spin Column安置于Collection Tube上，12000rpm离心2分钟；
9)将吸附柱置于新的1.5ml的离心管中，晾置数分钟，待乙醇挥发干净。
10)向吸附柱膜的中央处加入30μl的洗脱液，室温静置5min；
11)12000rpm离心2min洗脱DNA。
12)以细胞对照组数值为标准系统默认它的值为1，表中所运用公式为：相对DNA量＝1/2(实验组Ct值-对照组Ct值)
抑制率＝(细胞对照组—药物对照组DNA表达量)×100％
2.引物与探针序列
HBVFP:5’-TGTCCTG-GTTATCGCTGG-3’
HBVRP:5’-CAAACGGGCAA-CATACCTT-3’
TaqMan探针序列：
FAM-5’-TGT-GTCTGCGGCGTTTTATCAT-3’-TAMRA
3.反应体系
表9 HBV DNA定量测定反应体系
Premix ExTaq 12.5μl
ROX 0.5μl
F 1μl
ROX 1μl
Taq man 1μl
DNA：总量150ng，各孔浓度不同，所加模板量不同，总体系251μl，不足用水补足25μl。
4.反应条件
表10 HBV DNA定量测定反应条件
扩增目的片段115bp。
表11拉米夫定抑制HBV-DNA复制作用的定量测定结果
药物浓度g/L 10 1 10-1 10-2 10-3 对照
Ct值 30.31 29.33 28.11 28.70 27.24 26.55
复孔 30.89 29.51 28.92 27.85 27.44 26.45
平均值 30.60 29.42 28.52 28.28 27.34 26.50
相对DNA量 0.06 0.13 0.25 0.29 0.56 1
抑制率 94.17％ 86.79％ 75.34％ 70.88％ 44.14％
表12椿皮水提物抑制HBV-DNA复制作用的定量测定结果
从表11和表12看，拉米夫定和椿皮水提物在其最大浓度时抑制HBV-DNA复制作用的效果都非常好，均超过了90％，分别为94.17％和98.63％％，抑制效果相当；从相同浓度级数(10-1、10-2、10-3)看，椿皮水提物的抑制效果明显优于拉米夫定，相差显著。图1是拉米夫定和椿皮水提物在各个浓度抑制HBV-DNA复制作用的定量测定结果比较。图2和图3分别是拉米夫定和椿皮水提物作用后HBV-DNA定量PCR的曲线图。图4和图5分别是拉米夫定和椿皮水提物作用后HBV-DNA定量PCR的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果，均检测到约100bp大小的DNA片段，大小正确。
八、药物治疗指数
1、椿皮水提物对HBsAg分泌的定量抑制数据计算其治疗指数。
椿皮水提物的治疗指数(TI)＝TC50/IC50中＝0.665/1.23×10-1＝5.41＞2.0
2、从椿皮水提物对HBeAg分泌的定量抑制数据计算其治疗指数。
椿皮水提物的治疗指数(TI)＝TC50/IC50中＝0.665/1.32×10-1＝5.03＞2.0说明椿皮水提物对抑制HBsAg和HBeAg都有效，而且低毒。
无论椿皮水提物对HBV抑制作用的定性还是定量研究来看，对HBsAg和HBeAg分泌的抑制，以及对HBV DNA复制的抑制，椿皮水提物的抑制效果都优于拉米夫定；从治疗指数看，定性和定量一致，椿皮水提物都是高效低毒。

Claims (4)

1.椿皮用于制备治疗慢性乙肝药物的应用。
2.椿皮提取物用于制备治疗慢性乙肝药物的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的椿皮提取物为椿皮水提物。
4.一种用于治疗慢性乙肝的复方方剂，其特征在于，所述复方方剂中含有椿皮。
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