CN105925513A - 用于降解黄曲霉毒素b1的复合菌剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂的制备方法以及该方法制作得到的复合菌剂，该制备方法包括：先将假单胞菌、黄杆菌、红球菌、寡养单胞菌以及芽孢杆菌分别进行培养，得到假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液以及芽孢杆菌菌液。再将假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液以及芽孢杆菌菌液混合，得到复合菌菌液。然后将复合菌菌液放入复合菌培养基中进行混合发酵，从而得到用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂，该复合菌剂能够高效地对黄曲霉毒素B1进行降解，且低成本、无二次污染。

Description

用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及黄曲霉毒素降解技术领域，具体而言，涉及一种用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂及其制备方法。
背景技术
黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉所产生的有毒代谢产物。在自然界，黄曲霉的生长要求不高，在有氧条件下，花生和玉米是最好的繁殖场所。饲料原料(如玉米、麦类、稻谷)等在储存和运输的过程中，条件适合时(如温度25℃～30℃，水分含量17％～20％)极易滋生黄曲霉群真菌产生黄曲霉毒素污染。
黄曲霉毒素是饲料生产中很难避免且极其有害的污染，而且很难去除。而黄曲霉毒素(特别是黄曲霉毒素B1)对大多数动物都有强烈的毒性作用。黄曲霉毒素可导致饲料的适口性和饲料的营养价值降低，影响动物繁殖机能，导致动物繁殖机能紊乱，还具有免疫毒性、肝毒性，可造成畜禽大批死亡及强烈的致癌作用，甚至影响人类健康。
现有的利用物理和化学的方法去除黄曲霉毒素B1往往需要较高的成本，且容易造成对原料的破坏和二次污染。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂，以实现对黄曲霉毒素B1低成本、无污染的降解。
本发明的另一目的在于提供一种用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂的制备方法，以获得能够有效地降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂，并且制备方法简单，成本较低。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
一种用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂的制备方法，包括：将假单胞菌、黄杆菌、红球菌、寡养单胞菌以及芽孢杆菌分别进行培养，得到假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液以及芽孢杆菌菌液。将假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液以及芽孢杆菌菌液混合，得到复合菌菌液。将复合菌菌液接入复合菌培养基中进行混合发酵。
进一步地，本发明的较佳实施例中，上述复合菌菌液中的假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液以及芽孢杆菌菌液的细胞数分别依次为复合菌菌液中细胞总数的10～20％、5～15％、10～35％、5～20％、25～35％。
进一步地，本发明的较佳实施例中，上述将假单胞菌、黄杆菌进行培养是将假单胞菌、黄杆菌分别接入假单胞菌培养基和黄杆菌培养基中，在温度为27～32℃以及好氧条件下培养45～50小时。
进一步地，本发明的较佳实施例中，上述假单胞菌培养基和黄杆菌培养基按重量份计均包括蛋白胨4～6份、牛肉浸取物2～4份、氯化钠4～6份、硫酸锰0.004～0.006份以及蒸馏水950～1050份。
进一步地，本发明的较佳实施例中，上述将红球菌进行培养是将红球菌接入红球菌培养基中，在26～30℃的温度下培养45～50小时。
进一步地，本发明的较佳实施例中，上述红球菌培养基按重量份计包括葡萄糖3～5份、酵母粉3～5份、麦芽膏9～11份、碳酸钙1.5～2.5份以及蒸馏水950～1050份。
进一步地，本发明的较佳实施例中，上述将寡养单胞菌和芽孢杆菌进行培养是将寡养单胞菌和芽孢杆菌分别接入寡养单胞菌培养基和芽孢杆菌培养基中，在27～32℃的温度下培养45～50小时。
进一步地，本发明的较佳实施例中，上述寡养单胞菌培养基和芽孢杆菌培养基按重量计均包括蛋白胨4～6份、牛肉膏2～4份以及蒸馏水950～1050份。
进一步地，本发明的较佳实施例中，上述进行混合发酵是将复合菌菌液接入复合菌培养基中，在温度为26～34℃，PH值为7.0的条件下培养45～50小时，复合菌培养基按重量计包括葡萄糖3～5份、蛋白胨4～6份、牛肉浸取物2～4份、氯化钠4～6份、酵母粉3～5份、碳酸钙1.5～2.5份、硫酸锰0.004～0.006份以及蒸馏水950～1050份。
一种用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂，其通过上述用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂的制备方法制作而成。
本发明实施例的用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂及其制备方法的有益效果是：通过将假单胞菌、黄杆菌、红球菌、寡养单胞菌以及芽孢杆菌分别进行培养，使得假单胞菌、黄杆菌、红球菌、寡养单胞菌以及芽孢杆菌进行大量的繁殖，并且活性和生长状态达到很好后，得到假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液以及芽孢杆菌菌液。然后将假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液以及芽孢杆菌菌液按照一定比例进行混合，得到复合菌菌液。再将复合菌菌液放入复合菌培养基中进行混合发酵，从而得到可以用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂。通过假单胞菌、黄杆菌、红球菌、寡养单胞菌以及芽孢杆菌的混合协同配合，使得该复合菌剂能够高效快速地对黄曲霉毒素B1进行降解，且通过生物降解的方式使得其成本低、不会造成二次污染。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂及其制备方法进行具体说明。
一种用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂的制备方法，包括：
S1、将假单胞菌、黄杆菌、红球菌、寡养单胞菌以及芽孢杆菌分别进行培养，得到假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液以及芽孢杆菌菌液。
其中，假单胞菌(Pseudomonas sp.)来自菌株保藏号CICC 23439，黄杆菌(Flavobacterium sp.)来自菌株保藏号CICC 20907，红球菌(Rhodococcussp.)来自菌株保藏号DSM 763，寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)来自菌株保藏号DSM 21257，芽孢杆菌(Bacillus sp.)来自菌株保藏号ATCC21228。
具体地，将假单胞菌、黄杆菌分别接入假单胞菌培养基和黄杆菌培养基中，在温度为27～32℃以及好氧条件下培养45～50小时。其中，好氧条件指的是通气或者震荡培养。
其中，假单胞菌培养基和黄杆菌培养基按重量份计均包括蛋白胨4～6份、牛肉浸取物2～4份、氯化钠4～6份、硫酸锰0.004～0.006份以及蒸馏水950～1050份。假单胞菌培养基和黄杆菌培养基的PH值为6.8～7.2。
将红球菌接入红球菌培养基中，在26～30℃的温度下培养45～50小时。
其中，红球菌培养基按重量份计包括葡萄糖3～5份、酵母粉3～5份；麦芽膏9～11份、碳酸钙1.5～2.5份以及蒸馏水950～1050份。
将寡养单胞菌和芽孢杆菌分别接入寡养单胞菌培养基和芽孢杆菌培养基中，在27～32℃的温度下培养45～50小时。
其中，寡养单胞菌培养基和芽孢杆菌培养基按重量计均包括蛋白胨4～6份、牛肉膏2～4份以及蒸馏水950～1050份。
在对假单胞菌、黄杆菌、红球菌、寡养单胞菌以及芽孢杆菌进行培养之前，可以对对应的培养基进行灭菌操作，即在118～123℃的温度下，灭菌3～5min。
通过将假单胞菌、黄杆菌、红球菌、寡养单胞菌以及芽孢杆菌分别在对应的培养基中进行培养，使得上述菌种进行大量繁殖，同时使得细菌的活性和生命力达到很好的状态，有利于后续混合后的混合发酵。
S2、将假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液以及芽孢杆菌菌液混合，得到复合菌菌液。
具体地，将假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液以及芽孢杆菌菌液按照细胞数含量为10～20％、5～15％、10～35％、5～20％、25～35％的比例进行混合，得到复合菌菌液。其中，细胞数含量指的是假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液以及芽孢杆菌菌液中的每种菌液的细胞数占复合菌菌液的总细胞数的百分比。
S3、将复合菌菌液放入复合菌培养基中进行混合发酵。
具体地，将复合菌菌液接入复合菌培养基中，在温度为26～34℃，PH值为7.0的条件下培养45～50小时后，得到用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂。其中，复合菌培养基按重量计包括葡萄糖3～5份、蛋白胨4～6份、牛肉浸取物2～4份、氯化钠4～6份、酵母粉3～5份、碳酸钙1.5～2.5份、硫酸锰0.004～0.006份以及蒸馏水950～1050份。
一种用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂，其通过上述用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂的制备方法制作而成。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例中，一种用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂的制备方法，包括：
首先，将来自菌株保藏号CICC 23439假单胞菌接入到由蛋白胨4g、牛肉浸取物3g、氯化钠5g、硫酸锰5mg以及蒸馏水1000mL组成的假单胞菌培养基中，在PH值为7.0，温度为28℃以及通气的条件下培养48小时。
将来自菌株保藏号CICC 20907的黄杆菌接入到由蛋白胨5g、牛肉浸取物3g、氯化钠5g、硫酸锰5mg以及蒸馏水1000mL组成的黄杆菌培养基中，在PH值为7.1，温度为30℃的条件下震荡培养48小时。
将来自菌株保藏号DSM 763的红球菌接入到由葡萄糖3g、酵母粉3g、麦芽膏9g、碳酸钙1.5g以及蒸馏水1000mL组成的红球菌培养基中，在28℃的温度下培养48小时。
将来自菌株保藏号DSM 21257的寡养单胞菌接入到由蛋白胨4g、牛肉膏2g以及蒸馏水1000mL组成的寡养单胞菌培养基中，在28℃的温度下培养48小时。
将来自菌株保藏号ATCC 21228的芽孢杆菌接入到由蛋白胨5g、牛肉膏3g以及蒸馏水1000mL组成的芽孢杆菌培养基中，在30℃的温度下培养48小时。
在对假单胞菌、黄杆菌、红球菌、寡养单胞菌以及芽孢杆菌进行培养之前，将对应的假单胞菌培养基、黄杆菌培养基、红球菌培养基、寡养单胞菌培养基以及芽孢杆菌培养基放置于121℃的温度下，灭菌3min。
其次，在得到的假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液以及芽孢杆菌菌液中取一定的量按照细胞数含量为15％、10％、28％、15％、32％的比例进行混合，得到复合菌菌液。
然后，将复合菌菌液接入复合菌培养基中，在温度为26℃，PH值为7.0的条件下培养48小时后，得到用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂。其中，复合菌培养基包括葡萄糖3g、蛋白胨4g、牛肉浸取物2g、氯化钠4g、酵母粉3g、碳酸钙1.5g、硫酸锰4mg以及蒸馏水950mL。
将制取的假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液、芽孢杆菌菌液以及最终得到的用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂分别单独或进行组合对黄曲霉毒素B1进行降解试验。其中，设定A为假单胞菌菌液，B为黄杆菌菌液，C为红球菌菌液，D为寡养单胞菌菌液，E为芽孢杆菌菌液，而A+B+C+D+E为用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂。
试验方法为：将等量的A、B、C、D、E或者进行组合的菌液接入到含有黄曲霉毒素B1的由葡萄糖4.0g、蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、氯化钠5.0g、酵母粉4.0g、碳酸钙2.0g、硫酸锰5mg以及蒸馏水1000mL组成的培养基中，在PH值为7.0，温度为30℃的条件下，震荡培养24小时。黄曲霉毒素B1的起始浓度为1mg/L。
试验结果如表1：
表1
菌液及其组合 黄曲霉毒素B1降解率
A 67.2％
B 45.7％
C 43.0％
D 53.3％
E 47.6％
A+B 70.1％
A+C 51.6％
A+D 46.2％
A+E 75.4％
A+B+C 66.3％
A+B+D 53.7％
A+B+E 86.5％
A+B+C+D 69.3％
A+B+C+E 72.6％
A+C+D+E 62.3％
A+B+C+D+E 92.4％
如表1所示，可以看出当假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液、芽孢杆菌菌液中的其中几种进行混合时有利于对黄曲霉毒素B1的降解，而将假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液、芽孢杆菌菌液按照本实施例中的比例混合在一起发酵形成本实施例中的用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂能够最大限度的对降解黄曲霉毒素B1进行降解，降解率达到92.4％。从而大大地提高了对黄曲霉毒素B1的降解能力，同时也能够更好地降低成本，由于生物降解不会产生二次污染。
实施例2
本实施例中，一种用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂的制备方法，包括：
首先，将来自菌株保藏号CICC 23439假单胞菌接入到由蛋白胨6g、牛肉浸取物4g、氯化钠6g、硫酸锰6mg以及蒸馏水1050mL组成的假单胞菌培养基中，在PH值为7.2，温度为30℃以及通气的条件下培养50小时。
将来自菌株保藏号CICC 20907的黄杆菌接入到由蛋白胨5g、牛肉浸取物4g、氯化钠4g、硫酸锰5mg以及蒸馏水1000mL组成的黄杆菌培养基中，在PH值为6.9，温度为29℃的条件下震荡培养48小时。
将来自菌株保藏号DSM 763的红球菌接入到由葡萄糖5g、酵母粉5g、麦芽膏11g、碳酸钙2.5g以及蒸馏水1050mL组成的红球菌培养基中，在30℃的温度下培养50小时。
将来自菌株保藏号DSM 21257的寡养单胞菌接入到由蛋白胨6g、牛肉膏4g以及蒸馏水1000mL组成的寡养单胞菌培养基中，在29℃的温度下培养48小时。
将来自菌株保藏号ATCC 21228的芽孢杆菌接入到由蛋白胨4g、牛肉膏4g以及蒸馏水1000mL组成的芽孢杆菌培养基中，在29℃的温度下培养50小时。
在对假单胞菌、黄杆菌、红球菌、寡养单胞菌以及芽孢杆菌进行培养之前，将对应的假单胞菌培养基、黄杆菌培养基、红球菌培养基、寡养单胞菌培养基以及芽孢杆菌培养基放置于120℃的温度下，灭菌4min。
其次，在得到的假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液以及芽孢杆菌菌液中取一定的量按照细胞数含量为20％、12％、25％、16％、27％的比例进行混合，得到复合菌菌液。
然后，将复合菌菌液接入复合菌培养基中，在温度为30℃，PH值为7.0的条件下培养49小时后，得到用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂。其中，复合菌培养基包括葡萄糖5g、蛋白胨6g、牛肉浸取物4g、氯化钠6g、酵母粉5g、碳酸钙2.5g、硫酸锰6mg以及蒸馏水1050mL。
将制取的假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液、芽孢杆菌菌液以及最终得到的用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂分别单独或进行组合对黄曲霉毒素B1进行降解试验。其中，设定A为假单胞菌菌液，B为黄杆菌菌液，C为红球菌菌液，D为寡养单胞菌菌液，E为芽孢杆菌菌液，而A+B+C+D+E为用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂。
试验方法为：将等量的A、B、C、D、E或者进行组合的菌液接入到含有黄曲霉毒素B1的由葡萄糖4.0g、蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、氯化钠5.0g、酵母粉4.0g、碳酸钙2.0g、硫酸锰5mg以及蒸馏水1000mL组成的培养基中，在PH值为7.0，温度为30℃的条件下，震荡培养24小时。黄曲霉毒素B1的起始浓度为1mg/L。
试验结果如表2：
表2
菌液及其组合 黄曲霉毒素B1降解率
A 66.5％
B 46.7％
C 43.2％
D 52.3％
E 49.1％
A+B 70.3％
A+C 51.8％
A+D 47.1％
A+E 74.9％
A+B+C 67.1％
A+B+D 54.2％
A+B+E 85.9％
A+B+C+D 70.2％
A+B+C+E 71.8％
A+C+D+E 62.3％
A+B+C+D+E 96.2％
通过对表2进行分析，可以看出当假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液、芽孢杆菌菌液中的其中几种进行混合时有利于对黄曲霉毒素B1的降解，而将假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液、芽孢杆菌菌液按照本实施例中的比例混合在一起发酵形成本实施例中的用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂能够最大限度的对降解黄曲霉毒素B1进行降解，降解率达到96.2％。从而大大地提高了对黄曲霉毒素B1的降解能力，同时也能够更好地降低成本，由于生物降解不会产生二次污染。
实施例3
本实施例中，一种用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂的制备方法，包括：
首先，将来自菌株保藏号CICC 23439假单胞菌接入到由蛋白胨5g、牛肉浸取物3g、氯化钠5g、硫酸锰5mg以及蒸馏水1000mL组成的假单胞菌培养基中，在PH值为7.0，温度为27℃以及通气的条件下培养47小时。
将来自菌株保藏号CICC 20907的黄杆菌接入到由蛋白胨4g、牛肉浸取物2g、氯化钠5g、硫酸锰4mg以及蒸馏水950mL组成的黄杆菌培养基中，在PH值为6.8，温度为28℃的条件下震荡培养48小时。
将来自菌株保藏号DSM 763的红球菌接入到由葡萄糖4g、酵母粉4g、麦芽膏10g、碳酸钙2g以及蒸馏水1000mL组成的红球菌培养基中，在30℃的温度下培养48小时。
将来自菌株保藏号DSM 21257的寡养单胞菌接入到由蛋白胨5g、牛肉膏3g以及蒸馏水1000mL组成的寡养单胞菌培养基中，在28℃的温度下培养48小时。
将来自菌株保藏号ATCC 21228的芽孢杆菌接入到由蛋白胨5g、牛肉膏4g以及蒸馏水1000mL组成的芽孢杆菌培养基中，在30℃的温度下培养48小时。
在对假单胞菌、黄杆菌、红球菌、寡养单胞菌以及芽孢杆菌进行培养之前，将对应的假单胞菌培养基、黄杆菌培养基、红球菌培养基、寡养单胞菌培养基以及芽孢杆菌培养基放置于122℃的温度下，灭菌5min。
其次，在得到的假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液以及芽孢杆菌菌液中取一定的量按照细胞数含量为18％、15％、30％、12％、25％的比例进行混合，得到复合菌菌液。
然后，将复合菌菌液接入复合菌培养基中，在温度为34℃，PH值为7.0的条件下培养48小时后，得到用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂。其中，复合菌培养基包括葡萄糖4g、蛋白胨5g、牛肉浸取物3g、氯化钠5g、酵母粉4g、碳酸钙2g、硫酸锰5mg以及蒸馏水1000mL。
将制取的假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液、芽孢杆菌菌液以及最终得到的用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂分别单独或进行组合对黄曲霉毒素B1进行降解试验。
其中，设定A为假单胞菌菌液，B为黄杆菌菌液，C为红球菌菌液，D为寡养单胞菌菌液，E为芽孢杆菌菌液，而A+B+C+D+E为用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂。
试验方法为：将等量的A、B、C、D、E或者进行组合的菌液接入到含有黄曲霉毒素B1的由葡萄糖4.0g、蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、氯化钠5.0g、酵母粉4.0g、碳酸钙2.0g、硫酸锰5mg以及蒸馏水1000mL组成的培养基中，在PH值为7.0，温度为30℃的条件下，震荡培养24小时。黄曲霉毒素B1的起始浓度为1mg/L。
试验结果如表3：
表3
菌液及其组合 黄曲霉毒素B1降解率
A 65.1％
B 45.8％
C 42.9％
D 53.1％
E 48.6％
A+B 70.8％
A+C 51.2％
A+D 46.3％
A+E 74.0％
A+B+C 67.7％
A+B+D 55.2％
A+B+E 86.3％
A+B+C+D 71.1％
A+B+C+E 75.9％
A+C+D+E 64.1％
A+B+C+D+E 93.5％
通过表3，可以看出当假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液、芽孢杆菌菌液中的其中几种进行混合时有利于对黄曲霉毒素B1的降解，而将假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液、芽孢杆菌菌液按照本实施例中的比例混合在一起发酵形成本实施例中的用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂能够最大限度的对降解黄曲霉毒素B1进行降解，降解率达到93.5％。从而大大地提高了对黄曲霉毒素B1的降解能力，同时也能够更好地降低成本，由于生物降解不会产生二次污染。
实施例4
本实施例中，一种用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂的制备方法，包括：
首先，将来自菌株保藏号CICC 23439假单胞菌接入到由蛋白胨5g、牛肉浸取物3g、氯化钠5g、硫酸锰5mg以及蒸馏水1000mL组成的假单胞菌培养基中，在PH值为7.0，温度为28℃以及通气的条件下培养48小时。
将来自菌株保藏号CICC 20907的黄杆菌接入到由蛋白胨5g、牛肉浸取物3g、氯化钠5g、硫酸锰5mg以及蒸馏水1000mL组成的黄杆菌培养基中，在PH值为7.0，温度为30℃的条件下通风培养48小时。
将来自菌株保藏号DSM 763的红球菌接入到由葡萄糖4g、酵母粉4g、麦芽膏10g、碳酸钙2g以及蒸馏水1000mL组成的红球菌培养基中，在28℃的温度下培养48小时。
将来自菌株保藏号DSM 21257的寡养单胞菌接入到由蛋白胨5g、牛肉膏3g以及蒸馏水1000mL组成的寡养单胞菌培养基中，在28℃的温度下培养48小时。
将来自菌株保藏号ATCC 21228的芽孢杆菌接入到由蛋白胨5g、牛肉膏3g以及蒸馏水1000mL组成的芽孢杆菌培养基中，在30℃的温度下培养48小时。
在对假单胞菌、黄杆菌、红球菌、寡养单胞菌以及芽孢杆菌进行培养之前，将对应的假单胞菌培养基、黄杆菌培养基、红球菌培养基、寡养单胞菌培养基以及芽孢杆菌培养基放置于118℃的温度下，灭菌5min。
其次，在得到的假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液以及芽孢杆菌菌液中取一定的量按照细胞数含量为15％、15％、35％、15％、20％的比例进行混合，得到复合菌菌液。
然后，将复合菌菌液接入复合菌培养基中，在温度为28℃，PH值为7.0的条件下培养48小时后，得到用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂。其中，复合菌培养基包括葡萄糖4g、蛋白胨5g、牛肉浸取物3g、氯化钠5g、酵母粉4g、碳酸钙2g、硫酸锰5mg以及蒸馏水1000mL。
将制取的假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液、芽孢杆菌菌液以及最终得到的用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂分别单独或进行组合对黄曲霉毒素B1进行降解试验。其中，设定A为假单胞菌菌液，B为黄杆菌菌液，C为红球菌菌液，D为寡养单胞菌菌液，E为芽孢杆菌菌液，而A+B+C+D+E为用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂。
试验方法为：将等量的A、B、C、D、E或者进行组合的菌液接入到含有黄曲霉毒素B1的由葡萄糖4.0g、蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、氯化钠5.0g、酵母粉4.0g、碳酸钙2.0g、硫酸锰5mg以及蒸馏水1000mL组成的培养基中，在PH值为7.0，温度为30℃的条件下，震荡培养24小时。黄曲霉毒素B1的起始浓度为1mg/L。
试验结果如表4：
表4
菌液及其组合 黄曲霉毒素B1降解率
A 65.9％
B 47.1％
C 42.9％
D 52.8％
E 49.7％
A+B 69.9％
A+C 52.5％
A+D 46.8％
A+E 74.2％
A+B+C 68.3％
A+B+D 55.2％
A+B+E 84.8％
A+B+C+D 70.7％
A+B+C+E 78.6％
A+C+D+E 60.1％
A+B+C+D+E 97.8％
通过表4，可以看出当假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液、芽孢杆菌菌液中的其中几种进行混合时有利于对黄曲霉毒素B1的降解，而将假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液、芽孢杆菌菌液按照本实施例中的比例混合在一起发酵形成本实施例中的用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂能够最大限度的对降解黄曲霉毒素B1进行降解，降解率达到97.8％。从而大大地提高了对黄曲霉毒素B1的降解能力，同时也能够更好地降低成本，由于生物降解不会产生二次污染。
综上所述，通过将假单胞菌、黄杆菌、红球菌、寡养单胞菌以及芽孢杆菌分别进行培养，使得假单胞菌、黄杆菌、红球菌、寡养单胞菌以及芽孢杆菌进行大量的繁殖，并且在活性和生长状态达到很好后，得到假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液以及芽孢杆菌菌液。然后将假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液以及芽孢杆菌菌液按照一定比例进行混合，得到复合菌菌液。再将复合菌菌液放入复合菌培养基中进行混合发酵，从而得到可以用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂。通过假单胞菌、黄杆菌、红球菌、寡养单胞菌以及芽孢杆菌的混合协同配合，使得该复合菌剂能够高效快速地对黄曲霉毒素B1进行降解，且降解效果非常好、成本低、无污染。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括：
将假单胞菌、黄杆菌、红球菌、寡养单胞菌以及芽孢杆菌分别进行培养，得到假单胞菌菌液、黄杆菌菌液、红球菌菌液、寡养单胞菌菌液以及芽孢杆菌菌液；
将所述假单胞菌菌液、所述黄杆菌菌液、所述红球菌菌液、所述寡养单胞菌菌液以及所述芽孢杆菌菌液混合，得到复合菌菌液；
将所述复合菌菌液接入复合菌培养基中进行混合发酵。
2.根据权利要求1所述的用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述复合菌菌液中的所述假单胞菌菌液、所述黄杆菌菌液、所述红球菌菌液、所述寡养单胞菌菌液以及所述芽孢杆菌菌液的细胞数分别依次为所述复合菌菌液中细胞总数的10～20％、5～15％、10～35％、5～20％、25～35％。
3.根据权利要求1所述的用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂的制备方法，其特征在于，将所述假单胞菌、所述黄杆菌进行培养是将所述假单胞菌、所述黄杆菌分别接入假单胞菌培养基和黄杆菌培养基中，在温度为27～32℃以及好氧条件下培养45～50小时。
4.根据权利要求3所述的用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述假单胞菌培养基和所述黄杆菌培养基按重量份计均包括蛋白胨4～6份、牛肉浸取物2～4份、氯化钠4～6份、硫酸锰0.004～0.006份以及蒸馏水950～1050份。
5.根据权利要求1所述的用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂的制备方法，其特征在于，将所述红球菌进行培养是将所述红球菌接入红球菌培养基中，在26～30℃的温度下培养45～50小时。
6.根据权利要求5所述的用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述红球菌培养基按重量份计包括葡萄糖3～5份、酵母粉3～5份、麦芽膏9～11份、碳酸钙1.5～2.5份以及蒸馏水950～1050份。
7.根据权利要求1所述的用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂的制备方法，其特征在于，将所述寡养单胞菌和芽孢杆菌进行培养是将所述寡养单胞菌和所述芽孢杆菌分别接入寡养单胞菌培养基和芽孢杆菌培养基中，在27～32℃的温度下培养45～50小时。
8.根据权利要求7所述的用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述寡养单胞菌培养基和所述芽孢杆菌培养基按重量计均包括蛋白胨4～6份、牛肉膏2～4份以及蒸馏水950～1050份。
9.根据权利要求1所述的用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂的制备方法，其特征在于，进行所述混合发酵是将所述复合菌菌液接入所述复合菌培养基中，在温度为26～34℃，PH值为7.0的条件下培养45～50小时，所述复合菌培养基按重量计包括葡萄糖3～5份、蛋白胨4～6份、牛肉浸取物2～4份、氯化钠4～6份、酵母粉3～5份、碳酸钙1.5～2.5份、硫酸锰0.004～0.006份以及蒸馏水950～1050份。
10.一种用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂，其特征在于，其由权利要求1～9任意一项所述的用于降解黄曲霉毒素B1的复合菌剂的制备方法制作而成。
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