CN105891486A - 一种口腔癌特异性检测的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于口腔癌检测的试剂盒。本发明提供的核酸适体，与人BPIFB2蛋白具有较好的亲和能力。利用本发明的核酸适体，可以捕获唾液中的BPIFB2蛋白，通过其含量的变化来检测口腔癌，将其制备成为相应的试剂盒，将用于口腔癌的筛查。利用本发明的试剂盒，具有高灵敏、成本低的好处。

Description

一种口腔癌特异性检测的试剂盒

本申请是申请日为2015年11月15日、申请号为201510775735.6、发明名称为“一种口腔癌特异性检测的试剂盒”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种用于检测口腔癌的试剂盒及其检测方法。

背景技术

口腔癌(Oral Squarmous Cell Carcinomas,0SCC)是人体常见的肿瘤之一，尤其是在发展中国家印度、斯里兰卡、巴西等其发病率可以达到全部肿瘤的25％。近年来口腔癌的发病率在欧美等发达国家有明显的上升趋势，特别是发病年龄趋向年轻化。口腔鳞癌不仅发病率高，且恶性程度较高；往往造成语音、咀嚼、吞咽、面容等功能障碍和严重的面容毁损，并威胁到患者的生命；五年生存率只有60％左右。尽管近来口腔癌手术方法的不断改进和放疗、化疗的广泛应用，但口腔癌的五年生存率并没有明显的提高。导致这一状况的主要原因在于：口腔癌的发病机制不清，侵袭转移机制不明，缺乏有效的早期预防和预后判断手段。因此研究口腔癌发生和发展的分子机制，从中找到口腔癌早期预防、预后判断和治疗方法是口腔癌研究中急待解决的重大问题。

现有技术已知BPIFB2基因与口腔癌的关系：BPIFB2与口腔癌具有很好的相关性，可用于制备口腔癌辅助诊断或者预后制剂，具有重要的临床应用价值。其中BPIFB2在癌旁组织中的表达水平明显低于口腔癌瘤组织和对照质粒OOcopies，而在口腔癌组织中的BPIFB2高表达，即生物信息学筛选得到的BPIFB2基因与口腔癌具有很好的相关性，可用于制备口腔癌辅助诊断或者预后制剂。因此检测BPIFB2的表达变得尤为重要。

核酸适体(Aptamer,又称适配体,适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生物革El标的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术(Systemat1c Evolut1on of L1gands by Exponent1al enr1chment,SELEX)从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核酸适体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有很多优良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速的穿透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性，在生物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异结合BPIFB2的核酸适体及其试剂盒。

本发明提供的核酸适体，是序列表的序列1-15所示的单链DNA。

所述核酸适体与BPIFB2蛋白具有较好的亲和能力。

还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。

所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种：

a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

d)将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。

所述核酸适体可用于制备检测BPIFB2的试剂盒。

利用本发明的核酸适体，可以捕获中唾液中的中的BPIFB2，从而用于相关口腔癌筛查。利用本发明的核酸适体，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。本发明具有很高的应用价值。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1 BPIFB2蛋白的获得

将NP_079503所示的BPIFB2基因通过本领域常规的真核表达方式进行表达，获得了相应的目的多肽蛋白。

实施例2核酸适体的筛选和制备

设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括41个核苷酸的随机核酸文库如下：

5‘-ACCTGATGCCATGCATCGCA(N41)CTAGCCAGCCTTTGACATCA-3’；N41代表41个随机核苷酸。

将单链DNA文库扩增为双链DNA,产物经2％琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75μg RNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ug BPIFB2蛋白，37℃孵育30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(6mol/L尿素，0.55mol/L醋酸铵，l.5mmol/L EDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行11轮。得到了16个适配子，其序列分别为SEQ ID NO:1-16所示。具体序列如下所示：

BPIFB2-1：

ACCTGATGCCATGCATCGCATCACACGATCATCACACCGCTCCGCCTTCCAACTACCGCTCCTAGCCAGCCTTTGACATCA

BPIFB2-2：

ACCTGATGCCATGCATCGCACACCTCCACCCTTCGCAACTACCTCTCTTCCTGTAACTATTCTAGCCAGCCTTTGACATCA

BPIFB2-3：

ACCTGATGCCATGCATCGCATCTCATAACAAATCTTCATAATCTTCTATAACACTGTCAATCTAGCCAGCCTTTGACATCA

BPIFB2-4：

ACCTGATGCCATGCATCGCACATCTATATAGAATATATTCAATCCTCTCTCTTATATGCATCTAGCCAGCCTTTGACATCA

BPIFB2-5：

ACCTGATGCCATGCATCGCACTATCAACGACTCTCACGCAACGCTCTTCTTACTACATATACTAGCCAGCCTTTGACATCA

BPIFB2-6：

ACCTGATGCCATGCATCGCACCATTCATATCACGAACACCCATTTATACTATATACTACCACTAGCCAGCCTTTGACATCA

BPIFB2-7：

ACCTGATGCCATGCATCGCACGCACTAATATCCTTCATCCCTACTAATAACTCTTTTAACCCTAGCCAGCCTTTGACATCA

BPIFB2-8：

ACCTGATGCCATGCATCGCACACACTCATATTTATACACCAATATCATCTCACTCTATCTCCTAGCCAGCCTTTGACATCA

BPIFB2-9：

ACCTGATGCCATGCATCGCAAACCAAGAATGTCTTACGACATCTCGCCTACTATCCTATATCTAGCCAGCCTTTGACATCA

BPIFB2-10：

ACCTGATGCCATGCATCGCACACATAACAATCTATTATTCCTCTATCCGCTCTTATATTCCCTAGCCAGCCTTTGACATCA

BPIFB2-11：

ACCTGATGCCATGCATCGCAAACCAGTCTACTCAACCGACCACCTCAATATCATTCTCATCCTAGCCAGCCTTTGACATCA

BPIFB2-12：

ACCTGATGCCATGCATCGCACTACCTATACAATACTTACTGTCTGCTTCTACTTCTATTATCTAGCCAGCCTTTGACATCA

BPIFB2-13：

ACCTGATGCCATGCATCGCATATACTCGCAATCACTATATAAGACCACATAAATCACTTTACTAGCCAGCCTTTGACATCA

BPIFB2-14：

ACCTGATGCCATGCATCGCACTAACCCAATATTATTAACCGCACCACTCACATAAATCAAGCTAGCCAGCCTTTGACATCA

BPIFB2-15：

ACCTGATGCCATGCATCGCATATCAACTCTCATATATTCTTCACATCCCTACCCTTGTTACCTAGCCAGCCTTTGACATCA

BPIFB2-16：

ACCTGATGCCATGCATCGCAACAACATCTATCTACTTATCAACTTCAAAACTTTCATATTACTAGCCAGCCTTTGACATCA

实施例3蛋白结合适配子的性能测定

将适配子分别取2.0μg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37℃消化lh，纯化回收去磷酸化的RNA；通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射性标记的适配子分别与不同浓度(1-200nM)的BPIFB2 37℃孵育30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与目的蛋白的解离常数。结果如下：

实施例4所述适配子特异性分析以及稳定性分析

分别采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，霍乱弧菌VgrG3C蛋白，大肠杆菌外膜蛋白A，COCH蛋白，BPIFB2蛋白，与16条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与BPIFB2蛋白结合保持较高的特异性。

将所述的适配子，取0.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置三周。通过RT-PCR检测，发现三周的放置其结构稳定，没有被降解。

实施例5所述适配子疾病的诊断

取11个口腔癌患者和4个正常人的唾液分泌物，使用生理盐水稀释，获得目标样本。

将16个偶联有标记的适配子分别与11个患者以及4个正常人的分泌物混合30min，通过生物素分离，定量分析其中的BPIFB2蛋白的含量，通过分析发现，11个口腔癌患者中BPIFB2蛋白的含量显著增加，超过了规定的阈值。达到了口腔癌的诊断标准。由此可见，其诊断效果较好。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

〈110〉陈博

〈120〉一种口腔癌特异性检测的试剂盒

〈160〉15

〈210〉1

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BPIFB2-1

ACCTGATGCCATGCATCGCATCACACGATCATCACACCGCTCCGCCTTCCAACTACCGCTCCTAGCCAGCCTTTGACATCA

〈210〉2

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BPIFB2-2

ACCTGATGCCATGCATCGCACACCTCCACCCTTCGCAACTACCTCTCTTCCTGTAACTATTCTAGCCAGCCTTTGACATCA

〈210〉3

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BPIFB2-3

ACCTGATGCCATGCATCGCATCTCATAACAAATCTTCATAATCTTCTATAACACTGTCAATCTAGCCAGCCTTTGACATCA

〈210〉4

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BPIFB2-4

ACCTGATGCCATGCATCGCACATCTATATAGAATATATTCAATCCTCTCTCTTATATGCATCTAGCCAGCCTTTGACATCA

〈210〉5

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BPIFB2-5

ACCTGATGCCATGCATCGCACTATCAACGACTCTCACGCAACGCTCTTCTTACTACATATACTAGCCAGCCTTTGACATCA

〈210〉6

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BPIFB2-6

ACCTGATGCCATGCATCGCACCATTCATATCACGAACACCCATTTATACTATATACTACCACTAGCCAGCCTTTGACATCA

〈210〉7

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BPIFB2-7

ACCTGATGCCATGCATCGCACGCACTAATATCCTTCATCCCTACTAATAACTCTTTTAACCCTAGCCAGCCTTTGACATCA

〈210〉8

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BPIFB2-8

ACCTGATGCCATGCATCGCACACACTCATATTTATACACCAATATCATCTCACTCTATCTCCTAGCCAGCCTTTGACATCA

〈210〉9

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BPIFB2-9

ACCTGATGCCATGCATCGCAAACCAAGAATGTCTTACGACATCTCGCCTACTATCCTATATCTAGCCAGCCTTTGACATCA

〈210〉10

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BPIFB2-10

ACCTGATGCCATGCATCGCACACATAACAATCTATTATTCCTCTATCCGCTCTTATATTCCCTAGCCAGCCTTTGACATCA

〈210〉11

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BPIFB2-11

ACCTGATGCCATGCATCGCAAACCAGTCTACTCAACCGACCACCTCAATATCATTCTCATCCTAGCCAGCCTTTGACATCA

〈210〉12

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BPIFB2-12

ACCTGATGCCATGCATCGCACTACCTATACAATACTTACTGTCTGCTTCTACTTCTATTATCTAGCCAGCCTTTGACATCA

〈210〉13

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BPIFB2-13

ACCTGATGCCATGCATCGCATATACTCGCAATCACTATATAAGACCACATAAATCACTTTACTAGCCAGCCTTTGACATCA

〈210〉14

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BPIFB2-14

ACCTGATGCCATGCATCGCACTAACCCAATATTATTAACCGCACCACTCACATAAATCAAGCTAGCCAGCCTTTGACATCA

〈210〉15

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BPIFB2-15

ACCTGATGCCATGCATCGCATATCAACTCTCATATATTCTTCACATCCCTACCCTTGTTACCTAGCCAGCCTTTGACATCA

〈210〉16

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉BPIFB2-16

ACCTGATGCCATGCATCGCAACAACATCTATCTACTTATCAACTTCAAAACTTTCATATTACTAGCCAGCCTTTGACATCA

Claims (3)

1.一种用于口腔癌检测的试剂盒，其含有能特异性与BPIFB2蛋白结合的核酸适体。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸适体序列为SEQ ID No：5所示。

3.一种检测口腔癌的方法，其特征在于利用权利要求1-2任一项所述的试剂盒。