CN106282192A - 一种用于检测鼻咽癌的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测鼻咽癌的试剂盒。本发明提供的核酸适体，与人NASG蛋白具有较好的亲和能力。利用本发明的核酸适体，可以捕获鼻咽中的NASG蛋白，通过其含量的变化来检测鼻咽癌，将其制备成为相应的试剂盒，将用于鼻咽癌的筛查。利用本发明的试剂盒，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。

Description

一种用于检测鼻咽癌的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测鼻咽癌的试剂盒及其检测方法。

背景技术

鼻咽癌(NPC)是我国南方常见的恶性肿瘤，广东为高发区。鼻咽癌是指鼻咽粘膜上皮发生的癌肿，大多为低分化鳞癌,其恶性度高，发病部位隐蔽，特别是在咽隐窝和鼻咽顶部者，早期症状不明显，因而难以早期发现，误诊误治率较高，可达12.2％,因而在确诊的鼻咽癌中，其5年生存率长期徘徊在50％～60％左右。对鼻咽癌进行早期诊断以便早期治疗，提高患者的生存率一直是NPC临床研究的重要课题之一。

目前对鼻咽癌早期的检测方法有多种，包括有：EB病毒血清学标记物如病毒壳抗原一免疫球蛋白A(EBVCA 21gA)、EB病毒潜伏膜蛋白、EB病毒早期复合抗原(EBV 2-EA)IgG的抗体检测，鼻咽癌相关肿瘤标记物如白细胞介素、肿瘤坏死因子、细胞间黏附分子、CYFRA2121以及端粒酶等的检测。虽然这些指标的单独或联合应用为鼻咽癌的诊断提供了有用的信息，然而它们均缺乏足够的灵敏度与特异性。

NASG蛋白是一种分泌性蛋白(基因序列登录号：AF439448.1)，在正常人及鼻咽部慢性炎症患者的鼻咽组织中表达丰富，而在鼻咽癌患者的鼻咽组织中表达显著下调。因而如何通过检测NASG蛋白的含量以及如何无创伤地获取NASG蛋白则是建立早期、无创伤检测鼻咽癌的有效方法。

核酸适体(Aptamer,又称适配体,适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生物革El标的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术(Systemat1c Evolut1on of L1gands by Exponent1al enr1chment,SELEX)从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核酸适体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有很多优良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速的穿透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性，在生物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异结合NASG的核酸适体及其试剂盒。

本发明提供的核酸适体，是序列表的序列1-15任一项所示的单链DNA。

所述核酸适体与NASG蛋白具有较好的亲和能力。

还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。

所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种：

a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

d)将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。

所述核酸适体可用于制备检测NASG的试剂盒。

利用本发明的核酸适体，可以捕获中鼻咽组织中的中的NASG，从而用于相关鼻咽癌筛查。利用本发明的核酸适体，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。本发明具有很高的应用价值。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1NASG蛋白的获得

将AF439448.1所示的NASG基因通过本领域常规的真核表达方式进行表达，获得了相应的目的多肽蛋白。

实施例2核酸适体的筛选和制备

设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括40个核苷酸的随机核酸文库如下：

5‘-TAGCATGCAATGCCAGTATAG(N40)AACGTGCATGAACTATGAGT-3’；N40代表40个随机核苷酸。

将单链DNA文库扩增为双链DNA,产物经2％琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75μg RNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ugNASG蛋白，37℃孵育30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(6mol/L尿素，0.55mol/L醋酸铵，l.5mmol/L EDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1 DEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行10轮。得到了15个适配子，其序列分别为SEQ ID NO:1-15所示。具体序列如下所示：

NASG-1：

TAGCATGCAATGCCAGTATAGAATATTCAAGATTTCTATAACACATTCAGATTCCAACATTAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO:1)

NASG-2：

TAGCATGCAATGCCAGTATAGATCGCAACTCCATCACGCATCCCTACTCTTATAGATCACCAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO:2)

NASG-3：

TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCTCGAACGCACATTACATACATCTTAGTAATTATCTTTAAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO:3)

NASG-4：

TAGCATGCAATGCCAGTATAGTTTCTTTCACATATTCGCAATACAACAAACCTCTGCCACAAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO:4)

NASG-5：

TAGCATGCAATGCCAGTATAGCATTATATTCTTATCCACGCCTCTATCTACACTCAAAGAAAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO:5)

NASG-6：

TAGCATGCAATGCCAGTATAGAATCCTTACGCTCGCTCATTAATCACCACCTATAAATTCCAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO:6)

NASG-7：

TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCAAACAACTCAAGATAATCACTATTACAGAACAACAACTAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO:7)

NASG-8：

TAGCATGCAATGCCAGTATAGATATAGATCATACAAATATATTATTCCGCCTACAATTCCAAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO:8)

NASG-9：

TAGCATGCAATGCCAGTATAGTATCTTAATCAACGCATTACAAGACCTATAATTAACATACAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO:9)

NASG-10：

TAGCATGCAATGCCAGTATAGTTACTCATCGCCTCTCCACCTACCGCCTATACTCTACTACAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO:10)

NASG-11：

TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCAATTTTCACTATTAACACCAATAATTAAGATAACGAACAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO:11)

NASG-12：

TAGCATGCAATGCCAGTATAGAGACTCTATACATATATTCACTCTCCTTAATCAACAATTCAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO:12)

NASG-13：

TAGCATGCAATGCCAGTATAGTATCTATAGACACTCTCAATTCCAGAATTAACCTCGCCTCAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO:13)

NASG-14：

TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCACTTAATAATATTTCTCTTACGCTAATATATCCAACCCAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO:14)

NASG-15：

TAGCATGCAATGCCAGTATAGCTATATACACTATCACATTCCAGAATTAACCTCACCTCACAACGTGCATGAACTATGAGT(SEQ ID NO:15)

实施例3蛋白结合适配子的性能测定

将适配子分别取2.0μg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37℃消化lh，纯化回收去磷酸化的RNA；通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射性标记的适配子分别与不同浓度(1-200nM)的NASG 37℃孵育30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与leptin的解离常数。结果如下：

名称	解离常数Kd(单位nM)
		NASG-1	13.5
NASG-2	13.9
		NASG-3	13.8
NASG-4	13.0
		NASG-5	13.5
NASG-6	14.1
		NASG-7	13.8
NASG-8	13.7
		NASG-9	13.7
NASG-10	14.0
		NASG-11	13.9
NASG-12	13.8
		NASG-13	13.4
NASG-14	13.5
		NASG-15	13.5
PBS空白对照	无结合能力

实施例4所述适配子特异性分析以及稳定性分析

分别采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，霍乱弧菌VgrG3C蛋白，大肠杆菌外膜蛋白A，COCH蛋白，NASG蛋白，与15条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与NASG蛋白结合保持较高的特异性。

将所述的适配子，取0.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置三周。通过RT-PCR检测，发现三周的放置其结构稳定，没有被降解。

实施例5所述适配子疾病的诊断

取10个患者和2个正常人的鼻咽分泌物。生理盐水冲洗鼻腔，用细棉签在鼻视镜下插到鼻咽部，放置5-8分钟，取出棉签，将棉球放入底部空心，外套有离心收集管的小离心管中，在4摄氏度下7500g离心获取分泌物，使用生理盐水稀释，获得目标样本。

将15个适配子分别与10个患者以及2个正常人的分泌物混合30min，通过生物素分离，定量分析其中的NASG蛋白的含量，通过分析发现，10个鼻咽癌患者中NASG蛋白的含量显著增加3倍以上。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

〈110〉张玲

〈120〉一种用于检测鼻咽癌的试剂盒及其检测方法

〈160〉15

〈210〉1

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉NASG-1

TAGCATGCAATGCCAGTATAGAATATTCAAGATTTCTATAACACATTCAGATTCCAACATTAACGTGCATGAACTATGAGT

〈210〉2

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉NASG-2

TAGCATGCAATGCCAGTATAGATCGCAACTCCATCACGCATCCCTACTCTTATAGATCACCAACGTGCATGAACTATGAGT

〈210〉3

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉NASG-3

TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCTCGAACGCACATTACATACATCTTAGTAATTATCTTTAAACGTGCATGAACTATGAGT

〈210〉4

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉NASG-4

TAGCATGCAATGCCAGTATAGTTTCTTTCACATATTCGCAATACAACAAACCTCTGCCACAAACGTGCATGAACTATGAGT

〈210〉5

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉NASG-5

TAGCATGCAATGCCAGTATAGCATTATATTCTTATCCACGCCTCTATCTACACTCAAAGAAAACGTGCATGAACTATGAGT

〈210〉6

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉NASG-6

TAGCATGCAATGCCAGTATAGAATCCTTACGCTCGCTCATTAATCACCACCTATAAATTCCAACGTGCATGAACTATGAGT

〈210〉7

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉NASG-7

TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCAAACAACTCAAGATAATCACTATTACAGAACAACAACTAACGTGCATGAACTATGAGT

〈210〉8

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉NASG-8

TAGCATGCAATGCCAGTATAGATATAGATCATACAAATATATTATTCCGCCTACAATTCCAAACGTGCATGAACTATGAGT

〈210〉9

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉NASG-9

TAGCATGCAATGCCAGTATAGTATCTTAATCAACGCATTACAAGACCTATAATTAACATACAACGTGCATGAACTATGAGT

〈210〉10

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉NASG-10

TAGCATGCAATGCCAGTATAGTTACTCATCGCCTCTCCACCTACCGCCTATACTCTACTACAACGTGCATGAACTATGAGT

〈210〉11

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉NASG-11

TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCAATTTTCACTATTAACACCAATAATTAAGATAACGAACAACGTGCATGAACTATGAGT

〈210〉12

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉NASG-12

TAGCATGCAATGCCAGTATAGAGACTCTATACATATATTCACTCTCCTTAATCAACAATTCAACGTGCATGAACTATGAGT

〈210〉13

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉NASG-13

TAGCATGCAATGCCAGTATAGTATCTATAGACACTCTCAATTCCAGAATTAACCTCGCCTCAACGTGCATGAACTATGAGT

〈210〉14

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉NASG-14

TAGCATGCAATGCCAGTATAGCCACTTAATAATATTTCTCTTACGCTAATATATCCAACCCAACGTGCATGAACTATGAGT

〈210〉15

〈211〉 81

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉NASG-15

TAGCATGCAATGCCAGTATAGCTATATACACTATCACATTCCAGAATTAACCTCACCTCACAACGTGCATGAACTATGAGT

Claims (3)

1.一种用于鼻咽癌检测的试剂盒，其含有特异结合NASG蛋白的核酸适体。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸适体序列为SEQ ID No：13所述。

3.一种检测鼻咽癌的方法，其特征在于利用权利要求1-2任一项所述的试剂盒。