CN105891342B - 烯丙雌醇杂质的制备方法及其在烯丙雌醇质量分析中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种烯丙雌醇产生的杂质制备方法，该方法从原料和/或其制备过程中的反应液中，所制备的杂质标准品用于烯丙雌醇原料及其制剂分析检测。

Description

烯丙雌醇杂质的制备方法及其在烯丙雌醇质量分析中的应用

技术领域

本发明涉及分析化学领域，尤其涉及药物分析化学领域，特别涉及烯丙雌醇的杂质制备和分析方法。

背景技术

烯丙雌醇(Allylestrenol)化学名：(17β)-17-(2-丙烯)雌甾-4-烯-17-醇是人工合成的孕激素，是合成的口服有效的孕酮类药物。烯丙雌醇作为合成孕激素早在1973年开始运用于自然流产和早产的治疗，已在数十个国家上市。烯丙雌醇片由匈亚利吉瑞大药厂(Gedeon Richter Ltd.)生产，于2000年在我国注册并进口上市，其商品名为：多力玛(Turinal)。每片含烯丙雌醇5mg。本品在我国上市以来临床使用良好，受到欢迎，并已收入我国基本医疗保险药品目录。

烯丙雌甾醇类化合物是一种甾体化合物，该类化合物是环戊烷并多氢菲——甾核衍生的一类化合物的总称，拥有多个手心中心及活性碳原子，环内双键位置易发生变化，同时有加成、消除等反应发生，因此在化学反应过程中易发生很多副反应，产生许多与目标产物相似的异构体。目前，国内几乎没有对此类杂质研究的报道，如何获得这些杂质在技术上有较高的难度，这也是目前对此类杂质研究不多的重要原因。而杂质的研究是药品研发的一项重要内容，它包括选择合适的分析方法，准确地分辨与测定杂质的含量并综合药学、毒理及临床研究的结果确定杂质的合理限度。这一研究贯穿于药品研发的整个过程。由于药品在临床使用中产生的不良反应除了与药品本身的药理活性有关外，有时与药品中存在的杂质也有很大关系。所以规范地进行杂质的研究，并将其控制在一个安全、合理的限度范围之内，将直接关系到上市药品的质量及安全性。对杂质研究的首要条件是得到杂质的样品，因此制备或分离纯化杂质在杂质研究过程中显得十分重要，而对于未知杂质，纯化分离就显得更为重要！

烯丙雌醇最后的反应由雌烯酮和烯丙基溴通过格氏反应制得。反应式如下：

国外有文献报道，在反应过程中会产生7种副反应产物，结构分别如下：

附图说明

图1：粗纯化图谱

图2：二次纯化图谱

图3：杂质B样品检测图谱

图4：烯丙雌醇检测图谱

图5：对照溶液图(0.1％)

图6：烯丙雌醇及杂质分离度图谱

发明内容

在制备烯丙雌醇样品过程中，经检测，发现除了有雌烯酮(杂质A)存在外还有另一种未知杂质(杂质B)的存在，这种杂质会对烯丙雌醇原料药的质量产生影响。通过LC/MS分析，确定了未知杂质的分子量为298，这与文献报道的化合物3，6-Dehydro-allylestrenol和8(14)-Dehydro-allylestrenol分子量一致，因此，该杂质可能是此两种化合物中的一种，也可能是其文献未报道的异构体。该未知杂质，是合成过程中生成的副产物，而且结构未知，无法通过合成获得，最有效的而又快捷的方法是通过柱层析分析纯化制得，而普通正向硅胶柱因柱压低，柱效差，无法有效分离杂质，因此，采用高压制备液相系统纯化是最佳的选择。

本发明的一个目的在于分离制备烯丙雌醇原料药中杂质B的标准品并且对杂质进行结构鉴定。

本发明的另一个目的在于将所制备的杂质B标准品用于该产品原料药及其制剂的质量分析，同时也为工艺条件的选择提供参考，有利于生产过程中药品质量的控制。

本发明的再一个目的在于提供烯丙雌醇原料的杂质B制备和分析方法，该方法用于从制备烯丙雌醇原料药过程中分离制备所述杂质，并用于对烯丙雌醇及其制剂进行分析。

本申请人对制备过程中处理的母液分别经制备液相纯化，制得该杂质的标准品，并经结构确证，该杂质(杂质B)结构为：

中文通用名：Δ3，5-烯丙雌醇；3，6-二烯烯丙雌醇，简称“烯丙雌醇杂质B”

中文化学名：(17β)-17α-(2-丙烯)雌甾-3，5-二烯-17-醇

英文通用名：Δ3，5-Dehydro-Allylestrenol；3，6-Dehydro-allylestrenol

英文化学名：(17β)-17α-(2-Propenyl)estr-3，5-diene-17-ol

任何影响药物纯度的物质统称为杂质。杂质的研究是药品研发的一项重要内容。它包括选择合适的分析方法，准确地分辨与测定杂质的含量并综合药学、毒理及临床研究的结果确定杂质的合理限度。这一研究贯穿于药品研发的整个过程。药品中的杂质按其理化性质一般分为三类：有机杂质、无机杂质及残留溶剂。按照其来源，杂质可以分为工艺杂质(包括合成中未反应完全的反应物及试剂、中间体、副产物等)、降解产物、从反应物及试剂中混入的杂质等。按照其毒性分类，杂质又可分为毒性杂质和普通杂质等。杂质还可按其化学结构分类，如其它甾体、其它生物碱、几何异构体、光学异构体和聚合物等。有机杂质包括工艺中引入的杂质和降解产物等，可能是已知的或未知的、挥发性的或不挥发性的。由于这类杂质的化学结构一般与活性成分类似或具渊源关系，故通常又可称之为有关物质。分析方法的选择直接关系到杂质测定结果的专属性与准确性，因此，在进行杂质研究时首要问题是选择合适的杂质分析方法。

药物杂质检查分析方法应灵敏、专属。通过合适的分析技术将不同结构的杂质进行分离、检测，从而达到对杂质的有效控制。随着分离、检测技术的发展与更新，高效、快速的分离技术与灵敏、稳定、准确、适用的检测手段相结合，几乎所有的有机杂质均能在合适的条件下得到很好的分离与检测。在质量标准中，目前普遍采用的杂质检测方法主要为高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography；HPLC)、薄层色谱法(ThinLayer Chromatography；TLC)、气相色谱法(Gas Chromatography；GC)和毛细管电泳法(Capillary Electrophoresis；CE)。近年来，质谱技术在药物杂质分析方面应用日益广泛，气相色谱联用技术、液相色谱联用技术已经成为药物杂质分析的重要手段。

本发明方法对原料药中的杂质进行分析、制备和结构确证，所制备的杂质标准品可用于该产品原料药及其制剂的质量分析，同时也可以为工艺条件的选择提供参考，有利于生产过程中药品质量的控制。

本发明的杂质可通过以下方法制备得到。

1、烯丙雌醇的制备过程

将Mg(10g)、乙醚(50ml)、少许碘加入带回流冷凝管、搅拌的三口瓶内，搅拌下慢慢滴加3-溴丙烯(33ml)乙醚(35ml)溶液(反应液很快回流，如不反应可加热引发)，滴加约1/3后，同时滴加原料雌烯酮(24g)乙醚(400)溶液，保持自然回流反应。继续加热回流反应1h，冰水冷却下慢慢滴加浓HCl(36ml)水(240ml)(反应剧烈，放出氢气)，滴毕，搅拌1h，分出乙醚层，水洗一次，无水Na₂SO₄干燥，浓缩乙醚，加入60ml冰醋酸，加热溶解，冷却结晶，过滤，抽干，得到白色固体(烯丙雌醇)。滤液浓缩干得固体，待用。

2、杂质B的制备过程

经HPLC分析，成品中包括2种杂质，一种为已知杂质(杂质A，反应原料)，另一种为未知杂质(杂质B)，该杂质的含量低于0.1％，采用从成品中制备分离杂质的可行性不强，但经对合成过程中的母液进行分析，该杂质的含量较高，含量为3％左右，故采用从合成过程中处理过的母液中制备分离杂质。

烯丙雌醇杂质的制备

将上述步骤中滤液浓缩干后所得的固体经高压制备液相纯化、处理可得到高纯杂质对照品，具体操作如下：

纯化条件：

梯度洗脱比例：

时间(分)	流动相A％	流动相B％
			0	28	72
8	11	89
			60	11	89

具体操作步骤：

(1)粗纯化

取2g浓缩至干得到的固体用42％流动相B超声溶解，注入纯化柱中，梯度洗脱，分时段收集馏分，合并含杂质纯化液。经初步纯化，将多批次纯化得到的含杂质的组分合并，得含杂质样品2g(杂质B粗品)，纯度约65％。

(2)二次纯化

将所得杂质B粗品0.5g用流动相溶解，注入纯化柱中，梯度洗脱。根据出峰时间，分时段收集馏分(31-35min)。将多批次纯化得到的含杂质B的组分合并，浓缩至干，共得杂质B0.6g，纯度约86％。(流动相：水∶(乙腈∶甲醇＝8∶2)体积比：10∶90，)

(3)结晶

将得到的杂质样品0.6g用2ml乙腈加热至70-80℃溶解，0-10℃冷却结晶，过滤，干燥得白色针状结晶130mg，纯度99.17％。母液回收，浓缩结晶得固体100mg，纯度97％。剩余二次母液蒸干后可继续纯化。

上述纯化过程中的分析检测条件为：

检测波长215nm

柱温：30℃

流动相：水∶(乙腈∶甲醇＝8∶2)体积比＝10∶90

分析色谱柱：Phenomenex 250×4.60mm Luna 5μC 18

所制得的杂质B样品，可作为杂质对照品用于烯丙雌醇原料及其制剂分析检测。

3、烯丙雌醇的分析检测

取本品约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，加乙腈-水(8∶2)溶解并稀释至刻度，摇匀，作供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，加乙腈-水(8∶2)稀释制成每1ml中约含烯丙雌醇2μg的溶液作为对照溶液(0.1)；精密称取杂质A(雌烯酮)、杂质B(Δ3，5-烯丙雌醇)和烯丙雌醇适量，用乙腈溶解并稀释制成每1ml中含A、B及烯丙雌醇各约15μg的混合溶液作为混合对照品溶液。照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录VD)测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，加保护柱。流动相A为乙腈-甲醇(8∶2)；流动相B为水；流速为每分钟1.0ml；检测波长为210nm。按下表进行线性梯度洗脱。理论板数按烯丙雌醇峰计算不低于2000，杂质A、杂质B和烯丙雌醇的分离度应符合规定。精密量取混合对照品溶液50μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使杂质峰的峰高为满量程的10％-20％。再精密量取供试品溶液、对照溶液及混合对照品溶液各50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

限度要求：供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，其中杂质A和杂质B的量按外标法以峰面积计算，分别不得过0.15％；其余单个杂质峰(梯度溶剂峰不计)的面积不得过对照溶液主峰面积(0.1％)，总杂质不得过1.0％。

实施例

实施例1：烯丙雌醇的制备过程

将Mg(10g)、乙醚(50ml)、少许碘加入带回流冷凝管、搅拌的三口瓶内，搅拌下慢慢滴加3-溴丙烯(33ml)乙醚(35ml)溶液(反应液很快回流，如不反应可加热引发)，滴加约1/3后，同时滴加原料雌烯酮(24g)乙醚(400ml)溶液，保持自然回流反应。继续加热回流反应1h，冰水冷却下慢慢滴加浓HCl(36ml)水(240ml)(反应剧烈，放出氢气)，滴毕，搅拌1h，分出乙醚层，水洗一次，无水Na₂SO₄干燥，浓缩乙醚，加入60ml冰醋酸，加热溶解，冷却结晶，过滤，抽干，得到白色固体(烯丙雌醇)。滤液浓缩干得固体，待用。

实施例2、杂质B的制备过程

将上述步骤中滤液浓缩干后所得固体经高压制备液相纯化、处理可得到高纯的的杂质对照品，具体操作如下：

纯化条件：

梯度洗脱比例：

时间(分)	流动相A％	流动相B％
			0	28	72
8	11	89
			60	11	89

具体操作步骤：

(1)粗纯化

单次纯化取2g浓缩至干得到固体用42％流动相B超声溶解，注入纯化柱中，梯度洗脱，分时段收集馏分，合并含杂质B纯化液。

经初步纯化，将5批次纯化得到的含杂质的组分合并，得含杂质样品2g(杂质B粗品)，纯化图谱如图1，经HPLC检测，纯度约65％。

(2)二次纯化

单次纯化将所得杂质B粗品0.5g用流动相溶解，注入纯化柱中，梯度洗脱。根据出峰时间，分时段收集馏分。

将4批次纯化得到的含杂质B的组分合并，浓缩至干，共得杂质B 0.6g，二次纯化图谱如图2，经HPLC检测，纯度约86％。

(3)结晶

将得到的杂质B样品0.6g用2ml乙腈加热至70-80℃溶解，过滤，0-10℃冷却结晶，过滤，干燥得白色针状结晶130mg，纯度99.17％，HPLC检测图谱见图3。母液回收，浓缩结晶得固体100mg，纯度97％。剩余二次母液蒸干后可按上述方法继续纯化。

实施例3、杂质B用于烯丙雌醇的分析检测

精密称定烯丙雌醇21.52mg，，置10ml量瓶中，加乙腈-水(8∶2)溶解并稀释至刻度，摇匀，2.152mg/ml，作供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，加乙腈-水(8∶2)稀释制成每1ml中含烯丙雌醇2.152μg的溶液作为对照溶液(0.1％)；精密称取杂质A(雌烯酮)15.84mg、杂质B(Δ3，5-烯丙雌醇)16.43mg和烯丙雌醇16.67mg，用乙腈溶解并稀释制成每1ml中含A15.84μg、B16.43μg、烯丙雌醇16.67μg的混合溶液作为混合对照品溶液。照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录VD)测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，加保护柱。流动相A为乙腈-甲醇(8∶2)；流动相B为水；流速为每分钟1.0ml；检测波长为210nm。按下表进行线性梯度洗脱。理论板数按烯丙雌醇峰计算不低于2000，杂质A、杂质B及烯丙雌醇的分离度应符合规定。精密量取混合对照品溶液50μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使杂质峰的峰高为满量程的10％-20％。再精密量取供试品溶液、对照溶液及混合对照品溶液各50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，分别为图4、图5、图6。

供试品溶液的色谱图中含有杂质峰，其中杂质A和杂质B的量按外标法以峰面积计算，杂质A为0.08％，杂质B为0.06％，其他最大单个杂质为0.02％，总杂质为0.16％。

Claims (6)

1.一种烯丙雌醇的杂质的分析制备方法，其特征在于，对烯丙雌醇原料进行分析，并从原料或制备原料过程中分离所述杂质，包括以下步骤：

(a)用HPLC/LC-MS法测定所述烯丙雌醇原料，根据被分析的相对保留时间和/或分子量确定所述原料中的一种或多种杂质；

(b)根据步骤(a)所述的杂质相对保留时间所显示的色谱行为确定制备色谱法的条件，用制备色谱法收集所述相对保留时间对应的杂质,采用反相硅胶柱层析法富集该相对保留时间的杂质；

(c)根据步骤(b)所述的，富集的该相对保留时间的杂质，达到一定的纯度和收集量后，采用结晶方法制得高纯度标准品；

其中，制备的杂质为杂质B，其结构式如下：

其中，步骤(b)中所述的反相柱层析法富集采用的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶填料，流动相为乙腈、甲醇、水的组合；

所采用的制备色谱法所采用条件包括：

流动相：流动相A为水，流动相B为乙腈：甲醇＝(60～90):(40～10)

梯度洗脱比例：

时间(分) 流动相A％ 流动相B％ 0 28 72 8 11 89 60 11 89

柱温：10-40℃；

检测波长：200-230nm；

流速：20-60ml/分钟；

制备柱：Φ50mm×(100～300mm)，C18，10μm。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所采用的制备色谱法所采用条件包括：

流动相：流动相A为水，流动相B为乙腈：甲醇＝80:20

柱温：30℃；

检测波长：215nm；

流速：40ml/分钟；

制备柱：Φ50mm×(100～300mm)，C18，10μm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(b)包括：

(1)将样品溶解于一定比例的流动相后，湿法上柱；

(2)采用设定的梯度比例洗脱，接收含指定杂质的组分；

(3)合并含杂质B的组分备用。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(c)包括：

(1)将所得杂质B用溶剂加热溶解；

(2)热滤，冷却结晶；

(3)过滤，干燥得到高纯度样品。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(c)所采用的结晶条件为：

(1)采用的结晶溶剂为乙腈；

(2)乙腈用量为杂质B量的2-6倍；

(3)溶解温度为50-80℃；

(4)结晶温度为-10-20℃。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(c)所采用的结晶条件为：

(1)采用的结晶溶剂为乙腈；

(2)乙腈用量为杂质B量的3-4倍；

(3)溶解温度为70-80℃；

(4)结晶温度为0-10℃。