CN105861737B - 一种检测人类C-Kit基因9号外显子突变的诊断试剂盒和方法 - Google Patents
一种检测人类C-Kit基因9号外显子突变的诊断试剂盒和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测人类c‑kit基因突变类型的试剂盒，它包括SEQ ID NO.1～3所示的引物对和SEQ ID NO.4所示的探针。本发明还公开了一种检测人类c‑kit基因9号外显子突变的方法。本发明试剂盒和方法可以准确检测人类c‑kit基因9号外显子的Y503_F504insAH、A501_Y502dup或A502_Y503dup突变，为GIST患者的用药提供指导，临床应用前景良好。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种检测人类C-Kit基因9号外显子突变的诊断试剂盒和方法。
背景技术
胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromaltumors，GIST)是一类起源于胃肠道间叶组织的肿瘤，是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤，多发于中老年患者，男女发病率无明显差异。Mazur等在1983年提出，GIST是一类区别于平滑肌瘤和神经源性肿瘤的独立肿瘤类型，其直接病因是癌基因获得性功能突变。
早期治疗GIST主要依赖手术切除，但是即使肿瘤完全切除，也有很多患者死于肿瘤的复发和转移，而传统的放疗和化疗也没有明显的疗效。靶向药物特别是酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼的出现使得GIST治疗发生了根本性的改变，现在对于GIST的治疗已发展为针对不同病情，采取包括手术、辅助治疗和新辅助治疗的个性化综合治疗。目前临床上治疗GIST的一线靶向药物是格列卫(伊马替尼，诺华制药)，二线药物索坦(舒尼替尼，辉瑞制药)，每个患者年消费均为十余万人民币。
但靶向药物的疗效与有GIST患者有无基因突变及突变位点密切相关，不同的基因突变类型患者，辅助治疗的获益存在差异，因此靶向治疗之前需进行基因检测，以预测靶向治疗的疗效并指导靶向药物种类和剂量的选用。其规范的用药方案已经进入《中国胃肠间质瘤诊断治疗共识》(2013年版)。
GIST患者根据其基因突变类型，可从分子水平分为3类：C-Kit突变型(80～85％)，PDGFRα突变型(5～10％)和野生型GIST(10％)。其中，C-Kit基因位于人染色体4q12-13，全长5230bp，含21个外显子。C-Kit基因的突变形式多样，包括缺失突变、点突变和插入突变，突变位点主要发生在第9号(10％)、11号(70％)、13号(1％)、17号外显子(1％)。
研究表明，C-Kit基因突变不仅可协助明确诊断GIST，而且其突变位点与GIST靶向药物的治疗反应、用药剂量和预后有关。其中，从伊马替尼治疗反应上看，C-Kit基因有突变的GIST病例比C-Kit野生型病例治疗反应效果好，患者肿瘤无明显进展的生存期长；C-Kit有突变的GIST病例中，伊马替尼的疗效由高到低依次为：11号外显子突变者、9号外显子突变者、13号外显子突变者、17号外显子突变者；另外，在伊马替尼起始用药剂量选择上,也会因突变位点不同而异。从酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼治疗反应上看，舒尼替尼二线治疗原发C-Kit 9号外显子突变和野生型GIST病例的疗效优于11号外显子突变患者；治疗继发性C-Kit的13号外显子突变患者的疗效优于继发17号突变外显子。因此，检测C-Kit基因的突变位点，对于指导GIST患者的合理用药，以进行GIST个体化诊疗，具有重要参考价值。
但是，目前检测人类C-Kit基因9号外显子突变，主要是通过传统的测序方式，测序的耗费时间长且成本高，不利用普通的临床检测。即使有少数使用荧光定量PCR法的报道，也是仅对9号外显子的其中某一个位点进行检测，检测位点单一，无法对9号外显子进行多个突变位点的评估，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的定量PCR检测人类C-Kit基因突变的试剂盒和方法。
C-Kit基因9号外显子的主要突变信息如下：
本发明提供了一种检测人类c-kit基因突变类型的试剂盒，它包括SEQ ID NO.1～3所示的引物对和SEQ ID NO.4所示的探针。
其中，它还包括质控引物与质控探针：SEQ ID NO.5～7所示引物对与SEQ ID NO.8所示的探针。
本发明还提供了所述试剂盒在制备检测人类c-kit基因9号外显子突变的试剂中的用途。
其中，所述9号外显子突变为Y503_F504insAH、A501_Y502dup或A502_Y503dup突变。
本发明还提供了SEQ ID NO.1～3所示引物对。
本发明还提供了SEQ ID NO.4所示的探针。
本发明还提供了一种检测人类c-kit基因9号外显子突变的方法，它包括如下步骤：
(1)提取样本DNA：取待检组织，提取其中的DNA；
(2)基因扩增：用上述试剂盒对待检样本中的DNA进行扩增；
(3)结果检测：对DNA扩增结果进行检测。
其中，所述9号外显子突变为Y503_F504insAH、A501_Y502dup或A502_Y503dup突变。
本发明设计的特定引物，可以用于检出9号外显子的主要突变类型包括Y503_F504insAH、A501_Y502dup和A502_Y503dup突变。只要本发明检测试剂盒和方法测出有突变，就可以确认C-Kit基因的9号外显子存在Y503_F504insAH、A501_Y502dup和A502_Y503dup三种突变类型的至少一种突变。从而可以预测GIST患者对靶向药物的治疗反应、用药剂量和预后。
本发明提供的试剂盒可以同时准确检测待检人群是否出现C-Kit基因的9号外显子上的3个突变位点，更能准确判断待检GIST患者的药物反应，为GIST患者的用药提供指导，且灵敏度高，特异性好，而且检测快速、简便，成本低廉，可以大量推广使用，临床应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为突变型样本测序结果图
图2为特异性检测结果图
图3为灵敏度检测结果图：编号1-4分别为浓度为8ng/ul、4ng/ul、2ng/ul、1ng/ul的DNA扩增结果。
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
本发明所用的实验试剂与仪器如下：
FastStartTaq DNA Polymerase：购自Roche公司，Cat No.12 032 937 001；
Uracil DNA Glycosylase(UNG),heat labile 200U 2u/l：购自大连Takara公司，Cat No.2820；
dU plus dNTP Mixture(12.5×)(dATP 2.5mM,dGTP 2.5mM,dCTP 2.5mM,dUTP7.5mM,)：购自大连Takara公司，Cat No.4035。
实施例1本发明检测C-Kit基因9号外显子突变的试剂盒和检测方法
一、本发明试剂盒的组成
PCR扩增试剂(1人份)：
| 水 | 14.85μl |
| 10XPCR buffer | 2.5μl |
| MgCl<sub>2</sub>(25mM) | 0.75μl |
| UTP PLUS | 0.5μl |
| Primer溶液 | 1μl |
| UNG | 0.2μl |
| Taq | 0.2μl |
| 总体系 | 20μl |
其中“Primer溶液”配制如下：
| C9F(100nM/ml) | 3.125μl |
| C9F2(100nM/ml) | 3.125μl |
| C9R(100nM/ml) | 3.125μl |
| C9P(100nM/ml) | 0.625μl |
| H2O | 15μl |
| total | 25μl |
c-kit基因9号外显子突变的扩增引物以及检测探针如下：
外控引物及探针：
二、采用本发明试剂盒检测C-Kit基因9号外显子突变
1、样本DNA提取：可以使用Qiagen公司、天根公司、Promega公司等DNA提取试剂盒提取。
以石蜡组织样本，用Qiagen公司试剂盒为例，提取DNA。
1)利用手术刀取出组织边界无用的石蜡；
2)将石蜡包埋组织切成4μm厚的薄片；
3)迅速用灭菌小镊子取2—6枚装入DNase/RNase Free EP管中(每张摊开面积500(最大)mm2，即边长1.6cm的正方形大小；
4)加入800μl二甲苯，振荡器上震荡10s，最大转数离心3分钟；
5)加入800μl二甲苯，振荡器上震荡10s，最大转数离心3分钟；
6)弃二甲苯，加入800μl无水乙醇，最大转数离心3分钟；
7)弃无水乙醇，挥干样品；
8)加入180μl ALT buffer及20μl proteinase K，56℃一小时以上，直至清亮；
9)90℃一小时；
10)离心6000g 1min，取上清；(此步骤是防止沉淀物阻塞柱子)
11)加入200μl AL,混匀，加入200μl乙醇，再混匀；
12)简单离心清洁管壁；
13)将全部混合液加入到DNA分离柱，关盖，离心6000g 1min，换新的收集管；
14)加入500μl AW1,6000g离心1min；换收集管；
15)加入500μl AW2，6000g离心1min，换收集管；
16)全速离心3min，干燥柱子；
17)换一只干净的1.5ml收集管，准备收集DNA；加入20-30μl ATE,在室温保持1min以溶解DNA。全速离心1min收集DNA。
2、定量PCR扩增
c-kit基因突变的扩增引物以及检测探针：
C9引物溶液(Primer溶液)配制如下，配制出引物溶液后，在定量PCR体系中加入1ul即可。
c-kit外控引物溶液(Primer溶液)配制如下，配制出引物溶液后，在定量PCR体系中加入1ul即可。
| 471阳性 | 3.125ml |
| 801阳性 | 3.125ml |
| C11R | 3.125ml |
| C11P | 0.625ml |
| H2O | 15ml |
| Total | 25ml |
1)定量PCR体系配制：
| 水 | 14.85μl |
| 10XPCR buffer | 2.5μl |
| MgCl2 | 0.75μl |
| UTP PLUS | 0.5μl |
| Primer溶液 | 1μl |
| UNG | 0.2μl |
| Taq | 0.2μl |
| DNA | 5μl(浓度为3ng/μl) |
| 总体系 | 25μl |
按照如下表格加样入2个PCR管：
2)BIO-RAD CFX96机器PCR热循环程序设置：
3、结果判读：
以外控信号为标准，其信号Ct值在15-25，表明上样DNA的量在允许范围以内。所有实验样本的外控曲线均应该升起，否则重新提取DNA检测。读取待检孔(孔号1)Ct值，Ct值为0(或者无扩增曲线)或者大于29判读阴性，判定为无C9突变；Ct值小于28判读该信号孔阳性。28～29重复实验，若仍然在28～29判读C9弱阳性突变。
其中，阳性、弱阳性：代表样品有突变，突变类型为Y503_F504insAH、A501_Y502dup或A502_Y503dup突变
以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：
实验例1本发明试剂盒以及方法的准确性和特异性检测
1、待检样本
选取已知突变类型为c-kit基因9号外显子突变(分别为Y503_F504insAH、A501_Y502dup、A502_Y503dup突变)的临床GIST石蜡组织样本各1例(其中，Y503_F504insAH突变的测序结果见图1)和已知野生型临床GIST石蜡组织样本1例，检测人类c-kit基因突变类型。
2、检测方法
本发明方法：采用实施例1的试剂盒，按照实施例1的方法进行检测。
样本DNA提取方法：用Qiagen公司试剂盒提取：
1)利用手术刀取出组织边界无用的石蜡；
2)将石蜡包埋组织切成4μm厚的薄片；
3)迅速用灭菌小镊子取2—6枚装入DNase/RNase Free EP管中(每张摊开面积500(最大)mm2，即边长1.6cm的正方形大小；
4)加入800μl二甲苯，振荡器上震荡10s，最大转数离心3分钟；
5)加入800μl二甲苯，振荡器上震荡10s，最大转数离心3分钟；
6)弃二甲苯，加入800μl无水乙醇，最大转数离心3分钟；
7)弃无水乙醇，挥干样品；
8)加入180μl ALT buffer及20μl proteinase K，56℃一小时以上，直至清亮；
9)90℃一小时；
10)离心6000g 1min，取上清；(此步骤是防止沉淀物阻塞柱子)
11)加入200μl AL,混匀，加入200μl乙醇，再混匀；
12)简单离心清洁管壁；
13)将全部混合液加入到DNA分离柱，关盖，离心6000g 1min，换新的收集管；
14)加入500μl AW1,6000g离心1min；换收集管；
15)加入500μl AW2，6000g离心1min，换收集管；
16)全速离心3min，干燥柱子；
17)换一只干净的1.5ml收集管，准备收集DNA；加入20-30μl ATE,在室温保持1min以溶解DNA。全速离心1min收集DNA。
3、实验结果
如果突变型样本信号Ct值在28以内，则表示样本出现了c-kit基因9号外显子检测突变类型(Y503_F504insAH、A501_Y502dup和A502_Y503dup)中至少一种突变。
本发明的3例突变型样本信号Ct值均在28以内，其中Y503_F504insAH突变型样本的测序结果如图2所示。图2中，曲线1是突变型样本信号；曲线2是外控信号，曲线3是阴性对照(野生型对照)信号，样本信号Ct值在28以内，表示该样本出现了c-kit基因9号外显子的Y503_F504insAH、突变。
实验结果说明，本发明方法和试剂盒的检测结果与已知检测结果比较：结果一致，说明本发明方法和试剂盒可以准确c-kit基因9号外显子突变，准确性强；另外，阴性对照样本Ct值大于30，为阴性，说明了本发明方法和试剂盒的特异性好。
实验例2本发明试剂盒以及方法的灵敏度分析
1、试验方法
取含有人类c-kit基因9号外显子突变的DNA，定量至浓度为8ng/ul，进行等比稀释，稀释后的浓度分别为8ng/ul、4ng/ul、2ng/ul、1ng/ul、0.5ng/ul
用实施例1的试剂盒，按照实施例1的定量PCR扩增进行检测。
2、实验结果
如图3所示，本发明试剂盒可以检测到浓度为1ng/ul的低浓度样本，灵敏度高。
综上，本发明提供的试剂盒可以准确检测人类C-Kit基因9号外显子突变，特异性和灵敏度高，检测快速、简便，成本低廉，可以大量推广使用，临床应用前景良好。
Claims (3)
1. 一种检测人类c-kit基因突变类型的试剂盒，其特征在于：它包括SEQ ID NO.1~3所示的引物对和SEQ ID NO.4所示的探针。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：它还包括质控引物与质控探针：SEQ IDNO.5~7所示引物对与SEQ ID NO.8所示的探针。
3. SEQ ID NO.1~3所示引物对。
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| Mast cell leukemia: identification of a new c-Kit mutation,dup(501-502), and response to masitinib, a c-Kit tyrosine kinase inhibitor;Sophie Georgin-Lavialle等;《European Journal of Haematology》;20120428;第89卷(第1期);第4页图1b * |
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