CN105861715A - 一种荧光定量pcr热循环仪的pcr预混液及其制备方法与应用 - Google Patents

一种荧光定量pcr热循环仪的pcr预混液及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种荧光定量PCR热循环仪的PCR预混液及其制备方法与应用，属于生物技术领域。该PCR预混液是以DNA双链嵌入SYTO13为荧光标记物，以染料CXR为参比荧光。本发明专为荧光定量PCR热循环仪研制，该预混液在荧光定量PCR仪器中应用效果稳定。本发明以SYTO13为荧光标记物，该染料对PCR反应无抑制，荧光强度更高，与双链结合更具特异性；添加适宜浓度的参比荧光染料CXR，可与荧光定量PCR仪匹配；选用热启动Taq DNA聚合酶，避免常温下引物与模板发生反应的同时降低PCR实验时间，提高PCR反应效率和特异性。

Description

一种荧光定量PCR热循环仪的PCR预混液及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种荧光定量PCR热循环仪的PCR预混液及其制备方法与应用，属于生物技术领域。
背景技术
荧光定量PCR是在普通的PCR反应中添加荧光标记物，在PCR反应的每一个循环退火或延伸阶段收集荧光信号，通过荧光信号的变化来实时监测PCR反应情况并对初始模板进行定量的技术。该技术具有特异性强、灵敏度高、可实时监测反应进程、可对初始模板进行定量分析、无需后续操作、环境污染风险低、分析时间短等诸多优点，在生命科学、医学和食品科学上有着广泛的应用。从标记方式来分类，荧光定量PCR主要分为染色标记法和探针标记法两种。探针法荧光定量PCR可以同时标记并定量多种特异性产物，但探针合成价格十分昂贵，在大量分析样本的实验中应用受到限制，而染色法荧光定量PCR价格相对便宜，可以通过溶解曲线对扩增产物进行鉴别，可根据解链温度差异同时鉴别3种不同的特异性产物。
目前市面上主流染色法荧光定量PCR试剂盒均以绿色荧光DNA双链嵌入染料SYBRGreenⅠ为荧光标记物，荧光染料通过静电，范德华力，疏水性和空间相互作用与DNA结合，这些相互作用都受到染料的化学结构影响。经过国内外大量实验研究证实，SYBR GreenⅠ具有诸多缺点，如染料浓度较高时对PCR反应产生抑制、浓度低时荧光强度太低影响PCR结果分析、对初始模板GC含量要求较高、反应过程中易出现假阳性扩增和生成引物二聚体等。而其他染料为标记物如EvaGreen和BYRT的荧光定量PCR试剂盒，大部分由国外试剂厂家生产，价格昂贵。
关于DNA聚合酶和缓冲液，为了控制成本，大多数荧光定量PCR预混液中的普通DNA聚合酶在室温下也具有活性，因此预混液要严格进行冷冻储存，在预混液的使用过程中，必须要求进行冰上操作以防止DNA聚合酶催化体系反应，影响分析效果，同时采取较为复杂的预热步骤，增加荧光定量PCR反应的时间的同时，也带来了DNA酶、模板、引物降解的风险和引物二聚体生成的风险。
实时荧光PCR热循环仪在我国各科研单位普及率较高，在各种研究中应用广泛，国内没有关于SYTO13在荧光定量PCR中应用的研究。SYTO13在荧光定量PCR中的应用优势明显，但目前尚没有以SYTO13为荧光标记物的适用于荧光定量PCR热循环仪的预混液的相关发明。因此，建立一种荧光强度较高、与双链DNA结合特异性更强、价格相对合理、可以广泛应用于荧光定量PCR热循环仪的预混液，具有重要的创新实验意义和经济学价值。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种荧光定量PCR热循环仪的PCR预混液及其制备方法与应用，采用的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种荧光定量PCR热循环仪的PCR预混液，该预混液是以DNA双链嵌入SYTO13为荧光标记物，以染料CXR为参比荧光。
优选地，每1mL所述PCR预混液中含有5μmol～20μmol染料SYTO13和30pmol～120pmol参比荧光CXR。
优选地，每1mL所述PCR预混液包含：染料SYTO13 5μmol～20μmol，参比荧光CXR 30pmol～120pmol、DNA聚合酶40U～100U、(NH4)2SO4 0～4μmol、丙三醇0-80μL和DMSO0-100μL。
优选地，每1mL所述PCR预混液包含：染料SYTO13 5μmol～20μmol，参比荧光CXR 30pmol～120pmol、热启动DNA聚合酶40U～100U、(NH4)2SO4 0～4μmol、丙三醇0-80μL、DMSO0-100μL、KCl 40μmol～80μmol、Tris 10μmol～30μmol、MgCl2 2μmol～4μmol、dNTPs 1.8μmol～3μmol。
更优选地，每1mL所述PCR预混液包含：染料SYTO13 10μmol～15μmol，参比荧光CXR45pmol～90pmol、热启动DNA聚合酶45U～65U、(NH4)2SO4 1μmol～3μmol、丙三醇55μL-75μL、DMSO 60μL-90μL、KCl 50μmol～70μmol、Tris 20μmol～30μmol、MgCl2 2.5μmol～3.5μmol、dNTPs 2.1μmol～2.7μmol。
最优选地，每1mL所述PCR预混液包含：染料SYTO13 12μmol，参比荧光CXR 60pmol、热启动DNA聚合酶50U、(NH4)2SO4 2μmol、丙三醇60μL、DMSO 70μL、KCl 60μmol、Tris25μmol、MgCl2 3μmol、dNTPs 2.4μmol，其余组成为双蒸水。
本发明还提供了一种上述任一PCR预混液的制备方法，其特征在于，步骤如下：
1)分别制备KCl溶液、Tris溶液、(NH4)2SO4溶液、MgCl2溶解，震荡混匀，4℃贮存备用；
2)然后分别将无菌双蒸水，与步骤1)制备的KCl溶液，Tris溶液，(NH4)2SO4溶液，和MgCl2溶液预混于灭菌贮存管中，调节溶液pH至8.5，混匀后灭菌，获得预处理混合液；所述KCl含量为40μmol～80μmol；所述(NH4)2SO4含量为0-4μmol；所述Tris溶液含量为10μmol～30μmol；所述MgCl2含量为2μmol～4μmol；
3)向步骤2)所得预处理混合液中依次加入1.8μmol～3μmol dNTPs、40U～100U DNA聚合酶、5μmol～20μmol染料SYTO13、30pmol～120pmol参比荧光CXR、0-100μL DMSO和0-80μL丙三醇，混匀后离心，最后加入无菌双蒸水至1mL，混匀后离心，上清液即为PCR预混液；
4)将步骤3)获得的PCR预混液包装后获得成品，于-20℃避光保存。
优选地，步骤2)所述预混，是在环境温度4℃下完成；步骤2)所述灭菌，条件为126℃，15min。
优选地，所述混匀，为2500r/min下漩涡震荡30s；所述离心，条件为4000×g，30s。
以上所述任一方法在荧光定量PCR检测中的应用。
以上所述任一方法在配备适用于荧光定量PCR热循环仪的PCR预混液及荧光定量PCR检测中的应用。
本发明通过自主探索荧光定量PCR预混液的各组分及比例，直接以原料进行预混液的配制，获得与商业试剂盒类似或者更优的实验结果，并大大降低了荧光定量PCR实验的成本。
本发明以双链DNA小沟嵌入荧光染料SYTO13为荧光标记物，SYTO系列荧光染料依赖电荷与DNA结合，比其他花青染料疏水性更强，并主要结合DNA双链螺旋小沟，避免了假阳性结果的产生。经研究证实，绿色荧光染料SYTO13在荧光定量PCR中的应用效果要优于SYBR GreenⅠ。SYTO13在应用于荧光定量PCR的过程中，具有较高的荧光强度，更易识别，染料浓度对PCR反应无抑制、对GC含量高的模板结合能力不受影响。
本发明在预混液中添加了适宜浓度的参比荧光染料CXR(carboxy-X-rhodamine)，该荧光染料具有与ROX相似的特性，在实验中发现，CXR与SYTO13配伍的效果要优于ROX，故以CXR为参比荧光，用以校正孔板间加样差距。
本发明中采用热启动DNA聚合酶，该酶在室温的条件下，活性会被抗体阻断，从而降低非特异性反应发生的几率，热启动DNA聚合酶在95℃加热2min时可完全激活，大大降低预反应时间，减少底物降解和非特异性扩增的风险。
本发明特别在预混液中添加了(NH4)2SO4、丙三醇和DMSO(二甲基亚砜)。(NH4)2SO4的作用在于可以释放铵离子，使PCR体系中非特异性产物双链解开，提高特异性，降低非特异性产物产生的几率，同时使适宜退火温度范围增大，可以广泛适用于不同模板的扩增；DMSO的作用是可以促进引物和模板的解链，适当降低退火温度，降低引物二聚体和模板之间复杂二级结构生成的几率；丙三醇的作用是保护Taq酶，增加酶的稳定性，以提高产量，同时由于丙三醇具有一定粘稠性，在配制PCR预混液时加入丙三醇，可以适当降低预混液的流动性，使预混液各组分不至飞溅和挂壁，有利于各组分总量的稳定和充分混匀。
本发明有益效果：
1、本发明专为荧光定量PCR热循环仪研制，经证实，该预混液在荧光定量PCR仪器中应用效果稳定。本发明以具有细胞膜穿透特性的DNA双链小沟嵌入染料SYTO13为荧光标记物，该染料对PCR反应无抑制，荧光强度更高，与双链结合更具特异性；添加适宜浓度的参比荧光染料CXR，可与荧光定量PCR仪匹配；选用热启动Taq DNA聚合酶，避免常温下引物与模板发生反应的同时，降低PCR实验时间，提高PCR反应效率和特异性；在预混液中添加适当比例的(NH4)2SO4、丙三醇和DMSO，有利于保护DNA聚合酶、降低退火温度、提高PCR特异性和产物量。
2、本发明预混液操作简便，节约时间，成本低廉，特异性强，灵敏度高。经验证通过该预混液进行荧光定量PCR扩增，高于市售荧光定量PCR预混液，灵敏度高于市售荧光定量PCR预混液，并能产生更低Ct值和更强的荧光信号。
3、本发明相比于现有市售荧光定量PCR预混液技术，选择了对PCR反应无抑制的、可穿透细胞膜的SYTO13 DNA嵌入荧光染料，以及化学性质、光学性质稳定的CXR参比荧光，并特别添加了热启动DNA聚合酶，解决了现有预混液价格昂贵、容易产生PCR抑制、预变性时间长、易产生非特异性扩增、荧光信号不强等缺点，本发明取得了扩增效率接近100％的优良效果。
附图说明
图1预混液ⅠⅡ和Ⅲ中染料荧光强度；
(A，预混液Ⅰ中染料荧光强度；B，预混液Ⅱ中染料荧光强度；C，预混液Ⅲ中染料荧光强度)。
图2预混液Ⅴ灵敏度的判定。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
本发明所用试剂、材料、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规试剂、材料、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
所述预混液的制备方法如下:
1)分别制备KCl溶液、Tris溶液、(NH4)2SO4溶液、MgCl2溶解，震荡混匀，4℃贮存备用；
2)然后分别将无菌双蒸水，与步骤1)制备的KCl溶液，Tris溶液，(NH4)2SO4溶液，和MgCl2溶液预混于灭菌贮存管中，调节溶液pH至8.5，混匀后灭菌，获得预处理混合液；所述KCl含量为40μmol～80μmol；所述(NH4)2SO4含量为0-4μmol；所述Tris溶液含量为10μmol～30μmol；所述MgCl2含量为2μmol～4μmol；
3)向步骤2)所得预处理混合液中依次加入1.8μmol～3μmol dNTPs、40U～100U DNA聚合酶、5μmol～20μmol染料SYTO13、30pmol～120pmol参比荧光CXR、0-100μL DMSO和0-80μL丙三醇，混匀后离心，最后加入无菌双蒸水至1mL，混匀后离心，上清液即为PCR预混液；
4)将步骤3)获得的PCR预混液包装后获得成品，于-20℃避光保存。
实施例1：
DNA嵌入荧光染料SYTO13(5mM)添加1μL，参比荧光染料CXR(30μmol)1μL，KCl溶液(1mol/L)80μL，丙三醇80μL，DMSO 60μL，Tris溶液(1mol/L)10μL，MgCl2溶液(0.1mol/L)20μL，dNTPs溶液45μL，热启动DNA聚合酶(2.5U/μL)添加16μL
配制工序：
设备、耗材的灭菌——无机化合物KCl、Tris、MgCl2溶液的配制——无机化合物溶液灭菌(温度126℃，时间15min)——冷却贮存(4℃)——配料1(依次加入200μL双蒸水、KCl溶液、Tris溶液、MgCl2溶液)——高浓度HCl调节溶液pH至8.5——2500r/min漩涡震荡30s，4000×g离心时间30s——无机化合物溶液灭菌(温度126℃，杀菌15min)——冷却贮存(4℃)——配料2(依次加入dNTPs、DNA聚合酶、染料SYTO13、丙三醇、DMSO)——2500r/min漩涡震荡30s，4000×g离心时间30s——2500r/min漩涡震荡30s，混匀组分后静置——避光包装——-20℃冷冻储存。
实施例2
DNA嵌入荧光染料SYTO13(5mM)添加2.4μL，参比荧光染料CXR(30μmol)2μL，KCl溶液(1mol/L)80μL，丙三醇80μL，DMSO 100μL，Tris溶液(1mol/L)25μL，MgCl2(0.1mol/L)溶液30μL，dNTPs溶液60μL，热启动DNA聚合酶(2.5U/μL)添加20μL
配制工序：
设备、耗材的灭菌——无机化合物KCl、Tris、MgCl2溶液的配制——无机化合物溶液灭菌(温度126℃，时间15min)——冷却贮存(4℃)——配料1(依次加入200μL双蒸水、KCl溶液、Tris溶液、MgCl2溶液)——高浓度HCl调节溶液pH至8.5——2500r/min漩涡震荡30s，4000×g离心时间30s——无机化合物溶液灭菌(温度126℃，杀菌15min)——冷却贮存(4℃)——配料2(依次加入dNTPs、DNA聚合酶、染料SYTO13、参比荧光CXR、丙三醇、DMSO)——2500r/min漩涡震荡30s，4000×g离心时间30s——2500r/min漩涡震荡30s，混匀组分后静置——避光包装——-20℃冷冻储存。
实施例3：
DNA嵌入荧光染料SYTO13(5mM)添加4μL，参比荧光染料CXR(30μmol)4μL，KCl溶液(1mol/L)80μL，丙三醇80μL，DMSO 100μL，Tris(1mol/L)溶液30μL，MgCl2溶液(0.1mol/L)40μL，dNTPs溶液75μL，热启动DNA聚合酶(2.5U/μL)添加40μL
配制工序：
设备、耗材的灭菌——无机化合物KCl、Tris、MgCl2溶液的配制——无机化合物溶液灭菌(温度126℃，时间15min)——冷却贮存(4℃)——配料1(依次加入200μL双蒸水、KCl溶液、Tris溶液、MgCl2溶液)——高浓度HCl调节溶液pH至8.5——2500r/min漩涡震荡30s，4000×g离心时间30s——无机化合物溶液灭菌(温度126℃，杀菌15min)——冷却贮存(4℃)——配料2(依次加入dNTPs、DNA聚合酶、染料SYTO13、参比荧光CXR、丙三醇、DMSO)——2500r/min漩涡震荡30s，4000×g离心时间30s——2500r/min漩涡震荡30s，混匀组分后静置——避光包装——-20℃冷冻储存。
实施例4：
DNA嵌入荧光染料SYTO13(5mM)添加2.4μL，参比荧光染料CXR(30μmol)2μL，KCl(1mol/L)溶液70μL，丙三醇55μL，DMSO 70μL，(NH4)2SO4溶液(0.1mol/L)10μL，Tris溶液(1mol/L)20μL，MgCl2溶液(0.1mol/L)25μL，dNTPs溶液52.5μL，热启动DNA聚合酶(2.5U/μL)添加18μL
配制工序：
设备、耗材的灭菌——无机化合物KCl、Tris、(NH4)2SO4、MgCl2溶液的配制——无机化合物溶液灭菌(温度126℃，时间15min)——冷却贮存(4℃)——配料1(依次加入200μL双蒸水、KCl溶液、Tris溶液、(NH4)2SO4溶液、MgCl2溶液)——高浓度HCl调节溶液pH至8.5——2500r/min漩涡震荡30s，4000×g离心时间30s——无机化合物溶液灭菌(温度126℃，杀菌15min)——冷却贮存(4℃)——配料2(依次加入dNTPs、DNA聚合酶、染料SYTO13、参比荧光CXR、DMSO、丙三醇)——2500r/min漩涡震荡30s，4000×g离心30s——2500r/min漩涡震荡30s，混匀组分后静置——避光包装——-20℃冷冻储存。
实施例5：
DNA嵌入荧光染料SYTO13(5mM)添加2.4μL，参比荧光染料CXR(30μmol)2μL，KCl溶液(1mol/L)60μL，丙三醇60μL，DMSO 70μL，(NH4)2SO4溶液(0.1mol/L)20μL，Tris溶液(1mol/L)25μL，MgCl2溶液(0.1mol/L)30μL，dNTPs溶液60μL，热启动DNA聚合酶(2.5U/μL)添加20μL
配制工序：
设备、耗材的灭菌——无机化合物KCl、Tris、(NH4)2SO4、MgCl2溶液的配制——无机化合物溶液灭菌(温度126℃，时间15min)——冷却贮存(4℃)——配料1(依次加入200μL双蒸水、KCl溶液、Tris溶液、(NH4)2SO4溶液、MgCl2溶液)——高浓度HCl调节溶液pH至8.5——2500r/min漩涡震荡30s，4000×g离心时间30s——无机化合物溶液灭菌(温度126℃，杀菌15min)——冷却贮存(4℃)——配料2(依次加入dNTPs、DNA聚合酶、染料SYTO13、参比荧光CXR、DMSO、丙三醇)——2500r/min漩涡震荡30s，4000×g离心时间30s——2500r/min漩涡震荡30s，混匀组分后静置——避光包装——-20℃冷冻储存。
实施例6：
DNA嵌入荧光染料SYTO13(5mM)添加2.4μL，参比荧光染料CXR(30μmol)2μL，KCl溶液(1mol/L)40μL，丙三醇75μL，DMSO 70μL，(NH4)2SO4溶液(0.1mol/L)40μL，Tris溶液(1mol/L)25μL，MgCl2溶液(0.1mol/L)35μL，dNTPs溶液67.5μL，热启动DNA聚合酶(2.5U/μL)添加26μL
配制工序：
设备、耗材的灭菌——无机化合物KCl、Tris、(NH4)2SO4、MgCl2溶液的配制——无机化合物溶液灭菌(温度126℃，时间15min)——冷却贮存(4℃)——配料1(依次加入200μL双蒸水、KCl溶液、Tris溶液、(NH4)2SO4溶液、MgCl2溶液)——高浓度HCl调节溶液pH至8.5——2500r/min漩涡震荡30s，4000×g离心时间30s——无机化合物溶液灭菌(温度126℃，杀菌15min)——冷却贮存(4℃)——配料2(依次加入dNTPs、DNA聚合酶、染料SYTO13、参比荧光CXR、DMSO、丙三醇)——2500r/min漩涡震荡30s，4000×g离心时间30s——2500r/min漩涡震荡30s，混匀组分后静置——避光包装——-20℃冷冻储存。
实施例7：
DNA嵌入荧光染料SYTO13(5mM)添加2μL，参比荧光染料CXR(30μmol)1.5μL，KCl溶液(1mol/L)60μL，丙三醇0μL，DMSO 90μL，(NH4)2SO4溶液(0.1mol/L)20μL，Tris溶液(1mol/L)25μL，MgCl2溶液(0.1mol/L)30μL，dNTPs溶液60μL，热启动DNA聚合酶(2.5U/μL)添加20μL
配制工序：
设备、耗材的灭菌——无机化合物KCl、Tris、(NH4)2SO4、MgCl2溶液的配制——无机化合物溶液灭菌(温度126℃，时间15min)——冷却贮存(4℃)——配料1(依次加入200μL双蒸水、KCl溶液、Tris溶液、(NH4)2SO4溶液、MgCl2溶液)——高浓度HCl调节溶液pH至8.5——2500r/min漩涡震荡30s，4000×g离心时间30s——无机化合物溶液灭菌(温度126℃，杀菌15min)——冷却贮存(4℃)——配料2(依次加入dNTPs、DNA聚合酶、染料SYTO13、参比荧光CXR、DMSO)——2500r/min漩涡震荡30s，4000×g离心时间30s——2500r/min漩涡震荡30s，混匀组分后静置——避光包装——-20℃冷冻储存。
实施例8：
DNA嵌入荧光染料SYTO13(5mM)添加2.4μL，参比荧光染料CXR(30μmol)2μL，KCl溶液(1mol/L)60μL，丙三醇60μL，DMSO 0μL，(NH4)2SO4溶液(0.1mol/L)20μL，Tris溶液(1mol/L)20μL，MgCl2溶液(0.1mol/L)30μL，dNTPs溶液60μL，热启动DNA聚合酶(2.5U/μL)添加20μL
配制工序：
设备、耗材的灭菌——无机化合物KCl、Tris、(NH4)2SO4、MgCl2溶液溶液的配制——无机化合物溶液灭菌(温度126℃，时间15min)——冷却贮存(4℃)——配料1(依次加入200μL双蒸水、KCl溶液、Tris溶液、(NH4)2SO4溶液、MgCl2溶液)——高浓度HCl调节溶液pH至8.5——2500r/min漩涡震荡30s，4000×g离心时间30s——无机化合物溶液灭菌(温度126℃，杀菌15min)——冷却贮存(4℃)——配料2(依次加入dNTPs、DNA聚合酶、染料SYTO13、参比荧光CXR、丙三醇)——2500r/min漩涡震荡30s，4000×g离心时间30s——2500r/min漩涡震荡30s，混匀组分后静置——避光包装——-20℃冷冻储存。
实施例9：
DNA嵌入荧光染料SYTO13(5mM)添加3μL，参比荧光染料CXR(30μmol)3μL，KCl溶液(1mol/L)50μL，丙三醇0μL，DMSO 0μL，(NH4)2SO4溶液(0.1mol/L)30μL，Tris溶液(1mol/L)25μL，MgCl2溶液(0.1mol/L)30μL，dNTPs溶液60μL，热启动DNA聚合酶(2.5U/μL)添加20μL
配制工序：
设备、耗材的灭菌——无机化合物KCl、Tris、(NH4)2SO4、MgCl2溶液溶液的配制——无机化合物溶液灭菌(温度126℃，时间15min)——冷却贮存(4℃)——配料1(依次加入200μL双蒸水、KCl溶液、Tris溶液、(NH4)2SO4溶液、MgCl2溶液)——高浓度HCl调节溶液pH至8.5——2500r/min漩涡震荡30s，4000×g离心时间30s——无机化合物溶液灭菌(温度126℃，杀菌15min)——冷却贮存(4℃)——配料2(依次加入dNTPs、DNA聚合酶、染料SYTO13、参比荧光CXR)——2500r/min漩涡震荡30s，4000×g离心时间30s——2500r/min漩涡震荡30s，混匀组分后静置——避光包装——-20℃冷冻储存。
实施例10：预混液(2×)的应用效果评价。
1.实验材料：
1)SYTO13荧光定量PCR预混液配方
以每1000μL计，预混液I(SYTO13 5μmol，CXR 30pmol，KCl 80μmol，丙三醇80μL、DMSO60μL，不含(NH4)2SO4，Tris 10μmol，MgCl2 2μmol，dNTPs 1.8μmol，热启动DNA聚合酶40U)；预混液Ⅱ(SYTO13 12μmol，CXR 60pmol，KCl 80μmol，丙三醇80μL、DMSO100μL，不含(NH4)2SO4，Tris 25μmol，MgCl2 3μmol，dNTPs 2.4μmol，热启动DNA聚合酶50U)；预混液Ⅲ(SYTO13 20μmol，CXR 120pmol，KCl 80μmol，丙三醇80μL、DMSO 100μL，不含(NH4)2SO4，Tris 30μmol，MgCl2 4μmol，dNTPs 3μmol，热启动DNA聚合酶100U)；预混液Ⅳ(SYTO13 12μmol，CXR 60pmol，KCl 70μmol，丙三醇55μL、DMSO 70μL，(NH4)2SO41μmol，Tris 20μmol，MgCl2 2.5μmol，dNTPs 2.1μmol，热启动DNA聚合酶45U)；预混液Ⅴ(SYTO13 12μmol，CXR 60pmol，KCl 60μmol，丙三醇60μL，DMSO70μL，(NH4)2SO4 2μmol，Tris 25μmol，MgCl2 3μmol，dNTPs 2.4μmol，热启动DNA聚合酶50U)；预混液Ⅵ(SYTO1312μmol，CXR 60pmol，KCl 40μmol，丙三醇75μL，DMSO70μL，(NH4)2SO4 4μmol，Tris 25μmol，MgCl2 3.5μmol，dNTPs 2.7μmol，热启动DNA聚合酶65U)；预混液Ⅶ(SYTO13 10μmol，CXR 45pmol，KCl 60μmol，不含丙三醇，DMSO90μL，(NH4)2SO4 2μmol，Tris 25μmol，MgCl23μmol，dNTPs 2.4μmol，热启动DNA聚合酶50U)；预混液Ⅷ(SYTO13 12μmol，CXR 60pmol，KCl 60μmol，丙三醇60μL，不含DMSO，(NH4)2SO4 2μmol，Tris 25μmol，MgCl2 3μmol，dNTPs2.4μmol，热启动DNA聚合酶50U)；预混液Ⅸ(SYTO13 15μmol，CXR 90pmol，KCl 50μmol，不含丙三醇和DMSO，(NH4)2SO4 3μmol，Tris 25μmol，MgCl2 3μmol，dNTPs 2.4μmol，热启动DNA聚合酶50U)；
2)猪背最长肌，购自哈尔滨市香坊区大润发超市；
3)实验试剂：
血液、细胞和动物组织的基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；染料SYTO13购自美国Invitrogen公司；染料CXR购自美国Promega公司；热启动DNA聚合酶购自天根生化科技(北京)有限公司；dNTPs混合液购自美国Promega公司；
4)实验仪器：
荧光定量PCR仪ABI7500，美国ABI公司；紫外分光光度计，日本岛津公司；高速冷冻离心机，美国Sigma公司；GI54DWS型高压灭菌器，美国Zealway公司；QT-1漩涡混合器，上海琪特分析仪器有限公司。
2.实验方法：
1)样品DNA的提取与浓度、纯度的计算
分别称取25mg猪肉组织按照试剂盒说明书操作提取基因组DNA，总DNA溶解于100μL的TE缓冲液中。于260nm和280nm处的吸光度值，计算DNA浓度和纯度。
2)引物的选择及验证
引物序列、扩增产物见表1。委托Invitrogen生物技术(上海)有限公司合成。盛装引物的离心管于12,000rpm(～13,400×g)下离心30s，以TE缓冲液溶解至浓度为100μmol的引物储备液，-20℃下避光保存直至使用。
表1引物序列及扩增产物长度
3)SYTO13荧光定量PCR反应体系及反应条件
反应体系：包括SYTO13荧光定量PCR预混液(2×)10μL；上、下游引物各1.2μL(5μmol)；猪DNA模板2μL；无菌双蒸水5.6μL。
反应条件：95℃预变性4min；95℃变性15s，61℃退火延伸1min，40循环；溶解曲线分析。
4)商业试剂盒荧光定量PCR对照反应体系及反应条件
反应体系：商业荧光定量PCR预混液(2×)10μL；上、下游引物各1.2μL(5μmol)；猪DNA模板2μL；无菌双蒸水5.6μL。
反应条件：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火延伸1min，40循环；溶解曲线分析。
5)荧光染料SYTO13、(NH4)2SO4、丙三醇和DMSO添加量对荧光定量PCR Ct值的影响
猪DNA模板20ng，分别按所述实施例1～9配制预混液，编号Ⅰ～Ⅸ，通过ABI7500荧光定量PCR仪按照前述反应条件进行扩增，选择Ct值在15～20之间的预混液进入复筛步骤，每种预混液重复3次，以商业荧光定量PCR试剂盒作为对照。
按照荧光定量PCR仪器系统内设程序对扩增产物进行解链曲线分析，以商业荧光定量PCR试剂盒作为对照，从65℃到95℃，每一温度持续1min。通过解链曲线得出产物Tm值，并判断系统内是否有二聚体生成。
6)灵敏度实验
将DNA模板分别稀释至0.1ng/μL、10pg/μL、1pg/μL、0.1pg/μL和10fg/μL，进行荧光定量PCR反应，以商业荧光定量PCR试剂盒作为对照，根据MIQE指导要求，选择扩增结果阳性率超过95％的最低浓度，视为荧光定量PCR反应的检出限LOD，藉此判断灵敏度。通过浓度梯度PCR扩增图，选择具有特异性扩增的最后两个模板浓度，每种预混液每个浓度做20次平行实验，当阳性样本≥19个时，该浓度可作为检出限。
7)重复性实验
以检出限浓度的上一浓度梯度进行10次试验，判断初筛预混液配方的重复性，以商业荧光定量PCR试剂盒作为对照，计算Ct值相对标准偏差RSD，当RSD≤5％时，认为重复性良好。
8)预混液配方的复筛——扩增效率计算
以商业荧光定量PCR试剂盒作为对照，对模板浓度分别为10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、10pg/μL、1pg/μL、0.1pg/μL的DNA样本进行荧光定量PCR扩增，计算Ct值与Log(模板质量)的关系，应得到标准曲线，总结线性相关系数R2和斜率，按照公式⑴计算扩增效率。
E＝10-1/斜率–1 公式⑴
3.实验结果
1)荧光染料SYTO13、(NH4)2SO4、丙三醇和DMSO添加量对荧光定量PCR Ct值的影响
SYTO13浓度对Ct值的影响：由表2可知，预混液ⅠⅡ和Ⅲ中SYTO13添加量为12μmol时，Ct值最低，可知，每1mL预混液中，SYTO13最适添加浓度为12μmol，相对应CXR添加浓度为60pM。通过荧光定量PCR仪分析体系组分，当CXR添加浓度为60pM时，荧光染料和参比荧光之间的比例与商业试剂盒类似。图1中A、B、C分别是预混液ⅠⅡ和Ⅲ中染料荧光强度。
关于PCR效果增强剂DMSO和(NH4)2SO4对PCR产物特异性的影响，通过对20ng DNA模板扩增后产物的溶解曲线判断。结果表明，在未添加(NH4)2SO4的预混液ⅠⅡ和Ⅲ中，(NH4)2SO4添加量少(1μmol)的Ⅳ号预混液，均存在非特异性扩增，说明(NH4)2SO4可增强PCR反应的特异性；在有(NH4)2SO4存在的情况下，未添加DMSO的Ⅵ和Ⅸ号PCR产物溶解曲线均可见非特异性扩增产生，说明(NH4)2SO4和DMSO有增强PCR特异性的协同作用。
关于丙三醇对PCR反应的影响，在其他组分不变的情况下，通过预混液Ⅵ(添加丙三醇)和Ⅸ(不添加丙三醇)的Ct值可以看出，添加丙三醇的样本，可以产生相对较低的Ct值，说明丙三醇的存在有利于PCR反应的进行，既往的研究表明，丙三醇具有保护DNA聚合酶的作用，我们的实验结果证实了这一点。
由表2中也可以看出，预混液Ⅴ和Ⅵ扩增产物Tm值高达79.7℃，与商业试剂盒类似，在Tm值相对较高时，体系更适用于扩增产物鉴别和解链曲线分析。
表2 SYTO13荧光定量PCR预混液与商业试剂盒扩增效果比较
预混液种类 Ct值 Tm值 非特异性扩增
Ⅰ 16.82±0.18 78.2±0.2 有
Ⅱ 16.17±0.09 79.1±0.1 有
Ⅲ 16.32±0.16 79.1±0.1 有
Ⅳ 15.66±0.13 79.5±0.1 有
Ⅴ 15.23±0.04 79.7±0.0 无
Ⅵ 15.87±0.12 79.7±0.1 无
Ⅶ 16.34±0.08 79.5±0.2 无
Ⅷ 16.03±0.20 78.9±0.1 有
Ⅸ 16.62±0.19 78.8±0.2 有
商业试剂盒 15.45±0.07 80.1±0.1 无
2.灵敏度验证
由表3可知，预混液Ⅴ和预混液Ⅵ检出限低至10fg，与商业试剂盒的检出限相同。同时添加了(NH4)2SO4、DMSO和丙三醇的预混液检出限比其他预混液要低，PCR扩增更加灵敏，如预混液Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ。而未添加DMSO和丙三醇的预混液Ⅸ，检出限高至10pg，灵敏度太低不适用于进行荧光定量PCR反应。
表3各预混液特异性扩增猪DNA检出限判定(n＝20)
图2是以预混液Ⅴ梯度扩增猪DNA的曲线，图中可以清晰看出，当猪DNA起始质量20fg时，猪特异性模板还可以稳定扩增，并与阴性对照明显区分开来，灵敏度高，检出限低，适宜进行荧光定量PCR反应。
3.重复性验证
重复性验证结果见表4。结果显示，预混液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的6次独立重复实验Ct值的标准差均小于0.5，检测稳定性好，各预混液相对标准偏差均小于设定的5％标准，其中预混液Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ相对标准偏差小于1.5％，说明检测结果重复性好，可用于荧光定量PCR扩增。
表4重复性验证结果(n＝6)
组别 模板浓度 Ct值 SD RSD％
Ⅰ 20pg 28.48 0.73 2.56
Ⅱ 2pg 30.63 0.41 1.34
Ⅲ 2pg 29.52 0.45 1.52
Ⅳ 2pg 29.84 0.29 0.97
Ⅴ 0.2pg 30.99 0.27 0.87
Ⅵ 0.2pg 30.87 0.36 1.17
Ⅶ 20pg 31.39 0.93 2.96
Ⅷ 20pg 30.71 0.82 2.67
Ⅸ 0.2ng 32.55 1.12 3.44
商业预混液 0.2pg 31.14 0.52 1.67
4.扩增效率及线性相关性
表5总结了10种预混液的扩增效率及线性相关性。从表5中可以看出，预混液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的扩增效率均高于95％，其中预混液Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ扩增效率接近于100％，与商业预混液类似，提示该预混液对PCR反应无抑制，且线性相关系数R2高于99％，具有良好的线性相关性，可满足荧光定量PCR要求。
表5不同预混液荧光定量PCR反应的R2、斜率和扩增效率
鉴于以上实验结果，本发明适用于荧光定量PCR热循环仪的PCR预混液，能够产生更强的荧光信号，较早产生Ct值，使荧光定量PCR扩增模板范围更宽；产物具有较高解链温度Tm，有利于基因分型和物种鉴别等工作；经添加PCR增强剂DMSO、(NH4)2SO4和丙三醇后，体系内无非特异性扩增出现；具有与商业试剂盒相似的高灵敏度，对基因组DNA扩增模板浓度可低至20fg；其重复性和扩增效率优于商业试剂盒，并且具有良好的线性相关性，在ABI7500实时荧光PCR热循环仪上应用效果良好，与进口商业试剂盒具有相似的效果，却可以降低实验成本，具有经济价值和实用价值。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种荧光定量PCR热循环仪的PCR预混液，其特征在于，以DNA双链嵌入SYTO13为荧光标记物，以染料CXR为参比荧光。
2.根据权利要求1所述PCR预混液，其特征在于，每1mL所述PCR预混液中含有5μmol～20μmol染料SYTO13和30pmol～120pmol参比荧光CXR。
3.根据权利要求2所述PCR预混液，每1mL所述PCR预混液包含：染料SYTO13 5μmol～20μmol，参比荧光CXR 30pmol～120pmol、DNA聚合酶40U～100U、(NH4)2SO4 0～4μmol、丙三醇0-80μL和DMSO 0-100μL。
4.根据权利要求3所述PCR预混液，其特征在于，每1mL所述PCR预混液包含：染料SYTO135μmol～20μmol，参比荧光CXR 30pmol～120pmol、热启动DNA聚合酶40U～100U、(NH4)2SO4 0～4μmol、丙三醇0-80μL、DMSO 0-100μL、KCl 40μmol～80μmol、Tris 10μmol～30μmol、MgCl2 2μmol～4μmol、dNTPs 1.8μmol～3μmol。
5.根据权利要求4所述PCR预混液，其特征在于，每1mL所述PCR预混液包含：染料SYTO1310μmol～15μmol，参比荧光CXR 45pmol～90pmol、热启动DNA聚合酶45U～65U、(NH4)2SO41μmol～3μmol、丙三醇55μL-75μL、DMSO 60μL-90μL、KCl 50μmol～70μmol、Tris 20μmol～30μmol、MgCl2 2.5μmol～3.5μmol、dNTPs 2.1μmol～2.7μmol。
6.根据权利要求5所述PCR预混液，其特征在于，每1mL所述PCR预混液包含：染料SYTO1312μmol，参比荧光CXR 60pmol、热启动DNA聚合酶50U、(NH4)2SO4 2μmol、丙三醇60μL、DMSO 70μL、KCl 60μmol、Tris 25μmol、MgCl2 3μmol、dNTPs 2.4μmol，其余组成为双蒸水。
7.一种如权利要求1-6所述任一PCR预混液的制备方法，其特征在于，步骤如下：
1)分别制备KCl溶液、Tris溶液、(NH4)2SO4溶液、MgCl2溶解，震荡混匀，4℃贮存备用；
2)然后分别将无菌双蒸水，与步骤1)制备的KCl溶液，Tris溶液，(NH4)2SO4溶液，和MgCl2溶液预混于灭菌贮存管中，调节溶液pH至8.5，混匀后灭菌，获得预处理混合液；所述KCl含量为40μmol～80μmol；所述(NH4)2SO4含量为0-4μmol；所述Tris溶液含量为10μmol～30μmol；所述MgCl2含量为2μmol～4μmol；
3)向步骤2)所得预处理混合液中依次加入1.8μmol～3μmol dNTPs、40U～100U DNA聚合酶、5μmol～20μmol染料SYTO13、30pmol～120pmol参比荧光CXR、0-100μL DMSO和0-80μL丙三醇，混匀后离心，最后加入无菌双蒸水至1mL，混匀后离心，上清液即为PCR预混液；
4)将步骤3)获得的PCR预混液包装后获得成品，于-20℃避光保存。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)所述预混，是在环境温度4℃下完成；
步骤2)所述灭菌，条件为126℃，15min。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述混匀，为2500r/min下漩涡震荡30s；所述离心，条件为4000×g，30s。
10.权利要求7-9所述任一方法在配备适用于荧光定量PCR热循环仪的PCR预混液及荧光定量PCR检测中的应用。
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