CN105859871A - 一种尿促性腺激素的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制药领域，具体涉及一种尿促性腺激素的生产方法。检测尿促性腺激素固体粉末中尿促卵泡激素和尿黄体生成激素的生物效价，配成溶液1，根据成品需要的尿促卵泡激素和尿黄体生成激素生物效价比例，计算溶液1中超出比例的尿促卵泡激素或尿黄体生成激素所对应的溶液2的体积，将溶液2过单克隆抗体亲和层析柱收集流穿液与剩余溶液混合，加入乙醇溶液静置，过滤得沉淀物，干燥得尿促性腺激素成品。本发明可获得来源单一，卵泡刺激素和黄体生成激素比例可精确控制的尿促性腺激素，而且操作过程安全可靠、精确度高、重现性好。
Description
技术领域
本发明涉及制药领域，具体涉及一种尿促性腺激素的生产方法。
背景技术
尿促性腺激素（HMG）含有卵泡刺激素(FSH)和黄体生成激素(LH)两种活性成分，是由垂体产生的糖蛋白激素，都是由α-链和β-链两个亚基组成。FSH的α-亚基与LH的α-亚基完全相同，FSH的β-亚基与LH的β-亚基组成与分子量均不相同，所以可通过β-亚基不同通过不同的单克隆抗体柱对两者进行分离。
排卵功能障碍的不育妇女使用尿促性腺激素制剂可促使卵泡的发育和成熟,使卵泡发育和受孕达到最佳效果。但由于不同病人的内源性尿黄体生成素水平有所不同,所以临床上需要尿促卵泡激素与尿黄体生成激素比例不同的制剂对症下药。专利号CN02136493.1公开了一种生产高纯度绝经后尿促性腺激素的方法，是将高纯度尿促卵泡激素与高纯度人尿黄体生成激素调配而成的产品，主要用于替代普通的尿促性腺激素产品，此种方法需要把尿促卵泡激素和人尿黄体生成激素分别纯化提取出来再按需要比例调配，增加了工艺过程，使工艺流程繁琐复杂，而且卵泡刺激素和黄体生成激素来源于不同的批次和原料，产品质量不容易控制。
目前单克隆抗体柱多使用溴化氰作为亲和层析载体活化剂，但是，溴化氰是剧毒试剂，并具有挥发性，在使用时，需要十分仔细，从试剂的称量到偶联后树脂的洗涤都不能出现差错，另外，溴化氰活化载体后形成的氰氧基容易水解，而影响偶联效率，活化后的树脂带有较强的电荷，导致非特异性吸附，降低特异性吸附的效率。
发明内容
为解决上述问题, 本发明提供了一种尿促性腺激素的生产方法，不仅可获得来源单一，卵泡刺激素和黄体生成激素比例可精确控制的尿促性腺激素，而且操作过程安全可靠、精确度高、重现性好。
本发明为解决上述问题提出的技术方案：
一种尿促性腺激素的生产方法，其特征在于采用以下步骤:
（1）称取纯化后的尿促性腺激素固体粉末，检测粉末中尿促卵泡激素和尿黄体生成激素的生物效价，加双蒸水溶解，配制成1-3wt%的溶液1，计算出溶液中尿促卵泡激素和尿黄体生成激素的生物效价；
优选地，所述纯化后尿促性腺激素固体粉末中尿促卵泡激素生物效价为6000-9000IU/mg，尿黄体生成激素的生物效价为1200-5000IU/mg；
（2）根据成品需要的尿促卵泡激素和尿黄体生成激素生物效价比例，计算溶液1中超出比例的尿促卵泡激素或尿黄体生成激素所对应的溶液2的体积；
所述成品中尿促卵泡素和尿黄体生成素的生物效价比例为1-4：1；
（3）将溶液2过单克隆抗体亲和层析柱收集流穿液：超出比例的为尿促卵泡素时，将溶液2过尿促卵泡素单克隆抗体亲和层析柱，反之，将溶液2过尿黄体生成激素单克隆抗体亲和层析柱；
其中单克隆抗体亲和层析柱是将羰基二咪唑活化的树脂与京尼平苷进行交联后，与单克隆抗体偶联制成的；
（4）收集流穿液与剩余溶液混合，加入乙醇溶液调节酒精度为80-85%，搅拌均匀后静置沉淀2-4小时，过滤得沉淀物，脱水干燥得尿促性腺激素成品，其中剩余溶液为从溶液1中取出溶液2后剩余的溶液。
所述的步骤（3）中过单克隆抗体亲和层析柱收集流穿液的方法为：
（1）配制二氧六环梯度溶液：以水为溶剂，配制不同体积浓度的二氧六环溶液，15-20%的溶液A，30-35%的溶液B，45-50%的溶液C，75-85%的溶液D；
（2）Sepharose 4B树脂用双蒸水洗涤，在布氏漏斗中将树脂由水相依次通过溶液A、溶液B、溶液C、溶液D置换到无水二氧六环中，将树脂悬浮于无水二氧六环中，加入羰基二咪唑，15-20℃反应10-15min，反应后用无水二氧六环抽滤，置换过程中不可将树脂抽干，羰基二咪唑和Sepharose 4B树脂的质量配比为1:20-1:25；
优选地，所述双蒸水流速为20-30mL/min，每克Sepharose 4B加入40-50mL双蒸水洗涤，A、B、C、D溶液的添加量均为每克Sepharose 4B树脂中加3-4mL；
（3）将活化后的Sepharose 4B树脂依次序用溶液D、溶液C、溶液B、溶液A置换到PH为7-7.5的磷酸缓冲溶液中，在缓冲溶液中加入京尼平苷，在温度为15-20℃进行交联反应4-6h，京尼平苷和Sepharose 4B树脂的质量配比为1:45-1:50，置换过程中不可将树脂抽干；
优选地，所述D、C、B、A四种溶液的添加量均为每克Sepharose 4B树脂中加5-6mL；
（4）按每克Sepharose 4B树脂加入10-20mg的单克隆抗体进行偶联，将偶联好的亲和吸附剂填充到固相萃取柱中，加入PH为8-9的磷酸缓冲溶液后自然沉降至亲和吸附剂沉降完全，得到单克隆抗体层析柱；
所述单克隆抗体为尿促卵泡激素ß-亚基单克隆抗体或尿黄体生成激素ß-亚基单克隆抗体；偶联条件为6-8℃，摇床45-50r/min，偶联6-8h；
（5）用PH为7-8，浓度为0.02-0.03moL/L的Tris溶液，置换单克隆抗体层析柱中的缓冲溶液，将溶液2上单克隆抗体层析柱，压柱，收集流穿液。
京尼平苷是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物，是一种优良的天然生物交联剂。一般采用从栀子中提取京尼平苷，再用β-葡萄糖苷酶水解，然后用乙醚萃取、真空浓缩、重结晶而制得，也可以采用微生物转化法制备。
有益效果
1.本发明通过单克隆抗体柱控制尿促性腺激素中卵泡刺激素和黄体生成激素的比例，解决了通过回掺或调配方法获取特定比例尿促性腺素方法存在的缺点，使成品尿促性腺激素的原料来源单一，配比精确、质量容易控制，可供需要卵泡刺激素和黄体生成激素不同比例的病人直接注射使用。
2.本发明中琼脂糖树脂通过溶解在二氧六环中的羰基二咪唑活化后，与京尼平苷进行交联，得到单克隆抗体的免疫吸附载体，克服了传统活化和交联方法中试剂毒性大、稳定性差、活化后柱子带有较强电荷容易进行非特异性吸附的缺点，提高了操作过程的安全稳定性，使吸附载体对抗体的吸附能力显著增强，制得具有高特异性吸附能力的单克隆抗体柱。
具体实施方式
下面列举实施例和比较例对本发明进行说明,但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1
（1）称取纯化后的尿促性腺激素固体粉末，检测粉末中尿促卵泡激素生物效价为6100IU/mg，尿黄体生成激素的生物效价为4900IU/mg加双蒸水溶解，配制成1wt%的溶液1000mL，计算出溶液中尿促卵泡激素的生物效价为61000IU/mL，尿黄体生成激素的生物效价为49000IU/mL。
（2）生产尿促卵泡激素和尿黄体生成激素生物效价比例为1：1的尿促性腺激素，超出比例的尿促卵泡激素所对应的溶液体积为197mL。
（3）配制二氧六环梯度溶液：以水为溶剂，配置不同体积浓度的二氧六环溶液，15%的溶液A，30%的溶液B，45%的溶液C，75%的溶液D；
Sepharose 4B树脂用双蒸水洗涤，在布氏漏斗中将树脂由水相依次通过溶液A、溶液B、溶液C、溶液D置换到无水二氧六环中，将树脂悬浮于无水二氧六环中，加入羰基二咪唑，15℃反应10min，反应后用无水二氧六环抽滤，置换过程中不可将树脂抽干，羰基二咪唑和Sepharose 4B树脂的质量配比为1：20；
将活化后的Sepharose 4B树脂依次序用溶液D、溶液C、溶液B、溶液A置换到PH为7的磷酸缓冲溶液中，在缓冲溶液中加入京尼平苷，在温度为15℃进行交联反应4h，京尼平苷和Sepharose 4B树脂的质量配比为1:45，置换过程中不可将树脂抽干；
按每克Sepharose 4B树脂加入10mg的尿促卵泡激素ß-亚基单克隆抗体进行偶联，将偶联好的亲和吸附剂填充到固相萃取柱中，加入PH为8的磷酸缓冲溶液后自然沉降至亲和吸附剂沉降完全，得尿促卵泡激素ß-亚基单克隆抗体柱；
用PH为7、浓度为0.02moL/L的 Tris溶液，置换单克隆抗体层析柱中的缓冲溶液，将步骤（2）中超出比例的尿促卵泡激素所对应的800mL溶液上尿促卵泡激素ß-亚基单克隆抗体柱，压柱，收集流穿液。
（4）收集流穿液与剩余的200mL溶液混合，加入乙醇溶液调节酒精度为80%，搅拌均匀后静置沉淀2小时，过滤得沉淀物，脱水干燥得尿促性腺激素成品。
检测成品中尿促卵泡激素的生物效价为5500IU/mg，尿黄体生成激素生物效价为5500IU/mg，两者的生物效价比例为1:1。
实施例2
（1）称取纯化后的尿促性腺激素固体粉末，检测粉末中尿促卵泡激素生物效价为8000IU/mg，尿黄体生成激素的生物效价为3000IU/mg，加双蒸水溶解，配制成3wt%的溶液1000mL，计算出溶液中尿促卵泡激素的生物效价为240000IU/mL，尿黄体生成激素的生物效价为90000IU/mL。
（2）生产尿促卵泡激素和尿黄体生成激素生物效价比例为4：1的尿促性腺激素，超出比例的尿黄体生成激素所对应的溶液体积为333mL。
（3）以水为溶剂，配制不同体积浓度的二氧六环溶液，20%的溶液A，35%的溶液B，50%的溶液C，85%的溶液D；
在布氏漏斗中将树脂由水相依次通过溶液A、溶液B、溶液C、溶液D置换到无水二氧六环中，将树脂悬浮于无水二氧六环中，加入羰基二咪唑，20℃反应15min，反应后用无水二氧六环抽滤，置换过程中不可将树脂抽干，羰基二咪唑和Sepharose 4B树脂的质量配比为1：25；
将活化后的Sepharose 4B树脂依次序用溶液D、溶液C、溶液B、溶液A置换到PH为7.5的磷酸缓冲溶液中，在缓冲溶液中加入京尼平苷，在温度为20℃进行交联反应6h，京尼平苷和Sepharose 4B树脂的质量配比为1:50，置换过程中不可将树脂抽干；
按每克Sepharose 4B树脂加入20mg的尿黄体生成激素ß-亚基单克隆抗体进行偶联，将偶联好的亲和吸附剂填充到固相萃取柱中，加入PH为9的磷酸缓冲溶液后自然沉降至亲和吸附剂沉降完全，得尿黄体生成激素ß-亚基单克隆抗体柱；
用PH为8、浓度为0.03moL/L的 Tris溶液，置换单克隆抗体层析柱中的缓冲溶液，将步骤（2）中超出比例的尿黄体生成激素所对应的250mL溶液上尿黄体生成激素ß-亚基单克隆抗体柱，压柱，收集流穿液。
（4）收集流穿液与剩余原料溶液混合，加入乙醇溶液调节酒精度为80%，搅拌均匀后静置沉淀4小时，过滤得沉淀物，脱水干燥得尿促性腺激素成品。
检测成品中尿促卵泡激素的生物效价为8800IU/mg，尿黄体生成激素生物效价为2200IU/mg，两者的生物效价比例为4:1。
Claims (9)
1.一种尿促性腺激素的生产方法，其特征在于采用以下步骤：
（1）称纯化后的尿促性腺激素固体粉末，检测粉末中尿促卵泡激素和尿黄体生成激素的生物效价，加双蒸水溶解，配制成1-3wt%的溶液1，计算出溶液中尿促卵泡激素和尿黄体生成激素的生物效价；
（2）根据成品需要的尿促卵泡激素和尿黄体生成激素生物效价比例，计算溶液1中超出比例的尿促卵泡激素或尿黄体生成激素所对应的溶液2的体积；
（3）将溶液2过单克隆抗体亲和层析柱收集流穿液：超出比例的为尿促卵泡素时，将溶液2过尿促卵泡素单克隆抗体亲和层析柱，反之，将溶液2过尿黄体生成激素单克隆抗体亲和层析柱；
其中单克隆抗体亲和层析柱是将羰基二咪唑活化的树脂与京尼平苷进行交联后，与单克隆抗体偶联制成的；
（4）收集流穿液与剩余溶液混合，加入乙醇溶液调节酒精度为80-85%，搅拌均匀后静置沉淀2-4小时，过滤得沉淀物，脱水干燥得尿促性腺激素成品，其中剩余溶液为从溶液1中取出溶液2后剩余的溶液。
2.根据权利要求1所述的一种尿促性腺激素的生产方法，其特征在于步骤（3）中过单克隆抗体亲和层析柱收集流穿液的方法为：
（1）配制二氧六环梯度溶液：以水为溶剂，配制不同体积浓度的二氧六环溶液，15-20%的溶液A，30-35%的溶液B，45-50%的溶液C，75-85%的溶液D；
（2）Sepharose 4B树脂用双蒸水洗涤，在布氏漏斗中将树脂由水相依次通过溶液A、溶液B、溶液C、溶液D置换到无水二氧六环中，将树脂悬浮于无水二氧六环中，加入羰基二咪唑，15-20℃反应10-15min，反应后用无水二氧六环抽滤，置换过程中不可将树脂抽干，羰基二咪唑和Sepharose 4B树脂的质量配比为1:20-1:25；
（3）将活化后的Sepharose 4B树脂依次序用溶液D、溶液C、溶液B、溶液A置换到PH为7-7.5的磷酸缓冲溶液中，在缓冲溶液中加入京尼平苷，在温度为15-20℃进行交联反应4-6h，京尼平苷和Sepharose 4B树脂的质量配比为1:45-1:50，置换过程中不可将树脂抽干；
（4）按每克Sepharose 4B树脂加入10-20mg的单克隆抗体进行偶联，将偶联好的亲和吸附剂填充到固相萃取柱中，加入PH为8-9的磷酸缓冲溶液后自然沉降至亲和吸附剂沉降完全，得到单克隆抗体层析柱；
（5）用PH为7-8，浓度为0.02-0.03moL/L的Tris溶液，置换单克隆抗体层析柱中的缓冲溶液，将溶液2上单克隆抗体层析柱，压柱，收集流穿液。
3.根据权利要求1所述的一种尿促性腺激素的生产方法，其特征在于步骤（1）所述的纯化后尿促性腺激素固体粉末中尿促卵泡激素生物效价为6000-9000IU/mg，尿黄体生成激素的生物效价为1200-5000IU/mg。
4.根据权利要求1所述的一种尿促性腺激素的生产方法，其特征在于步骤（2）所述的成品中尿促卵泡素和尿黄体生成素的生物效价比例为1-4：1。
5.根据权利要求2所述的一种尿促性腺激素的生产方法，其特征在于步骤（2）所述的双蒸水洗涤时双蒸水流速为20-30mL/min， 每克Sepharose 4B加入40-50mL双蒸水洗涤。
6.根据权利要求2所述的一种尿促性腺激素的生产方法，其特征在于步骤（2）所述的将Sepharose 4B树脂依次序用溶液A、溶液B、溶液C、溶液D洗涤，4种溶液的添加量均为每克Sepharose 4B树脂中加3-4mL。
7.根据权利要求2所述的一种尿促性腺激素的生产方法，其特征在于步骤（3）所述的将活化后的树脂依次序用溶液D、溶液C、溶液B、溶液A置换，4种溶液的添加量均为每克Sepharose 4B树脂中加5-6mL。
8.根据权利要求2所述的一种尿促性腺激素的生产方法，其特征在于步骤（4）所述的单克隆抗体为尿促卵泡激素ß-亚基单克隆抗体或尿黄体生成激素ß-亚基单克隆抗体。
9.根据权利要求2所述的一种尿促性腺激素的生产方法，其特征在于步骤（4）所述的偶联条件为6-8℃，摇床45-50r/min，偶联6-8h。
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