CN105853593A - 一种视神经保护作用的药物组合物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种视神经保护作用的药物组合物及应用，以重量份计，该药物组合物由包括如下组分的原料制备得到：枸杞10‑20份，川芎8‑12份，灯盏细辛8‑12份，黄芪10‑20份，女贞子10‑20份，牛膝8‑12份；中医理论认为，慢性高眼压导致视神经损伤的主要病机是肝肾亏损，神水淤积，气血失和，脉络不通，目中玄府闭塞，基于“滋补肝肾、益气活血”的治法，提出了本发明的药物组合物，该药物组合物对慢性高眼压引起的视神经损伤具有良好的疗效。

Description

一种视神经保护作用的药物组合物及应用
技术领域
本发明涉及中药技术领域，尤其涉及一种视神经保护作用的药物组合物及应用，具体地，涉及一种用于治疗/预防/缓解视神经损伤的药物组合物。
背景技术
目前，用于保护视神经损伤的方法包括药物治疗、基因疗法、干细胞移植以及视网膜移植等，它们通过不同的原理机制针对青光眼视神经损伤的不同环节发挥作用。药物仍然是临床上最基本和最常见的治疗手段，用于促进视神经损伤修复的药物主要包括以下几种：①钙通道阻滞剂：眼压升高，导致较多钙离子自细胞外流入细胞内，此时视网膜细胞Ca2+超负荷，导致视网膜损伤。钙通道阻滞剂通过抑制Ca2+通道和细胞内Ca2+释放来阻断兴奋性氨基酸介导的毒性，同时还能抑制自由基，增加血流，稳定细胞膜，因而减轻视网膜的损伤。②维生素类药物：维生素C和维生素E合用有协同作用，可有效地防止脂类过氧化。维生素C能清除细胞内外的氧自由基，是细胞间质生成所必需，能够促进细胞间质的合成B族维生素。当VitB缺乏时，糖代谢障碍，能量供应减少，故神经功能易受累。所以适量补充B族维生素和维生素E大剂量维生素C有助于保护损伤的视神经，有利于神经修复。③神经营养因子：视神经损伤后，给予外源性神经营养因子，能够保护神经，抑制神经元凋亡，促进神经轴突再生和神经细胞功能恢复。近年来，研究较多的神经营养因子有脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子、神经胶质细胞源性生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等。④其他：NMDA受体拮抗剂、自由基清除剂、前列腺素类药物、脱水剂、血管扩张剂等。然而在临床上，现有的视神经保护药物的治疗效果却并不十分理想，究其原因可能是视神经损伤是多种因素共同作用的结果，而这些药物治疗靶点单一，导致疗效不佳。
中药在视神经损伤治疗中起着重要作用，临床实践表明，中药能保护视神经，甚至可能挽救部分濒临死亡的神经细胞，扩大视野，从而提高患者的视功能。目前研究的单味中药主要有葛根素、灯盏花、三七总苷、银杏叶、刺蒺藜等。中药复方有当归补血煎、补阳还五汤、益阴明目合剂等。虽然中药对青光眼视功能保护作用的研究已取得很大进展，但同时也存在着对视神经损伤治疗干预的机制还不够明确，研究不够深入的不足。
发明内容
本发明的目的是针对中药在视神经损伤治疗中存在的不足，提供一种用于治疗/预防/缓解视神经损伤的药物组合物，该药物组合物对慢性高眼压引起的视神经损伤具有良好的效果。
为了实现上述目的，本发明的技术方案之一是：
一种视神经保护作用的药物组合物，以重量份计，由包括如下组分制备得到：枸杞10-20份，川芎8-12份，灯盏细辛8-12份，黄芪10-20份，女贞子10-20份，牛膝8-12份。
优选地，由包括如下组分制备得到：枸杞13-17份，川芎8-12份，灯盏细辛8-12份，黄芪13-17份，女贞子13-17份，牛膝8-12份。
进一步优选地，各组分的用量为：枸杞15份，川芎10份，灯盏细辛10份，黄芪15份，女贞子15份，牛膝10份。
其中，所述重量份为本领域公知的μg，mg，g，kg等重量单位，或为其倍数，如1/100，1/10，10倍，100倍。
中医理论认为，慢性高眼压导致视神经损伤的主要病机是肝肾亏损，神水淤积，气血失和，脉络不通，目中玄府闭塞，基于“滋补肝肾、益气活血”的治法，提出了本发明的药物组合物，该药物组合物中，所述枸杞指的是枸杞子(果实)，枸杞子性甘、平，具有养肝、滋肾、润肺的功效枸杞；川芎味辛，性温，具有活血行气、祛风止痛功效；灯盏细辛别名灯盏花，辛、微苦、温，具有散寒解表、活血舒筋、止痛、消积的功效；黄芪性甘，微温，具有增强机体免疫功能、保肝、利尿等功效；女贞子性甘、苦、凉，具有补益肝肾、名目、清虚热功效；牛膝性苦、甘、酸、平，具有逐瘀通经、补肝肾、强筋骨、利尿通淋、引血下行等功效，上述各组分复配使用时，本方共六味药，重用枸杞、女贞子、牛膝三味归肝肾经，滋补肝肾之品，其中以枸杞、女贞子补肝肾明目为君药。另加黄芪补气健脾，益卫固表。四药补益正气取其“正气存内，邪不可干”之意，扶助正气以驱邪外出。全方在补益基础上，用牛膝及灯盏细辛活血，黄芪利水，川芎行气，一使气行则血行，二使全方补而不滞。川芎、灯盏细辛、黄芪、牛膝四药为臣药。全方补通兼施，使目窍通畅，气血调和，则诸症俱解。
本发明所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或辅料，载体和/或辅料为本领域技术人员所知晓，本发明对此不做特殊限定。
本发明所述的药物组合物的剂型为片剂、散剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂中的一种，各剂型可采用本领域常规技术手段制备得到。
作为本发明的技术方案之二，本发明同时提供上述各药物组合物的制备方法，包括将各组分制备成浸膏的步骤：用相当于各组分重量之和7-9倍的水于煎煮提取2-3次，每次0.5-2h，合并提取液并浓缩成浸膏。
优选地，所述浸膏的制备方法为：先用相当于各组分重量之和8倍的水煎煮提取1.5h，再用相当于各组分重量之和6倍的水煎煮提取1h，过滤，合并两次滤液，浓缩成浸膏即得。
以浸膏为起始原料，采用本领域常规技术手段，可将其制备成各种剂型，如片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂等。
本发明的技术方案之三是：上述任一项所述的药物组合物或方法制备得到的药物组合物在制备治疗视神经损伤药物中的应用。
本发明所述的视神经损伤优选是由高眼压引起的损伤，进一步优选是由慢性高眼压引起的损伤。
本发明的药物组合物能够调控Wnt信号通路、视网膜小胶质细胞、热休克蛋白途径，从而实现对慢性高眼压引起的视神经损伤起到保护作用，具体地，使用本发明药物组合物能够调控Wnt信号通路、抑制视网膜小胶质细胞表明抗原OX42的表达及IL-1βmRNA的释放，促进热休克蛋白表达，从而改善视神经损伤状况。
本发明具有的优势和有益效果是：
1、慢性高眼压视神经损伤发病机制复杂，本发明的中药复方从视神经损伤的整体病机出发，辨证论治，弥补了西药及单味中药治疗靶点单一的不足；
2、对本发明的中药复方对慢性高眼压视神经保护的机制进行了较为深入的实验研究，证明了其有效作用。
本发明涉及到的原料或试剂均可市购获得。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实施例。
附图说明
图1为空白组(A组)光镜下大鼠视网膜结构图；
图2中，A，B，C，D，E分别为为成膜后第2周模型组(B组)、青光安II号(C组)、青光安II号(D组)、青光安II号(E组)、益脉康分散片组(F组)光镜下大鼠视网膜结构图；
图3中，A，B，C，D，E分别为成膜后第4周模型组、青光安Ⅱ号方低剂量组、青光安Ⅱ号方中剂量组、青光安Ⅱ号方高剂量组、益脉康分散片组光镜下大鼠视网膜结构图；
图4为正常视网膜OX42蛋白表达图；
图5中，A，B，C，D，E分别为成膜后第2周，B组、C组、D组、E组、F组视网膜上OX42蛋白表达图；
图6中，A，B，C，D，E分别为成膜后第4周，B组、C组、D组、E组、F组视网膜上OX42蛋白表达图；
图7、8分别为青光安Ⅱ号方对慢性高眼压大鼠视网膜上GSK-3βmRNA相对表达量的影响的扩增曲线和溶解曲线；
图9、10分别为青光安Ⅱ号方对慢性高眼压大鼠视网膜β-catenin mRNA相对表达量的影响的扩增曲线和溶解曲线；
图11、12分别为青光安Ⅱ号方对慢性高眼压大鼠视网膜PAX6 mRNA相对表达量的影响的扩增曲线和溶解曲线；
图13、14分别为青光安Ⅱ号方对慢性高眼压大鼠视网膜上Ngn1 mRNA相对表达量的影响的扩增曲线和溶解曲线；
图15、16分别为青光安Ⅱ号方对慢性高眼压大鼠视网膜Ngn2 mRNA相对表达量的影响的扩增曲线和溶解曲线；
图17、18分别为青光安Ⅱ号方对慢性高眼压大鼠视网膜IL-1βmRNA相对表达量的影响的扩增曲线和溶解曲线。
图19、20分别为β-actin mRNA的扩增曲线和溶解曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
一种视神经保护作用的药物组合物，由如下组分制备得到：枸杞15g，川芎10g，灯盏细辛10g，黄芪15g，女贞子15g，牛膝10g。
实施例2
一种视神经保护作用的药物组合物，由如下组分制备得到：枸杞12g，川芎8g，灯盏细辛9g，黄芪11g，女贞子12g，牛膝8g。
实施例3
一种视神经保护作用的药物组合物，由如下组分制备得到：枸杞20g，川芎12g，灯盏细辛12g，黄芪19g，女贞子18g，牛膝12g。
实施例4
该实施例提供实施例1所述药物组合物的制备方法，具体为：加水提取2次，一煎加8倍量水提取1.5h；二煎加6倍量水提取1h；合并提取液，过滤，浓缩，制成浸膏即得。
一、动物实验
1.1.1实验动物
健康雄性SD大鼠60只，体重180-200g，SPF级，远交系，由湖南中医药大学动物实验中心提供。实验前检查双眼眼部情况无异常，排除全身病变。动物置于18-20℃，相对湿度60-70％，通风干燥的SPF动物实验室，予以经严格消毒的实验鼠生长颗粒料及Ⅲ级清洁饮用水饲养，每隔2日清洗消毒笼具、饮水器具。
1.1.2实验药品
复方中药青光安Ⅱ号(本发明药物组合物)：按照枸杞15g、川芎10g、灯盏细辛10g、黄芪15g、女贞子15g、牛膝10g的比例采购生药，由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供，按照实施例4的方法制备成浸膏。
益脉康分散片：湖南湘雅制药有限公司，国药准字：Z20080073。
妥布霉素地塞米松滴眼液：齐鲁制药有限公司，国药准字：H20020497。
妥布霉素地塞米松眼膏：s.a.ALCON-COUREUR n.v.进口药品注册证号：H20130743
1.1.3主要实验试剂
4％多聚甲醛：湖南中医药大学病理实验室提供。Harris苏木素：北京中杉金桥生物技术公司提供。伊红：北京中杉金桥生物技术公司提供。3％过氧乙酸：北京中杉金桥生物技术公司提供。OX42抗体：shaybio公司提供。常规化学试剂：北京化学试剂公司。逆转录试剂盒：北京康为世纪提供。EDTA：Sigma公司提供。Tris：Sigma公司提供。Trizol：Invitrogen公司提供。Taq酶：Genstar公司提供。引物：南京金斯瑞公司提供。DEPC：Sigma公司提供。DL2000 DNA Marker：Genstar公司提供。dNTP：Genstar公司提供。E.B.:Sigma公司提供。SYBGREEN PCR Mix:Invitrogen公司提供。
1.1.4主要实验器材
Tono-Pen：美国Reichert公司，型号：AVIA。
轮转石蜡切片机：徕卡，型号：RM2235。
数码医学图像分析系统：深圳市深沅恒科技有限公司，型号：Motic 6.0。
摇床：其林贝尔公司，型号：TS-92。
台式冷冻离心机：eppendorf公司，型号：TGL-18R。
荧光定量RCP仪：Thermo公司，型号：PIKO REAL 96。
荧光PCR板：Thermo公司，型号：SPL0960。
恒温水浴箱：河南金博公司，型号：HH-S2。
旋涡混合器：其林贝尔公司，型号：QL-901。
电泳仪：Bio-rad公司，型号：164-5050。
水平琼脂糖电泳槽：北京六一公司，型号：DYCP-31DN。
普通冰箱：荣事达公司，型号：BCD-245F。
-80℃冰箱：中科美菱公司，型号：DW-HL388。
电磁炉：美的公司，型号：MC-EP186。
精密PH计：雷磁公司，型号：E-201-C。
电子天平：民桥公司，型号：FA-N。
电动玻璃匀浆器：新芝公司，型号：DY89-1。
实验方法
1.2.1分组
动物购回常规饲养1周后，按随机数字法将40只大鼠分为6组，分别为：A组：空白组；B组：模型组；C组：青光安Ⅱ号低剂量组；D组：青光安Ⅱ号中剂量组；E组：青光安Ⅱ号高剂量组；F组：益脉康分散片组。
1.2.2造模
造模前1天，除空白组外，其余所有兔术前8h禁水禁食。选用对眼压无明显影响的1％苯巴比妥钠3.5mL/kg腹腔注射麻醉。麻醉满意后，用眼压计测得双眼基础眼压并记录。参照文献方法，在显微镜下将双眼2条鼻侧表浅巩膜静脉(位于上直肌附近)和1条颞侧表浅巩膜静脉(在外直肌附近)与周围组织分离，用眼科一次性标准烧灼器小心烧灼选择的表浅巩膜静脉直至血流中断，避免损伤邻近组织，术毕涂典必舒眼膏，第2天开始每天滴典殊眼药水1滴，每日3次，共1周时间。术后眼压均持续在25mmHg以上视为造模成功，若术后眼压未见上升，或上升后回降，则进行二次造模，方法为：再一次烧灼2根巩膜表面静脉。若二次造模再次失败，则将造模失败鼠眼剔除本次实验研究范围。
1.2.3术后眼压监测
于术后第1、2、3、5天及第1、2、3、4、5、6、7、8周测量每只大鼠双眼眼压。每次检查尽量在同一时间、地点、湿度、温度、照明亮度及使用仪器相同的情况下完成。
1.2.4给药方法
维持高眼压状态8w后开始灌胃。
A、B组以生理盐水12mL/kg灌胃。
C、D、E组(青光安Ⅱ号方组)：制作出的青光安Ⅱ号方浸膏，每毫升约合生药2.25g。C组灌胃量为6.75g/Kg d(按“人-动物体表面积等效剂量比值表”折算，相当于成人等效剂量)。D组为13.5g/Kg d(按“人-动物体表面积等效剂量比值表”折算，相当于成人2倍效剂量)。E组为27g/Kg d(相当于成人4倍效剂量)。
益脉康分散片组：用生理盐水配制成浓度为20g/L的益脉康分散片混悬液，F组每只灌胃0.22g/Kg d。
所有动物给药剂量按“人-动物体表面积等效剂量比值表”折算，折算系数W＝0.018，折算公式：W*成人用量(g)/动物体重(kg)。
1.2.5取材
取材时相分别为灌胃后第2周、第4周。
1％苯巴比妥钠3.5mL/kg腹腔注射麻醉，麻醉满意后，摘除双眼球。每个时相分别在每组选取1只眼球，保存于4％多聚甲醛溶液中，行常规病理切片及免疫组化检测。其余眼球在解剖显微镜下去除眼前节，用显微镊子剥离出视网膜组织，保存于-80℃冰箱中，供qPCR检测视网膜GSK-3βmRNA、β-catenin mRNA、PAX6 mRNA、Ngn1 mRNA、Ngn2 mRNA、IL-1βmRNA的相对表达量，Western blot检测HSP27、HSP60、HSP70的表达。
1.2.6检测过程
①视网膜组织形态检查
HE染色步骤：
(1)从固定液中取出标本。
(2)脱水浸蜡：将标本分别在浓度为75％、85％、95％的酒精中进行乙醇梯度脱水12h，100％的酒精中脱水14h；将脱水后的标本用先后用二甲苯Ⅰ溶液浸泡1h，二甲苯Ⅱ溶液浸泡2h；然后将标本置于石蜡Ⅰ中1h，石蜡Ⅱ中2h。
(3)包埋：将已浸蜡好的标本放置注有溶化石蜡的蜡槽内，至石蜡冷却。
(4)切片：用切片机将包埋好的标本石蜡块用切片机连续切片，切成约5μm厚，然后将其在水溶箱中展开，捞片，晒干，烤干成石蜡切片。
(5)脱蜡：分别于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ溶液中浸泡10min，然后在浓度为100％、95％、85％、75％的酒精中分别浸泡5min，自来水中浸泡3min，蒸馏水中浸泡3min。
(6)常规HE染色：苏木精浸泡5min，自来水浸洗1min，1％盐酸酒精分化30s，自来水浸洗2min，蒸馏水浸洗1min，伊红溶液浸泡2min，自来水浸洗3min，85％、90％的酒精中浸泡30s，95％的酒精中浸泡1min，100％的酒精中浸泡2min，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ溶液中分别浸泡2min，最后用中性树脂封固。
在光学显微镜下观察HE染色标本视网膜各层结构的形态学变化。
②免疫组化法检测视网膜小胶质细胞表面抗原OX42表达
(1)经上述步骤脱蜡、复水后，3％H2O2室温处理10min以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗2min×3次。
(2)抗原热修复：将切片置于装有枸橼酸盐缓冲液的玻璃容器(耐高温)中，放入微波炉内，容器内液体温度达到沸腾后断电，连续三次。待冷却后，PBS冲洗3min×3次。
(3)血清封闭：滴加山羊血清封闭液，置于室温下30分钟。PBS冲洗2min×3次。
(4)滴加一抗:OX42兔抗鼠单克隆抗体(稀释度为1:200)，4℃冰箱过夜，PBS冲洗3min×3次。
(5)滴加二抗:山羊抗兔IgG抗体，37℃孵育30min，PBS冲洗3min×3次。
(6)加SABC：滴加SABC，放置37℃恒温箱中20分钟，PBS冲洗5min×3次。
(7)加显色剂：取A(DAB)、B(H2O2)、C(磷酸缓冲液)三种试剂各1滴，蒸馏水1ml，加入DAB试剂盒中，将其混合均匀后滴加至载玻片组织上，镜下观察至显色，用蒸馏水洗涤。
(8)复染：将载玻片置于苏木素中复染。在显微镜下观察掌握染色程度，待出现阳性染色颗粒时，立即放入清水漂洗终止显色。
(9)封片:将玻片样本周围擦干，放置到第二天待样本干燥后二甲苯透明1-2s，滤纸吸干，中性树脂封片，镜检。
(10)结果判定
高倍镜下观察OX42蛋白的表达情况，判断标准：免疫组化反应后阳性标记的细胞胞浆着色呈棕色或深棕色。高倍镜下随机选取5个视网膜视野，用图像分析系统进行图像分析处理。
③qPCR检测视网膜GSK-3βmRNA、β-catenin mRNA、PAX6mRNA、Ngn1mRNA、Ngn2mRNA、IL-1βmRNA的相对表达量，Western blot检测HSP27、HSP60、HSP70的表达。
溶液配制：
(1)10×TAE：Tris(MW121.14)：48.4g；乙酸：11.42mL；
0.5M EDTA(pH8.0)：20mL；最后用蒸馏水定容至1L，高温灭菌后室温下保存。
(2)10×核酸电泳加样缓冲液：pH8.0EDTA：pH8.0EDTA；甘油：50％；溴酚蓝：0.25％
(3)RNaseA母液(10mg/mL)：RNaseA：0.1g；15mM NaCl：10mL；10mM Tris-HCl调节pH7.5；5分装至1.5mL管中，-20℃保存备用。
(4)Agarose凝胶：琼脂糖：0.2g；1×TAE：20mL；微波炉加热至琼脂糖溶解，冷却至60℃，加入8μL EB染料，倒入胶槽，冷却20min左右至凝固。
(5)无酶水：DEPC：1ml；超纯水：1L；摇匀16h,调至pH8，湿热灭菌(121℃，20min)，分装4℃保存备用
RNA提取
(1)实验前准备
121℃，20min湿热灭菌三蒸水中1L加入1ml的DEPC，摇匀16h，即为0.1％DEPC水；将所有提RNA所需器械及耗材如：Axygen无酶tip头、离心管，匀浆器等，浸泡于1％DEPC水中过夜。第二天将所有浸泡于0.1％DEPC中的器械捞起，用报纸包装好，121℃，60min湿热灭菌后，即可用。
(2)Trizol提取细胞总RNA
1)取保存在Trizol中的组织约0.02g，加入1mlTrizol于匀浆器中充分研磨匀浆，混匀后室温裂解3min。加入0.2倍体积的三氯甲烷，振荡，室温静置3-5min。
2)离心，12000rpm,15min。取上层液相，加入等体积的异丙醇，-20℃静置20min。
3)12000rpm，15min低温离心，去上清，沉淀中加入1ml75％乙醇(无菌DEPC处理水配制)，仪器震荡。
4)12000rpm，5min低温离心，去上清，空气干燥5～10min。加入50μl无菌无酶水溶解沉淀。
5)紫外分光光度计测定浓度，吸取2ul RNA溶液于石英比色杯中，用无酶水定容至100ul，在260nm与280nm处测其吸光度值，并计算其浓度跟纯度。RNA浓度(ng/ul)＝A260*稀释倍数*40，浓度在500ng/ul-1000ng/ul，RNA纯度＝OD260/OD280，比值在1.8-2.0之间均可。
(3)RNA的琼脂糖凝胶电泳
电泳槽用3％的双蒸水(灭菌DEPC处理水配制)处理0.5h；配制1％变性琼脂糖凝胶，0.2g琼脂糖，20ml无菌DEPC处理水，加热至琼脂糖溶解，冷至60℃,加入0.5μlEB(10mg/ml)，混匀后倒胶；取2μl提取的RNA，按1:5的比例与loading buffer premix混匀，170V恒压电泳，溴酚蓝前沿迁移至凝胶总长2/3处停止电泳；凝胶成像系统下观察。
RNA反转录
以组织总mRNA为模板，逆转录cDNA，反应体系、操作步骤和逆转录条件参见下表：
(1)反应体系
(2)涡旋振荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
(3)42℃孵育30-50min，85℃孵育5min。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
(4)逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，或置于-20℃长期保存。
qPCR实验方法：SYBR法
(1)引物设计
在NCBI上搜索目的基因的序列，运用primer5软件设计引物，有南京金斯瑞合成引物。
GSK-3β-F：5’-CACATTCCTCGCACTTACC-3’
GSK-3β-R:5’-AGCAGCCCATATCCACAT-3’
product length：259bp
β-catenin-F：5’-AGGGCAATCCTGAGGAAGAAGA-3’
β-catenin-R:5’-TGCGTGAAGGACTGGGAAAA-3’
product length：82bp
NGN1-F：5’-CGGCCAGCGATACAGAGT-3’
NGN1-R:5’-GTACGGGATGAAGCAGGGT-3’
product length：191bp
NGN2-F：5’-AGGCTCAAGGCCAACAAC-3’
NGN2-R:5’-GGAGGAAGGTGGAGAAGG-3’
product length：288bp
PAX 6-F：5’-TGGGCAGGTATTACGAGA-3’
PAX6-R:5’-GTCTGTCCGTTCAGCATC-3’
product length：289bp
IL-1β-F：5’-TGTGATGTTCCCATTAGAC-3’
IL-1β-R:5’-AATACCACTTGTTGGCTTA-3’
产物长度：131bp
actin-F：5’-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3’
actin-R:5’-TAATGTCACGCACGATTTCC-3’
product length：107bp
(2)体系组成：
实时定量PCR(每个样本每个指标3个孔，共30ul体系，每孔10ul)
(3)定量PCR扩增程序：
④用Western blot法检测HSP27、HSP60、HSP70的表达
溶液配制
1.0mol/L Tris·HCl
1.74mg/ml(10mmol/L)PMSF
10％SDS
10％过硫酸胺(APS)
1.5mol/L Tris·HCl(pH8.8)
0.5mol/L Tris·HCl(pH6.8)
30％Acr/Bic
还原型5XSDS上样缓冲液
电泳液缓冲液
转膜缓冲液
10×丽春红染液
TBS缓冲液、TBST缓冲液
封闭液
第一步：样品制备
剪取0.25g组织，用冰预冷PBS洗组织，加入300ulRIPA裂解液于匀浆器中反复研磨组织直至看不见组织块；
冰上，蛋白裂解30分钟；
4℃，12000rpm离心15min。(提前开离心机预冷)；
将离心后的上清分装转移倒0.5ml的离心管中，部分用于实验多余的存于-20℃；
第二步：蛋白浓度检测
按照BCA蛋白定量试剂盒(Wellbio)使用说明操作，测定蛋白浓度。
根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
完全溶解蛋白标准品，浓度为2mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。
将标准品按0,1,2,3,4,5,6μl加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20μl。
加适当体积样品(样品制备中步骤4的部分上清液)到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液到20μl。
各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30min。
测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出蛋白浓度，样品浓度范围在9-10ug/ul。仅供下一步实验作为参考。
第三步：Western blot
(一)电泳
配8％、10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶后，用异丙醇封胶。
当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层异丙醇并用吸水纸将其吸干。
配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
电泳样品准备，使每个样品总蛋白上50ug—100ug计算各个样品所需取样量，并与5*loading buffer混匀，沸水煮5min，放入冰盒中速冷。
根据蛋白定量的结果，每空上样5ul已变性蛋白，开始电泳。浓缩胶电泳电压为80V，分离胶电泳电压为120V。待溴酚蓝电泳至胶底部时终止电泳。
(二)转膜
分别切胶HSP27(27KD)，HSP60(60KD)，HSP70(95KD)，β-actin(42KD)。
准备6张与胶同样大小的滤纸和1张PVDF膜，PVDF膜先在甲醇中浸湿，然后与滤纸一起放入转膜缓冲液中，至完全浸透。
按照3张滤纸，膜，胶，另3张滤纸的顺序依次放好，要求中间没有气泡。
盖上仪器，接通电源，转膜300mA，HSP60约80min，HSP27约45min，HSP70约120min，β-actin约1h。
转膜完毕后，将膜取出放入1*TBST中洗1次，时间5min。
用丽春红染膜，检测蛋白转膜的效率。用1*TBST将丽春红洗净。
(三)封闭
用1*TBST配制5％脱脂奶粉，将膜浸入后，室温放置1小时。
(四)一抗孵育
用1*TBST将一抗按照一定比例稀释(具体比例见下表)，将膜与一抗一起孵育，4度过夜。孵育结束，1*TBST洗3次，每次15min。(注：大部分CST的抗体需要用5％BSA的1*TBST稀释)
(五)二抗孵育
用1*TBST稀释HRP标记的二抗(Proteintech)，稀释比例1：3000，将稀释后的二抗与膜共同孵育45-60min。孵育结束，1*TBST洗3次，每次15min。
(六)显色/曝光
ECL显色曝光：使用ECL化学发光液(Thermo)与膜孵育3min，用吸水纸吸尽液体，用保鲜膜将膜包裹杂交膜，在暗盒内与X胶片曝光数秒至数分钟；显影冲洗。
实验结果
3.1烧灼巩膜表浅静脉的方法对眼压的影响
手术后8w，81％的大鼠维持在高眼压状态。
表1造模后各组眼压情况(单位：mmHg)
注：#P＜0.05，表示术后同一时期各组的眼压值与正常组(A组)眼压值比较，差异有统计学意义；*P＜0.05，表示术后不同时期各组的眼压值与本组的术前眼压值进行比较，差异有统计学意义。
从上表中可得出以下结论：
(1)手术前6组大鼠眼压值组间比较，P>0.05，差异无统计学意义。
(2)术后第1天，各组大鼠眼压值与同一时期A组大鼠眼压值比较，P<0.01，差异有显著统计学意义，说明手术后第1天，各组大鼠眼压均有明显上升。
(3)手术后8周，各组大鼠眼压值与同时期A组比较，P<0.01，差异有显著统计学意义，说明术后8周，各组大鼠眼压值仍持续在较高水平。
(4)手术后不同时期各组眼压值与该组术前比较：
B、C、D、E、F组大鼠眼压值在术后第1天和术后第8周与术前比较，P<0.01，差异有显著统计学意义，术后第1天和术后第8周比较，P＞0.05，差异无统计学意义。说明B、C、D、E、F组大鼠造模后第1天、造模后第8周较手术前眼压值明显上升，且维持在高眼压状态。
3.2光镜下观察各组大鼠视网膜结构
空白组(A组)：视网膜神经节细胞层，内、外核层等各层结构排列有序，形态规则(附图1)。
成模后第2周：
模型组(B组)：视网膜神经纤维层水肿，排列疏松，形态欠规则，视网膜神经节细胞层及内核层细胞减少(附图2中A图)。
青光安Ⅱ号方组(C、D、E组)及益脉康分散片组(F组)：视网膜神经纤维层稍有水肿，排列较疏松，形态尚规则，视网膜神经节细胞层及内核层细胞较空白组有所减少(分别对应附图2中B，C，D，E图)。
成模后第4周：
模型组：视网膜神经纤维层水肿加重，排列疏松，形态不规则，视网膜神经节细胞层及内核层萎缩，视网膜神经节细胞明显减少(附图3中A图)。
青光安Ⅱ号方低、中剂量组：视网膜神经纤维层水肿稍有减轻，排列较整齐，形态较规则，视网膜神经节细胞层及内核层未见明显萎缩，神经节细胞数量较2周前无明显减少(分别对应附图3中B，C图)。
青光安Ⅱ号方高剂量组：视网膜神经纤维层水肿明显减轻，视网膜各层排列较整齐，形态较规则，视网膜神经节细胞层及内核层未见萎缩，神经节细胞较2周前未见减少(附图3中D图)。
益脉康分散片组：视网膜神经纤维层水肿未见明显加重，视网膜各层排列较整齐，形态尚规则，视网膜神经节细胞层及内核层未见明显萎缩，神经节细胞较2周前略有减少(附图3中E图)。
3.3青光安Ⅱ号方对慢性高眼压大鼠视网膜上OX42蛋白表达的影响
正常视网膜中，在神经纤维层、神经节细胞层及内丛状层有少量OX42蛋白阳性表达(附图4)。成模后第2周：B组视网膜上OX42蛋白阳性表达明显增多，并逐渐向外丛状层迁移(附图5中A图)。C、D、E、F组视网膜上OX42蛋白阳性表达较空白组略有增多，但较模型组少，C、D、E、F组比较，差异没有统计学意义(附图5中B，C，D，E图)。成模后第4周：各组与B组比较，P＜0.05，差异有统计学意义。模型组OX42蛋白表达持续增高，用药后各组OX42蛋白的表达均减少。C、D、E组与F组比较，P＜0.05，差异有统计学意义。C、D组与E组比较，P＜0.05，差异有统计学意义。C组与D组比较，P＞0.05，差异无统计学意义(附图6中A，B，C，D，E图)(表2)。
表2各组OX42蛋白平均光密度结果
注：*P<0.05,术后第2周，各组OX42蛋白平均光密度值与模型组(B组)比较，差异有统计学意义。
3.4青光安Ⅱ号方对慢性高眼压大鼠视网膜上GSK-3βmRNA相对表达量的影响
SD大鼠慢性高眼压模型后灌胃14天A、C、D、E、F各组GSK-3βmRNA表达与B组GSK-3βmRNA表达比较，B组GSK-3βmRNA表达明显高于其他五组，P＜0.05，差异有统计学意义。C、D、E、F组比较，P＞0.05，差异无统计学意义。成模后灌胃28天C、D、E、F各组GSK-3βmRNA表达下调明显，与B组比较，P＜0.05，差异有统计学意义。C、D、E组GSK-3βmRNA表达与F组比较，P＜0.05，差异有统计学意义。C、D组与E组比较，P＜0.05，差异有统计学意义。说明灌药28天后，高剂量青光安Ⅱ号方在抑制GSK-3βmRNA表达释放的作用上优于低、中剂量。C组与D组比较，P＞0.05，差异无统计学意义。(表3)
表3各组GSK-3βmRNA相对表达量
注：各组GSK-3βmRNA相对表达量比较，灌胃后第14天，*P＜0.05,各组与B组比较，差异有统计学意义。灌胃后第28天，▲P＜0.05,各组与B组比较，差异有统计学意义。#P＜0.05,C、D、E组与F组比较，差异有统计学意义。△P＜0.05,C、D组与E组比较，差异有统计学意义。扩增曲线(附图7)熔解曲线(附图8)
3.5青光安Ⅱ号方对慢性高眼压大鼠视网膜β-catenin mRNA相对表达量的影响
SD大鼠慢性高眼压模型后灌胃14天各组各组与B组比较，P＜0.05，差异有统计学意义。C、D、E、F组比较，P＞0.05，差异无统计学意义。成模后4周各组与B组比较，P＜0.05，差异有统计学意义。C、D、E组与F组比较，P＜0.05，差异有统计学意义。C、D组与E组比较，P＜0.05，差异有统计学意义。说明灌药28天后，青光安Ⅱ号方高剂量在促进β-catenin释放的作用上优于低、中剂量。C组与D组比较，P＞0.05，差异无统计学意义。(表4)
表4各组β-catenin mRNA相对表达量
注：各组β-catenin mRNA相对表达量比较，灌胃后第14天，*P＜0.05,各组与B组比较，差异有统计学意义。灌胃后第28天，▲P＜0.05,各组与B组比较，差异有统计学意义。#P＜0.05,C、D、E组与F组比较，差异有统计学意义。△P＜0.05,C、D组与E组比较，差异有统计学意义。扩增曲线(附图9)熔解曲线(附图10)
3.6青光安Ⅱ号方对慢性高眼压大鼠视网膜PAX6 mRNA相对表达量的影响
SD大鼠慢性高眼压模型成模灌胃14天后，各组PAX6 mRNA表达量与B组比较，P<0.05，差异有统计学意义；C、D、E、F组组间比较，P＞0.05，差异无统计学意义。SD大鼠慢性高眼压模型成模灌胃28天后，C、D、E组与F组比较，P<0.05，差异有统计学意义。C、D组与E组比较，P<0.05，差异有统计学意义。C组与D组比较，P＞0.05，差异无统计学意义。说明灌药28天后，青光安Ⅱ号方高剂量在促进PAX6释放的作用上优于低、中剂量及益脉康分散片。(表5)
表5各组PAX6 mRNA相对表达量
注：各组PAX6 mRNA相对表达量比较，灌胃后第14天，*P＜0.05,各组与B组比较，差异有统计学意义。灌胃后第28天，▲P＜0.05,各组与B组比较，差异有统计学意义。#P＜0.05,C、D、E组与F组比较，差异有统计学意义。△P＜0.05,C、D组与E组比较，差异有统计学意义。扩增曲线(附图11)熔解曲线(附图12)
3.7青光安Ⅱ号方对慢性高眼压大鼠视网膜上Ngn1 mRNA相对表达量的影响
SD大鼠慢性高眼压模型成模灌胃14天后，各组Ngn1 mRNA表达量与B组比较，P<0.05，差异有统计学意义；C、D、E、F组组间比较，P＞0.05，差异无统计学意义。SD大鼠慢性高眼压模型成模灌胃28天后，C、D、E组与F组比较，P<0.05，差异有统计学意义。C、D组与E组比较，P<0.05，差异有统计学意义。C组与D组比较，P＞0.05，差异无统计学意义。说明灌药28天后，青光安Ⅱ号方高剂量在促进Ngn1释放的作用上优于低、中剂量及益脉康分散片。(表6)
表6各组Ngn1 mRNA相对表达量
注：各组Ngn1 mRNA相对表达量比较，灌胃后第14天，*P＜0.05,各组与B组比较，差异有统计学意义。灌胃后第28天，▲P＜0.05,各组与B组比较，差异有统计学意义。#P＜0.05,C、D、E组与F组比较，差异有统计学意义。△P＜0.05,C、D组与E组比较，差异有统计学意义。
扩增曲线(附图13)熔解曲线(附图14)
3.8青光安Ⅱ号方对慢性高眼压大鼠视网膜Ngn2mRNA相对表达量的影响
SD大鼠慢性高眼压模型成模灌胃14天后，各组Ngn2mRNA表达量与B组比较，P<0.05，差异有统计学意义；C、D、E、F组组间比较，P＞0.05，差异无统计学意义。SD大鼠慢性高眼压模型成模灌胃28天后，C、D、E组与F组比较，P<0.05，差异有统计学意义。C、D组与E组比较，P<0.05，差异有统计学意义。C组与D组比较，P＞0.05，差异无统计学意义。说明灌药28天后，青光安Ⅱ号方高剂量在促进Ngn2释放的作用上优于低、中剂量及益脉康分散片。(表7)
表7各组Ngn2mRNA相对表达量
注：各组Ngn2mRNA相对表达量比较，灌胃后第14天，*P＜0.05,各组与B组比较，差异有统计学意义。灌胃后第28天，▲P＜0.05,各组与B组比较，差异有统计学意义。#P＜0.05,C、D、E组与F组较，差异有统计学意义。△P＜0.05,C、D组与E组比较，差异有统计学意义。扩增曲线(附图15)熔解曲线(附图16)
3.9青光安Ⅱ号方对慢性高眼压大鼠视网膜IL-1βmRNA相对表达量的影响
成模后2周各组与B组比较，P＜0.05，差异有统计学意义。C、D、E、F组比较，P＞0.05，差异无统计学意义。成模后4周各组与B组比较，P＜0.05，差异有统计学意义。C、D、E组与F组比较，P＜0.05，差异有统计学意义。C、D组与E组比较，P＜0.05，差异有统计学意义。说明灌药4周后，青光安Ⅱ号方高剂量在抑制IL-1β释放的作用上优于低、中剂量。C组与D组比较，P＞0.05，差异无统计学意义。(表8)
表8各组IL-1βmRNA相对表达量
注：各组IL-1βmRNA相对表达量比较，术后第2周，*P＜0.05,各组与B组比较，差异有统计学意义。术后第4周，▲P＜0.05,各组与B组比较，差异有统计学意义。#P＜0.05,C、D、E组与F组比较，差异有统计学意义。△P＜0.05,C、D组与E组比较，差异有统计学意义。扩增曲线(附图17)熔解曲线(附图18)，内参β-actin mRNA扩增曲线(附图19)溶解曲线(附图20)。
3.10青光安Ⅱ号方对慢性高眼压大鼠视网膜HSP27表达的影响
各组大鼠视网膜HSP27表达的相对灰度值结果比较：
大鼠慢性高眼压模型成模后灌胃2周，各组与B组比较，P＜0.05，差异有统计学意义；C组与F组、D组F组比较，P＞0.05，差异无统计学意义；E组与F组比较，P＜0.05，差异具有统计学意义。C、D、E组两两比较，P＞0.05，差异无统计学意义。大鼠慢性高眼压模型成模后灌胃4周，各组与B组比较，P＜0.05，差异有统计学意义；C、D、E组与F组比较，P＜0.05，差异有统计学意义；C、D组与E组比较，P＜0.05，差异有统计学意义；C、D组比较，P＞0.05，差异无统计学意义。说明受视神经损伤的影响，视网膜HSP27会应激性升高；青光安Ⅱ号方及益脉康分散片灌胃均可促进EIOP大鼠视网膜HSP27的表达，其中以青光安Ⅱ号方高剂量组效果最优。(见表9)
表9：各组大鼠视网膜HSP27表达的相对灰度值
注：同一时期，各组HSP27表达的相对灰度值比较：*P＜0.05,各组与B组比较，差异有统计学意义。#P＜0.05,C、D、E组与F组比较，差异有统计学意义。△P＜0.05,C、D组与E组比较，差异有统计学意义。▲P＜0.05,C、D组比较，差异有统计学意义。
3.11青光安Ⅱ号方对慢性高眼压大鼠视网膜HSP60表达的影响
各组大鼠视网膜HSP60表达的相对灰度值结果比较：
大鼠慢性高眼压模型成模后灌胃2周，各组与B组比较，P＜0.05，差异有统计学意义；C、D、E、F组比较，P＞0.05，差异无统计学意义。大鼠慢性高眼压模型成模后灌胃4周，各组与B组比较，P＜0.05，差异有统计学意义；C、D、E组与F组比较，P＜0.05，差异有统计学意义；C、D组与E组比较，P＜0.05，差异有统计学意义；C、D组比较，P＞0.05，差异无统计学意义。说明受视神经损伤的影响，视网膜HSP60会应激性升高；青光安Ⅱ号方及益脉康分散片灌胃均可促进EIOP大鼠视网膜HSP60的表达，其中以青光安Ⅱ号方高剂量组效果最优。(见表10)
表10：各组大鼠视网膜HSP60表达的相对灰度值
注：同一时期，各组HSP60表达的相对灰度值比较：*P＜0.05,各组与B组比较，差异有统计学意义。#P＜0.05,C、D、E组与F组比较，差异有统计学意义。△P＜0.05,C、D组与E组比较，差异有统计学意义。▲P＜0.05,C、D组比较，差异有统计学意义。
3.12青光安Ⅱ号方对慢性高眼压大鼠视网膜HSP70表达的影响
各组大鼠视网膜HSP70表达的相对灰度值结果比较：
大鼠慢性高眼压模型成模后灌胃2周，各组与B组比较，P＜0.05，差异有统计学意义；C、D、E、F组比较，P＞0.05，差异无统计学意义。大鼠慢性高眼压模型成模后灌胃4周，各组与B组比较，P＜0.05，差异有统计学意义；C、D、E组与F组比较，P＜0.05，差异有统计学意义；C组与E组比较，P＜0.05，差异有统计学意义；D组与E组比较，P＞0.05，差异无统计学意义；C、D组比较，P＞0.05，差异无统计学意义。说明受视神经损伤的影响，视网膜HSP70会应激性升高，青光安Ⅱ号方及益脉康分散片灌胃均可促进EIOP大鼠视网膜HSP70的表达，其中以青光安Ⅱ号方高、中剂量组效果最优。(见表11)
表11：各组大鼠视网膜HSP70表达的相对灰度值
注：同一时期，各组HSP70表达的相对灰度值比较：*P＜0.05,各组与B组比较，差异有统计学意义。#P＜0.05,C、D、E组与F组比较，差异有统计学意义。△P＜0.05,C、D组与E组比较，差异有统计学意义。▲P＜0.05,C、D组比较，差异有统计学意义。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种视神经保护作用的药物组合物，其特征在于：以重量份计，由包括如下组分的原料制备得到：枸杞10-20份，川芎8-12份，灯盏细辛8-12份，黄芪10-20份，女贞子10-20份，牛膝8-12份。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：由包括如下组分的原料制备得到：枸杞13-17份，川芎8-12份，灯盏细辛8-12份，黄芪13-17份，女贞子13-17份，牛膝8-12份。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于：各组分的用量为：枸杞15份，川芎10份，灯盏细辛10份，黄芪15份，女贞子15份，牛膝10份。
4.根据权利要求1-3任一项所述的药物组合物，其特征在于：还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
5.根据权利要求1-4任一项所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的剂型为片剂、散剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂中的一种。
6.制备权利要求1-5任一项所述的药物组合物的方法，其特征在于：包括将各组分制备成浸膏的步骤，具体为：用相当于各组分重量之和7-9倍的水煎煮提取2-3次，每次0.5-2h，合并提取液并浓缩即得浸膏。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：先用相当于各组分重量之和8倍的水煎煮提取1.5h，再用相当于各组分重量之和6倍的水煎煮提取1h，过滤，合并两次滤液，浓缩即得浸膏。
8.权利要求1-5任一项所述的药物组合物或权利要求6-7任一项所述的方法制备得到的药物组合物在制备治疗视神经损伤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述视神经损伤由慢性高眼压引起。
10.根据权利要求8或9所述的应用，所述视神经损伤是由Wnt信号通路阻断、或视网膜小胶质细胞增多、热休克蛋白减少引起的。
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