CN105833265A - 新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂及其制备方法与应用 - Google Patents

新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂及其制备方法与应用，该免疫佐剂是由CpG和PEG对二硫化钼纳米片层进行修饰得到的产物，制备方法包括将二硫化钼纳米片层进行超声处理；然后与CpG和PEG混合，在摇床中温控孵育；离心去除游离的CpG和PEG而得到。本发明纳米免疫佐剂粒径小、尺寸均一、比表面积大，具有较强的近红外区光热转换能力，联合红外激光照射可以很大程度上提高免疫激活相关细胞因子的分泌水平。此外，本发明所述的纳米免疫佐剂具有较低的细胞毒性。本发明具有原料成本低，制备工艺简单，重复性好，性能稳定等优点。

Description

新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于新型纳米免疫佐剂的制备领域，涉及一种片层二硫化钼基纳米免疫佐剂及其制备方法与用途，尤其涉及一种CpG修饰的具有较高光热转换效率的片层二硫化钼纳米免疫佐剂及其制备方法与应用。
背景技术
免疫疗法作为一种新的治疗策略，已发展成为继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗手段，由于其基于机体自身免疫系统的监测和清除功能，通过激发和增强机体的免疫功能杀伤肿瘤细胞，展现了良好的应用前景。同时，由于大部分重组疫苗免疫原性较差，难以诱导良好的免疫应答效果，必须添加免疫佐剂来辅助疫苗发挥作用。
铝盐是目前FDA批准的唯一人用无机盐免疫佐剂，广泛应用于乙肝疫苗和甲肝疫苗等商品化疫苗中。但是由于自身的一系列缺点，铝免疫佐剂目前的研究水平已经不能满足疫苗飞速发展的需要，因此，新型免疫免疫佐剂的开发就显得尤为重要。
相比微米级颗粒，纳米粒子作为疫苗免疫佐剂具有自身的一些优势，纳米粒子具有比表面积大、表面活性中心多、反应活性高、吸附和催化能力强，有助于提高免疫激活相关的细胞因子分泌水平，而下调免疫抑制相关的细胞因子分泌水平；可作为疫苗输送载体，提高抗原被巨噬细胞摄取的能力等。
纳米片层二硫化钼属于过渡金属二硫化物，其片层结构具有比表面积大的特点，对抗原或免疫佐剂具有较强的吸附效果，可以介导抗原或免疫佐剂被巨噬细胞识别和摄取，而且在近红外区有明显的光热转换能力，可以促进抗原或免疫佐剂在体内的释放，提高疫苗的效应。
发明内容
本发明目的在于提供一种新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂及其制备方法与应用。本发明提供的新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂具有的特点比表面积大，对抗原或免疫佐剂具有较强的吸附效果，而且在近红外区有明显的光热转换能力，可以促进抗原或免疫佐剂在体内的释放。
本发明的目的之一是提供一种新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂，是由CpG(即未甲基化寡聚核苷酸)和PEG(即聚乙二醇)对二硫化钼纳米片层进行修饰得到的产物，所述二硫化钼纳米片层与CpG的摩尔比为100-300:1；所述二硫化钼纳米片层与PEG的摩尔比为10-30:1。
所述新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂粒径为50-200nm。
其中，所述二硫化钼纳米片层与CpG的摩尔比可为100:1，200:1，300:1，优选为300:1；所述二硫化钼纳米片层与PEG的摩尔比可为10:1，20:1，30:1，优选为30:1。
作为优选，所述PEG的分子量为2000-10000，进一步优选为5000。
作为优选，所述二硫化钼纳米片层为1-10层。
优选地，所述二硫化钼纳米片层结构通过使用剥离剂将二硫化钼液相剥离获得。优选地，所述剥离剂选自正丁基锂和/或氯化锂。
本发明采用CpG和PEG对二硫化钼纳米片层进行修饰，能够提升二硫化钼纳米片层在溶液中的稳定性，得到分散性和稳定性均较好的二硫化钼片层结构。因此，本发明片层二硫化钼基纳米免疫佐剂提供加入PEG大大提高了材料的稳定性、分散性和生物相容性。且该新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂粒径小、尺寸均一，比表面积大。
本发明的目的之二在于提供上述新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂的制备方法，包括将大尺寸二硫化钼纳米片层结构在冰浴条件下经超声破碎制备尺寸较小的纳米片层结构，将超声后的二硫化钼片层结构和CpG(即未甲基化寡聚核苷酸)和PEG(即聚乙二醇)在溶液中混合，摇床中温控孵育后离心去除游离的CpG和PEG，得到粒径小、尺寸均一、比表面积大的片层二硫化钼基纳米免疫佐剂。
具体地，上述新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂的制备方法，包括以下步骤：
在冰浴条件下将二硫化钼纳米片层进行超声处理；然后与CpG和PEG混合，在摇床中温控孵育；离心去除游离的CpG和PEG，即得所述片层二硫化钼基纳米免疫佐剂。
作为优选，所述超声功率为50-900W，进一步优选为150-300w，例如150w，200w，300w；
作为优选，所述超声处理时间为10分钟-10小时，进一步优选30分钟-1小时，例如30分钟、1小时；
作为优选，所述二硫化钼纳米片层与CpG的摩尔比为100-300:1，例如100:1，200:1，300:1，进一步优选为300:1；
作为优选，所述二硫化钼纳米片层与PEG的摩尔比为10-30:1，例如10:1，20:1，30:1，进一步优选30:1；
作为优选，所述PEG的分子量为2000-10000，进一步优选为5000；
作为优选，所述摇床转速为50-500rpm/min，进一步优选50-150rpm/min；更优选100rpm/min；
作为优选，所述孵育温度控制为4-37℃，优选为20-25℃；
作为优选，所述摇床孵育时间为1h-24h，优选10-14h。
作为优选，离心速率为5000-20000rpm/min,优选16000rpm/min。
作为优选，本发明所述二硫化钼纳米片层为1-10层的纳米片。
优选地，所述二硫化钼纳米片层结构通过使用剥离剂将二硫化钼液相剥离获得。
更具体地，上述新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂的制备方法，包括以下步骤：
在冰浴条件下将液相剥离的1-10层的二硫化钼纳米片层进行超声处理30分钟-1小时，所述超声功率为150-300w；然后与CpG和PEG混合，在摇床中20-25℃温控孵育10h-14h；离心去除游离的CpG和PEG，即得所述片层二硫化钼基纳米免疫佐剂；
其中，所述二硫化钼纳米片层与CpG的摩尔比为100-300:1，所述二硫化钼纳米片层与PEG的摩尔比为10-30:1。
本发明对于二硫化钼纳米片的制备方法不做具体限定，任何能够制备得到呈负电位的二硫化钼纳米片的方法均可用于本发明。
作为优选技术方案，所述二硫化钼纳米片层的制备方法包括以下步骤：
(1)保护性气氛下，向二硫化钼粉末中加入剥离剂分散液，进行液相剥离反应；
(2)反应完毕，向反应液中加入溶剂，分层取沉淀；
(3)将步骤(2)所得沉淀分散在一定溶剂中，超声，离心，取上清液进行透析，得到二硫化钼纳米片层水溶液。
上述二硫化钼纳米片层结构的制备方法，其中：
优选地，所述保护性气氛为非氧化气氛，优选氮气气氛、氦气气氛、氖气气氛或氩气气氛中的任意1种或至少2种的组合。
优选地，所述剥离剂选自正丁基锂和/或氯化锂。
所述二硫化钼和剥离剂的摩尔比优选为1:2-10，例如1:2.2、1:2.5、1:2.8、1:3.4、1:3.9、1:4.6、1:5.7、1:6.2、1.7、1:7.6等，进一步优选为3:8。
优选地，所述剥离剂分散液的分散溶剂选自正己烷、环己烷、苯等饱和烃溶液中的一种或几种的混合液；所述混合液例如正己烷和苯的混合液，环己烷和正己烷的混合液，正己烷、环己烷和苯的混合液等。
优选地，所述液相剥离反应的温度为4-37℃，例如22℃、25℃、27℃等，优选室温；反应时间1-144h，例如8h、15h、33h、75h、95h、125h、142h等，优选48h。
优选地，步骤(2)所述溶剂与步骤(1)所述剥离剂分散液互溶。
优选地，步骤(3)所述溶剂选自去离子水、甲醇、乙醇、异丙醇等中的一种或几种的混合液；所述混合液例如甲醇和乙醇的混合液，乙醇和异丙醇的混合液，水和异丙醇的混合液，甲醇、乙醇和水的混合液等；优选去离子水。
优选地，步骤(3)所述透析的分子截留量为14kDa；透析时间≥48h。
本发明的目的之三是提供上述新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂用于制备免疫佐剂的应用或用于制备疫苗的应用；优选地，用于制备具有提高抗原的免疫原性、增强免疫应答功能的免疫佐剂的应用或用于制备提高抗原的免疫原性、增强免疫应答功能的疫苗的应用。
本发明所述新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂即可单独用作免疫佐剂，也可与本领域可用的载体或辅料复配用作免疫佐剂；还可以与本领域可用的疫苗或其他免疫佐剂联用。
本发明还包括含有上述新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂的疫苗。
本发明所述新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂对于提高抗原的免疫原性，增强免疫应答具有显著效果。
本发明所述新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂联合红外激光照射可显著提高免疫激活相关的细胞因子分泌水平，增强免疫应答的效果。
检测上述新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂功能效果的方法包括：
(1)检测不同浓度的上述新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂经激光照射后的光热转换效率；
(2)对上述新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂进行细胞毒性评价；
(3)检测单独上述新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂及联合红外光照射后上述新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂免疫激活相关细胞因子TNF-α的分泌水平。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供的新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂粒径小、尺寸均一，比表面积大，负载佐剂且生物相容性好，对抗原或免疫佐剂具有较强的吸附效果，可更好地被巨噬细胞识别、摄取和释放，且具有较强的近红外区光热转换能力，联合红外激光照射可显著提高免疫激活相关的细胞因子(TNF-α、IL-12等)的分泌水平，促进抗原或免疫佐剂在体内的释放，增强免疫应答的效果。
(2)本发明所述的纳米免疫佐剂具有较低的细胞毒性。
(3)本发明提供的新型片层二硫化钼基纳米免疫佐剂的制备方法工艺简单易操作，原料成本低，重复性好，性能稳定，设备要求低；制备得到的复合材料的杂质含量少，产量高。
附图说明
图1为实施例1制备得到的片层二硫化钼基纳米免疫佐剂的透射电镜(TEM)图；
图2为实施例1得到的片层二硫化钼基纳米免疫佐剂的光热转换测试结果；
图3为实施例1得到的片层二硫化钼基纳米免疫佐剂的细胞毒性实验结果；
图4为实施例1得到的片层二硫化钼基纳米免疫佐剂联合红外激光照射后对免疫刺激因子分泌水平的影响。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。以下实施例所述PEG的分子量为5000。
实施例1
A.二硫化钼纳米片层的制备
(1)称取500mg二硫化钼粉末(99％)置于10mL干燥的圆底烧瓶中，通入氮气，加入5mL 1.6mol/L分散在己烷中的正丁基锂，室温下反应48h；
(2)反应结束后，加入己烷，稀释反应溶液，离心10min；用己烷分散下层沉淀，反复离心2次；
(3)取下层沉淀分散在水溶液中，超声至无气泡产生；离心10min，去掉下层，取上清液，用14kDa分子截留量的透析膜透析48h，得到片层10以下的二硫化钼纳米片水溶液。
B.粒径小，尺寸均一的二硫化钼基纳米免疫佐剂的制备
(1)将A步骤制备的二硫化钼纳米片层在冰浴条件下超声操作，超声功率200W，超声时间30分钟；
(2)将超声制备的粒径小、尺寸均一的纳米片层与CpG和PEG混合，其中所述二硫化钼纳米片层与CpG的摩尔比为300:1，所述二硫化钼纳米片层与PEG的摩尔比为30:1；在摇床(转速100rpm/min)中25℃温控孵育；
(3)16000rpm/min离心去除游离的CpG以及PEG，得到粒径分布尺寸为50-200nm的片层二硫化钼基纳米免疫佐剂。
C.二硫化钼基纳米免疫佐剂的光热转换效率(升温曲线)评价
将上述步骤B制得的不同浓度的片层二硫化钼基纳米免疫佐剂(0ug/ml，50ug/ml，100ug/ml，200ug/ml，300ug/ml和400ug/ml)500ul置于小皿中，采用808nm红外激光进行照射，能量密度2w/cm2,每隔30秒进行测温，连续检测10分钟。
D.二硫化钼基纳米免疫佐剂的细胞毒性评价
(1)配制100μL RAW264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)悬液在96孔板中(每孔1.5×104个细胞)，并使其贴壁。
(2)向96孔板中加入上述步骤B制得的片层二硫化钼基纳米免疫佐剂，使其终浓度梯度为5、10、20、30、40、50μg/mL。
(3)将96孔板在培养箱中孵育48小时。
(4)在每孔加入体积为10μL的CCK-8(Cell Counting Kit，细胞计数试剂盒)溶液，在培养箱内中孵育2小时。
(5)用酶标仪测定450nm处的吸光度。
(6)计算细胞增殖活力。
E.检测二硫化钼基纳米免疫佐剂联合红外激光照射后免疫激活相关细胞因子TNF-α的分泌水平
步骤：将RAW 264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)以1×106个细胞/孔种入6孔板中，每孔加2mL DMEM(即Dulbecco Modified Eagle Medium)培养液，培养24小时后，加入上述步骤B制得的片层二硫化钼基纳米免疫佐剂，二硫化钼基纳米免疫佐剂的终浓度为12.5μg/mL。于37℃、5％CO2的培养箱中培养24h。然后，收集细胞培养液。收集得到的细胞上清，离心去除杂质。所得到的细胞上清采用ELISA(酶联免疫吸附)试剂盒(Life科技公司)进行检测。
实施例2
A.二硫化钼纳米片层的制备
(1)称取500mg二硫化钼粉末(99％)置于10mL干燥的圆底烧瓶中，通入氮气，加入5mL 1.6mol/L分散在己烷中的正丁基锂，室温下反应48h；
(2)反应结束后，加入己烷，稀释反应溶液，离心10min；用己烷分散下层沉淀，反复离心2次；
(3)取下层沉淀分散在水溶液中，超声至无气泡产生；离心10min，去掉下层，取上清液，用14kDa分子截留量的透析膜透析48h，得到片层10以下的二硫化钼纳米片水溶液。
B.粒径小，尺寸均一的二硫化钼基纳米免疫佐剂的制备
(1)将A步骤制备的二硫化钼纳米片层在冰浴条件下超声操作，超声功率200W，超声时间1小时；
(2)将超声制备的粒径小、尺寸均一的纳米片层与CpG和PEG混合，其中所述二硫化钼纳米片层与CpG的摩尔比为300:1，所述二硫化钼纳米片层与PEG的摩尔比为30:1；在摇床(转速100rpm/min)中25℃温控孵育；
(3)16000rpm/min离心去除游离的CpG以及PEG，得到片层二硫化钼基纳米免疫佐剂。粒径分布尺寸为50-200nm。
C.二硫化钼基纳米免疫佐剂的光热转换效率(升温曲线)评价
将上述步骤B制得的不同浓度的片层二硫化钼基纳米免疫佐剂(0ug/ml，50ug/ml，100ug/ml，200ug/ml，300ug/ml和400ug/ml)500ul置于小皿中，采用808nm红外激光进行照射，能量密度2w/cm2,每隔30秒进行测温，连续检测10分钟。
D.二硫化钼基纳米免疫佐剂的细胞毒性评价
(1)配制100μL细胞悬液RAW 264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)在96孔板中(每孔1.5×104个细胞)，并使其贴壁。
(2)向96孔板中加入上述步骤B制得的片层二硫化钼基纳米免疫佐剂，使其终浓度梯度为5、10、20、30、40、50μg/mL。
(3)将96孔板在培养箱中孵育48小时。
(4)在每孔加入体积为10μL的CCK-8(Cell Counting Kit，细胞计数试剂盒)溶液，在培养箱内中孵育2小时。
(5)用酶标仪测定450nm处的吸光度。
(6)计算细胞增殖活力。
E.检测二硫化钼基纳米免疫佐剂联合红外激光照射后免疫激活相关细胞因子TNF-α的分泌水平
步骤：将RAW 264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)以1×106个细胞/孔种入6孔板中，每孔加2mL DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium)培养液，培养24小时后，加入上述步骤B制得的片层二硫化钼基纳米免疫佐剂，二硫化钼基纳米免疫佐剂的终浓度为12.5μg/mL。于37℃、5％CO2的培养箱中培养24h。然后，收集细胞培养液。收集得到的细胞上清，离心去除杂质。所得到的细胞上清采用ELISA(酶联免疫吸附)试剂盒(Life科技公司)进行检测。
实施例3
A.二硫化钼纳米片层的制备
(1)称取500mg二硫化钼粉末(99％)置于10mL干燥的圆底烧瓶中，通入氮气，加入5mL 1.6mol/L分散在己烷中的正丁基锂，室温下反应48h；
(2)反应结束后，加入己烷，稀释反应溶液，离心10min；用己烷分散下层沉淀，反复离心2次；
(3)取下层沉淀分散在水溶液中，超声至无气泡产生；离心10min，去掉下层，取上清液，用14kDa分子截留量的透析膜透析48h，得到片层10以下的二硫化钼纳米片水溶液。
B.粒径小，尺寸均一的二硫化钼基纳米免疫佐剂的制备
(1)将A步骤制备的二硫化钼纳米片层在冰浴条件下超声操作，超声功率150W，超声时间1小时；
(2)将超声制备的粒径小、尺寸均一的纳米片层与CpG和PEG混合，其中所述二硫化钼纳米片层与CpG的摩尔比为300:1，所述二硫化钼纳米片层与PEG的摩尔比为30:1；在摇床(转速100rpm/min)中25℃温控孵育；
(3)16000rpm/min离心去除游离的CpG以及PEG，得到片层二硫化钼基纳米免疫佐剂。粒径分布尺寸为50-200nm。
C.二硫化钼基纳米免疫佐剂的光热转换效率(升温曲线)评价
方法同实施例1。
D.二硫化钼基纳米免疫佐剂的细胞毒性评价
方法同实施例1。
E.检测二硫化钼基纳米免疫佐剂联合红外激光照射后免疫激活相关细胞因子TNF-α的分泌水平
方法同实施例1。
实施例4
A.二硫化钼纳米片层的制备
(1)称取500mg二硫化钼粉末(99％)置于10mL干燥的圆底烧瓶中，通入氮气，加入5mL 1.6mol/L分散在己烷中的正丁基锂，室温下反应48h；
(2)反应结束后，加入己烷，稀释反应溶液，离心10min；用己烷分散下层沉淀，反复离心2次；
(3)取下层沉淀分散在水溶液中，超声至无气泡产生；离心10min，去掉下层，取上清液，用14kDa分子截留量的透析膜透析48h，得到片层10以下的二硫化钼纳米片水溶液。
B.粒径小，尺寸均一的二硫化钼基纳米免疫佐剂的制备
(1)将A步骤制备的二硫化钼纳米片层在冰浴条件下超声操作，超声功率150W，超声时间1小时；
(2)将超声制备的粒径小、尺寸均一的纳米片层与CpG和PEG混合，其中所述二硫化钼纳米片层与CpG的摩尔比为100:1，所述二硫化钼纳米片层与PEG的摩尔比为30:1；在摇床(转速100rpm/min)中25℃温控孵育；
(3)16000rpm/min离心去除游离的CpG以及PEG，得到片层二硫化钼基纳米免疫佐剂。粒径分布尺寸为50-200nm。
C.二硫化钼基纳米免疫佐剂的光热转换效率(升温曲线)评价
方法同实施例1。
D.二硫化钼基纳米免疫佐剂的细胞毒性评价
方法同实施例1。
E.检测二硫化钼基纳米免疫佐剂联合红外激光照射后免疫激活相关细胞因子TNF-α的分泌水平
方法同实施例1。
对比例1
MOS2-PEG，其制备方法包括：将实施例1步骤A相同的方法制备的二硫化钼纳米片层在冰浴条件下超声操作，超声功率200W，超声时间30分钟；然后与PEG混合，其中所述二硫化钼纳米片层与PEG的摩尔比为30:1；在摇床(转速100rpm/min)中25℃温控孵育；16000rpm/min离心去除游离的PEG，即得。
结构表征：
图1为实施例1制备得到的片层二硫化钼基纳米免疫佐剂的TEM图。图1中二硫化钼片层结构清晰，边缘明显，粒径大小在50-100nm，尺寸均一，分散性很好。
性能测试：
(1)图2为实施例1得到的片层二硫化钼基纳米免疫佐剂的光热转换效率测试结果；从图2中可以看出，相比于水组分来说，随着时间的增加，不同浓度的片层二硫化钼基纳米免疫佐剂的溶液温度均有一定程度的升高，具有浓度依赖性，其中400μg/ml的样品的升温幅度在18℃。表明二硫化钼片层结构具有较好的光热转换能力。
(2)将实施例1得到的片层二硫化钼基纳米免疫佐剂(即MoS2-CpG-PEG)进行细胞毒性评价(图3)。结果表明，不同浓度的片层二硫化钼纳米免疫佐剂与小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW 264.7共孵育48小时后，细胞活性没有明显降低。说明在目前所使用的浓度剂量下(最大剂量50μg/mL)二硫化钼纳米免疫佐剂对细胞成活率影响很小。
(3)将实施例1得到的片层二硫化钼基纳米免疫佐剂(即MoS2-CpG-PEG)联合红外激光考察对免疫激活细胞因子TNF-α分泌水平的影响。
同时考察单纯CpG，单纯PEG，单纯MoS2、MoS2-PEG(即对比例1)和MoS2-CpG-PEG刺激产生TNF-α的能力，结果见图4。从图4可以看出，单纯PEG，单纯MoS2和MoS2-PEG刺激产生的TNF-α维持在低水平，联合红外激光后也没有明显变化；单纯CpG诱导产生TNF-α的能力有了明显提升，但是联合红外激光效果并不明显；而MoS2-CpG-PEG本身较其他几个组分均有显著的提升，联合红外激光后进一步提高了TNF-α的分泌水平。图4中对照是指蒸馏水。
实施例2-4制备的片层二硫化钼基纳米免疫佐剂作用效果与实施例1相当。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种片层二硫化钼基纳米免疫佐剂，是由CpG和PEG对二硫化钼纳米片层进行修饰得到的产物，所述二硫化钼纳米片层与CpG的摩尔比为100-300:1；所述二硫化钼纳米片层与PEG的摩尔比为10-30:1。
2.根据权利要求1所述的片层二硫化钼基纳米免疫佐剂，其特征在于，其粒径为50-200nm。
3.根据权利要求1或2所述的片层二硫化钼基纳米免疫佐剂，其特征在于，所述二硫化钼纳米片层与CpG的摩尔比为300:1；所述二硫化钼纳米片层与PEG的摩尔比为30:1。
4.根据权利要求1或2所述的片层二硫化钼基纳米免疫佐剂，其特征在于，所述二硫化钼纳米片层为通过使用剥离剂将二硫化钼液相剥离获得；优选地，所述剥离剂选自正丁基锂和/或氯化锂；和/或，所述二硫化钼纳米片层为1-10层。
5.一种片层二硫化钼基纳米免疫佐剂的制备方法，包括以下步骤：在冰浴条件下将二硫化钼纳米片层进行超声处理；然后与CpG和PEG混合，在摇床中温控孵育；离心去除游离的CpG和PEG，即得。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述超声功率为50-900W，处理时间为10分钟-10小时；所述摇床转速为50-500rpm/min，所述孵育温度为4-37℃，孵育时间为1h-24h；
优选地，所述超声功率为150-300w，处理时间为30分钟-1小时；所述摇床转速为50-150rpm/min；所述孵育温度为20-25℃，孵育时间为10-14h。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述二硫化钼纳米片层与CpG的摩尔比为100-300:1；所述二硫化钼纳米片层与PEG的摩尔比为10-30:1；所述PEG的分子量为2000-10000；
优选地，所述二硫化钼纳米片层与CpG的摩尔比为300:1；所述二硫化钼纳米片层与PEG的摩尔比为30:1；所述PEG的分子量为5000；和/或，所述二硫化钼纳米片层为1-10层。
8.根据权利要求5-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述二硫化钼纳米的制备方法包括以下步骤：
(1)保护性气氛下，向二硫化钼粉末中加入剥离剂分散液，进行液相剥离反应；
(2)反应完毕，向反应液中加入溶剂，分层取沉淀；
(3)将步骤(2)所得沉淀分散在一定溶剂中，超声，离心，取上清液进行透析，得到二硫化钼纳米片层水溶液。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述剥离剂选自正丁基锂和/或氯化锂；所述二硫化钼和剥离剂的摩尔比为1:2-10，优选为3:8；
所述剥离剂分散液的分散溶剂选自正己烷、环己烷、苯中的一种或几种的混合液；
所述液相剥离反应的温度为4-37℃，反应时间1-144h；
步骤(2)所述溶剂与步骤(1)所述剥离剂分散液互溶；
步骤(3)所述溶剂选自去离子水、甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或几种的混合液；
步骤(3)所述透析的分子截留量为14kDa；透析时间≥48h。
10.权利要求1-4任一项所述的片层二硫化钼基纳米免疫佐剂或权利要求5-9任一项所述方法制备的片层二硫化钼基纳米免疫佐剂用于制备免疫佐剂的应用或用于制备疫苗的应用；优选地，用于制备具有提高抗原的免疫原性、增强免疫应答功能的免疫佐剂的应用或用于制备具有提高抗原的免疫原性、增强免疫应答功能的疫苗的应用。
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