CN105831737A - 一种基于复合菌分段发酵的川明参酵素及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种基于复合菌分段发酵的川明参酵素的制备方法，包括以下步骤：制备基于川明参的发酵醪液；使用糖化酶和酵母菌对发酵醪液进行同步糖化发酵；使用乳酸菌发酵菌剂对糖化发酵后的发酵醪液进行发酵，制备得到川明参酵素。本申请还公开了一种上述制备方法制备得到的基于复合菌分段发酵的川明参酵素，该方法制得的酵素原料产品含有大量益生菌，具有一定的生物活性保健功能性。

Description

一种基于复合菌分段发酵的川明参酵素及其制备方法
技术领域
本申请属于食品发酵领域，具体地说，涉及一种基于复合菌分段发酵的川明参酵素及其制备方法。
背景技术
川明参为伞形科植物川明参(Chuanminshen violaceum Shen etShan)的干燥根。川明参又称明参、明沙参、土明参、沙参，主要产于四川(青北江、金堂、简阳、苍溪、威远、北川、平武、巴中、南川、阆中)、湖北(宜昌、当阳)等地，其中以金堂、青北江、巴中和阆中一带所产之川明参药材质量最佳。川明参具有润肺化痰，养阴和胃，平肝解毒等作用，常用量为10-15g，在民间主要是作为食用，主要用于炖汤或者炖肉。
科学发明表明，川明参中粗蛋白含量高达5％以上，其水解氨基酸总含量超过3％，各类氨基酸达13种以上，尤其是人体必需的7种氨基酸，占总氨基酸含量的40％以上，可广泛应用于医药和保健食品领域，市场前景广阔。除此之外，川明参还含有阿魏酸、香豆素、槲皮素、甾体、三萜酸等生物活性物质。现代医学试验也表明川明参具有明显的镇咳祛痰的作用，川明参多糖具有增强小鼠特异性及非特异性体液免疫的作用和一定的抗突变作用。这些都为川明参的开发提供了理论基础。
酵素，也称为“酶”，是酵母分泌的“代谢产物”，是一种生物催化剂，大多数酵素由蛋白质构成。酵素几乎可以参与所有的身体活动，在酵素的参与下人体能维持正常的机体免疫、新陈代谢、修复组织等生理功能。目前，国内对利用川明参生产酵素的报道和认知还几乎没有。川明参当中大量的蛋白质、多糖等成分结果发酵后，可能含有丰富的超氧化物歧化酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、矿物质以及酚类、维生素、黄酮类等次生代谢产物，具有体内环境、分解、抗炎、抗菌、净化血液等作用。
现有技术中并没有川明参酵素产品的报道，酵素产品大多由果蔬或谷物原料发酵制得；现有的通过果蔬或谷物原料发酵制得的酵素存在菌活性低、色泽差的问题。
发明内容
有鉴于此，本申请上述问题，提供了一种基于复合菌分段发酵的川明参酵素的制备方法，该方法制得的饮料含有大量益生菌，具有一定的生物活性保健功能性。
为了解决上述技术问题，本申请公开了一种基于复合菌分段发酵的川明参酵素的制备方法，包括以下步骤：
1)制备基于川明参的发酵醪液；
2)使用糖化酶和酵母菌对发酵醪液进行同步糖化发酵；
3)使用乳酸菌发酵菌剂对糖化发酵后的发酵醪液进行发酵，制备得到川明参酵素。
进一步地，步骤1)中的制备基于川明参的发酵醪液具体为：
1.1)制备川明参泥：川明参原料清洗去除表面泥土后，按照一定比例加水预煮，破碎成泥，即得到川明参泥；
1.2)将川明参泥与大豆粉或大豆蛋白粉按照质量比(g/g)为1:0.05-1:0.2混合，按照固液比(g/ml)1:0.2-1添加水，在发酵罐当中预煮5-10min保持温度90-95℃；随后降温至75-85℃按照40KNU/kg川明参泥添加液化酶，液化至碘反应为红棕色；115℃灭菌15min同时使液化酶失活，制备得到基于川明参的发酵醪液。
进一步地，大豆粉或大豆蛋白粉的目数为40目以上。
进一步地，步骤2)中使用酵母菌对发酵醪液进行同步糖化发酵具体为：将预处理好的发酵醪液按照质量比(g/g)为1:50-1:25添加预活化好的酵母种子液；同时按0.4AUG/g添加糖化酶；在30-32℃发酵10-14h，期间不断搅拌，搅拌转速为120-200r/min，保持发酵罐搅拌桨转速。
进一步地，酵母种子液的活菌数大于107CFU/ml。
进一步地，预活化好的酵母种子液通过以下方法制备得到：
a)制备酵母活化培养基(g/L)：称量葡萄糖5.0，酵母粉5.0，蛋白胨5.0，(NH4)2SO4 1.5，KH2PO4 1.5，MgSO4.7H2O 0.65，CaCl2 2.8，pH 6.0，于115℃条件下高压蒸汽灭菌15min，制备得到酵母活化培养基；
b)菌种活化：取质量体积百分比为1％的菌粉至预先配制的活化培养基中，于30℃温度条件下摇床培养16h，摇床转速150r/min。
进一步地，步骤3)使用乳酸菌发酵菌剂对糖化发酵后的发酵醪液进行发酵，制备得到川明参酵素具体为：将乳酸菌发酵菌剂培养好的发酵醪液加温至37℃，接入预活化好的乳酸菌发酵菌剂，在35-39℃继续发酵发酵12-16h，制备得到川明参酵素；其中，乳酸菌发酵菌剂是由肠系膜明串珠菌、胚牙乳杆菌、短乳杆菌和乳酸片球菌按照菌落总数1:1:1:1混合而成。
进一步地，预活化好的乳酸菌发酵菌剂的活菌数大于107CFU/ml。
进一步地，预活化好的乳酸菌具体通过以下方法制备得到：
a1)制备乳酸发酵菌剂活化培养基(g/L)：葡萄糖20.0、蛋白胨10、牛肉膏5.0、酵母粉4.0、柠檬酸铵2.0、KH2PO42、乙酸钠5、MgSO4.7H2O0.2、MnSO40.05、吐温80 1ml、pH6.4，按照常规工艺制备得到乳酸发酵菌剂活化培养基；
b1)菌种活化：取质量体积百分比为1％的菌粉至预先配制的活化培养基中，于37℃温度条件下摇床培养16h，摇床转速150r/min。
本申请还公开了一种由上述的制备方法制备得到的基于复合菌分段发酵的川明参酵素。
与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：
1)本发明利用川明参为主要原料，将川明参通过清洗、预煮、简单破碎得到川明参泥；添加液化酶分解川明参淀粉，然后灭菌消除液化酶酶活；添加糖化酶和接种酵母菌同步糖化发酵；接入乳酸菌剂二次发酵控温发酵，得到一种以川明参功能性成分和微生物活性成分为特征的功能性保健酵素产品。通过对制得的酵素产品进行抗氧化活性检测(ABTS自由基清除能力、超氧化物自由基清除能力和DPPH自由基清除能力)和理化指标检测(粗多党、总糖、还原性糖、总活菌数)，证明该方法制得的饮料含有大量益生菌，具有一定的生物活性保健功能性。
当然，实施本申请的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1是本申请酵母发酵过程中各主要参数变化情况；
图2是本申请发酵过程中基于ABTS自由基清除能力、超氧化物自由基清除能力和DPPH自由基清除能力变化图。
具体实施方式
以下将配合附图及实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明提供一种基于复合菌分段发酵的川明参酵素的制备方法，包括以下步骤：
1)制备基于川明参的发酵醪液：
1.1)制备川明参泥：川明参原料清洗去除表面泥土后，按照一定比例加水预煮，破碎成泥，即得到川明参泥，其中，川明参原料与水的固液比(g/ml)为2:1-5:1；
1.2)将川明参泥与大豆粉或大豆蛋白粉按照质量比(g/g)为1:0.05-0.2混合(40目以上)，按照固液比(g/ml)1:0.2-1:1添加水，在发酵罐当中预煮5-10min保持温度90-95℃；随后降温至75-85℃按照40KNU/kg川明参泥添加液化酶(诺维信α-淀粉酶耐温SC型)，液化至碘反应为红棕色；115℃灭菌15min同时使液化酶失活，制备得到基于川明参的发酵醪液；
2)使用糖化酶和酵母菌对发酵醪液进行同步糖化发酵：
将预处理好的发酵醪液按照质量比(g/g)为1:50-1:25添加预活化好的酵母种子液(酵母种子液活菌数应大于107CFU/ml)；同时按0.4AUG/g添加糖化酶(诺维信Amylase AG300L)；在30-32℃发酵10-14h(接种量与发酵时间呈反比)，期间不断搅拌，搅拌转速为120-200r/min，保持发酵罐搅拌桨转速；
其中，预活化好的酵母种子液通过以下方法制备得到：制备酵母活化培养基(g/L)：称量葡萄糖5.0，酵母粉5.0，蛋白胨5.0，(NH4)2SO41.5，KH2PO4 1.5，MgSO4.7H2O 0.65，CaCl2 2.8，pH 6.0，于115℃条件下高压蒸汽灭菌15min，制备得到酵母活化培养基；取质量体积百分比为1％的菌粉至预先配制的活化培养基中，于30℃温度条件下摇床培养16h，摇床转速150r/min。
3)使用乳酸菌发酵菌剂对糖化发酵后的发酵醪液进行发酵：将培养发酵醪液加温至37℃，接入预活化好的乳酸菌发酵菌剂(活菌数应大于107CFU/ml)，在35-39℃继续发酵发酵12-16h，制备得到川明参酵素；其中，乳酸菌发酵菌剂是由肠系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides XF03)、胚牙乳杆菌(Lactobacillus plantarum XF02)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis XF04)和乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici XF02)按照菌落总数1:1：1:1混合而成。
其中，预活化好的乳酸菌具体通过以下方法制备得到：制备乳酸发酵菌剂活化培养基(g/L)：葡萄糖20.0、蛋白胨10、牛肉膏5.0、酵母粉4.0、柠檬酸铵2.0、KH2PO4 2.0、乙酸钠5.0、MgSO4.7H2O 0.2、Mn SO40.05、吐温80 1ml、pH6.4，按照常规工艺制备得到乳酸发酵菌剂活化培养基；取质量体积百分比为1％的菌粉至预先配制的活化培养基中，于37℃温度条件下摇床培养16h，摇床转速150r/min。
实施例1
一种基于复合菌分段发酵的川明参酵素的制备方法，包括以下步骤：将川明参原料清洗去除表面泥土后，按照一定比例加水预煮，破碎成泥，即得到川明参泥，其中，川明参原料与水的质量比(g/g)为1:1；按照质量比(g/g)为1:0.05混合，(40目以上)，按照固液比(g/ml)1:0.5添加水，在发酵罐当中预煮8min保持温度92℃；随后降温至80℃按照40KNU/kg川明参泥添加液化酶(诺维信α-淀粉酶耐温SC型)，液化至碘反应为红棕色；115℃灭菌15min同时使液化酶失活，制备得到基于川明参的发酵醪液；将预处理好的发酵醪液按照质量比(g/g)为1:40添加预活化好的酵母种子液(酵母种子液活菌数应大于107CFU/ml)；同时按0.4AUG/g添加糖化酶(诺维信Amylase AG300L)；在30℃发酵12h(接种量与发酵时间呈反比)，期间不断搅拌，搅拌转速为160r/min，保持发酵罐搅拌桨转速；将培养发酵醪液加温至37℃，接入预活化好的乳酸菌发酵菌剂(活菌数应大于107CFU/ml)，在37℃继续发酵发酵14h，制备得到川明参酵素；其中，乳酸菌发酵菌剂是由肠系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides XF03)、胚牙乳杆菌(Lactobacillus plantarum XF02)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis XF04)和乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici XF02)按照菌落总数1:1：1:1混合而成。
其中，预活化好的酵母种子液通过以下方法制备得到：制备酵母活化培养基(g/L)：称量葡萄糖5.0，酵母粉5.0，蛋白胨5.0，(NH4)2SO41.5，KH2PO4 1.5，MgSO4.7H2O 0.65，CaCl2 2.8，pH 6.0，于115℃条件下高压蒸汽灭菌15min，制备得到酵母活化培养基；取质量体积百分比为1％的菌粉至预先配制的活化培养基中，于30℃温度条件下摇床培养16h，摇床转速150r/min。预活化好的乳酸菌具体通过以下方法制备得到：制备乳酸发酵菌剂活化培养基(g/L)：葡萄糖20.0、蛋白胨10、牛肉膏5.0、酵母粉4.0、柠檬酸铵2.0、KH2PO4 2.0、乙酸钠5.0、MgSO4.7H2O 0.2、Mn SO40.05、吐温80 1ml、pH6.4，按照常规工艺制备得到乳酸发酵菌剂活化培养基；取质量体积百分比为1％的菌粉至预先配制的活化培养基中，于37℃温度条件下摇床培养16h，摇床转速150r/min。
实施例2
一种基于复合菌分段发酵的川明参酵素的制备方法，包括以下步骤：将川明参原料清洗去除表面泥土后，按照一定比例加水预煮，破碎成泥，即得到川明参泥，其中，川明参原料与水的质量比(g/g)为1:0.5；将川明参泥与大豆粉或大豆蛋白粉按照质量比(g/g)为1:0.2(40目以上)，按照固液比(g/ml)1:1添加水，在发酵罐当中预煮5min保持温度95℃；随后降温至75℃按照40KNU/kg川明参泥添加液化酶(诺维信α-淀粉酶耐温SC型)，液化至碘反应为红棕色；115℃灭菌15min同时使液化酶失活，制备得到基于川明参的发酵醪液；将预处理好的发酵醪液按照质量比(g/g)为1:50添加预活化好的酵母种子液(酵母种子液活菌数应大于107CFU/ml)；同时按0.4AUG/g添加糖化酶(诺维信Amylase AG300L)；在32℃发酵10h(接种量与发酵时间呈反比)，期间不断搅拌，搅拌转速为200r/min，保持发酵罐搅拌桨转速；将培养发酵醪液加温至37℃，接入预活化好的乳酸菌发酵菌剂(活菌数应大于107CFU/ml)，在35℃继续发酵发酵16h，制备得到川明参酵素；其中，乳酸菌发酵菌剂是由肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides XF03)、胚牙乳杆菌(Lactobacillusplantarum XF02)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis XF04)和乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici XF02)按照菌落总数1:1：1:1混合而成。
其中，预活化好的酵母种子液通过以下方法制备得到：制备酵母活化培养基(g/L)：称量葡萄糖5.0，酵母粉5.0，蛋白胨5.0，(NH4)2SO41.5，KH2PO4 1.5，MgSO4.7H2O 0.65，CaCl2 2.8，pH 6.0，于115℃条件下高压蒸汽灭菌15min，制备得到酵母活化培养基；取质量体积百分比为1％的菌粉至预先配制的活化培养基中，于30℃温度条件下摇床培养16h，摇床转速150r/min。预活化好的乳酸菌具体通过以下方法制备得到：制备乳酸发酵菌剂活化培养基(g/L)：葡萄糖20.0、蛋白胨10、牛肉膏5.0、酵母粉4.0、柠檬酸铵2.0、KH2PO4 2.0、乙酸钠5.0、MgSO4.7H2O 0.2、Mn SO40.05、吐温80 1ml、pH6.4，按照常规工艺制备得到乳酸发酵菌剂活化培养基；取质量体积百分比为1％的菌粉至预先配制的活化培养基中，于37℃温度条件下摇床培养16h，摇床转速150r/min。
实施例3
一种基于复合菌分段发酵的川明参酵素的制备方法，包括以下步骤：将川明参原料清洗去除表面泥土后，按照一定比例加水预煮，破碎成泥，即得到川明参泥，其中，川明参原料与水的质量比(g/g)为1:2；将川明参泥与大豆粉或大豆蛋白粉按照质量比(g/g)为1:0.01混合(40目以上)，按照固液比(g/ml)1:0.2添加水，在发酵罐当中预煮10min保持温度90℃；随后降温至85℃按照40KNU/kg川明参泥添加液化酶(诺维信α-淀粉酶耐温SC型)，液化至碘反应为红棕色；115℃灭菌15min同时使液化酶失活，制备得到基于川明参的发酵醪液；将预处理好的发酵醪液按照质量比(g/g)为1:25添加预活化好的酵母种子液(酵母种子液活菌数应大于107CFU/ml)；同时按0.4AUG/g添加糖化酶(诺维信Amylase AG300L)；在30℃发酵14h(接种量与发酵时间呈反比)，期间不断搅拌，搅拌转速为120r/min，保持发酵罐搅拌桨转速；将培养发酵醪液加温至37℃，接入预活化好的乳酸菌发酵菌剂(活菌数应大于107CFU/ml)，在39℃继续发酵发酵12h，制备得到川明参酵素；其中，乳酸菌发酵菌剂是由肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides XF03)、胚牙乳杆菌(Lactobacillus plantarum XF02)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis XF04)和乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici XF02)按照菌落总数1:1：1:1混合而成。
其中，预活化好的酵母种子液通过以下方法制备得到：制备酵母活化培养基(g/L)：称量葡萄糖5.0，酵母粉5.0，蛋白胨5.0，(NH4)2SO41.5，KH2PO4 1.5，MgSO4.7H2O 0.65，CaCl2 2.8，pH 6.0，于115℃条件下高压蒸汽灭菌15min，制备得到酵母活化培养基；取质量体积百分比为1％的菌粉至预先配制的活化培养基中，于30℃温度条件下摇床培养16h，摇床转速150r/min。预活化好的乳酸菌具体通过以下方法制备得到：制备乳酸发酵菌剂活化培养基(g/L)：葡萄糖20.0、蛋白胨10、牛肉膏5.0、酵母粉4.0、柠檬酸铵2.0、KH2PO4 2.0、乙酸钠5.0、MgSO4.7H2O 0.2、Mn SO40.05、吐温80 1ml、pH6.4，按照常规工艺制备得到乳酸发酵菌剂活化培养基；取质量体积百分比为1％的菌粉至预先配制的活化培养基中，于37℃温度条件下摇床培养16h，摇床转速150r/min。
对比例1
株式会社LINKS市售的酵素。
对比例2
市售台湾德丽斯康酵素。
下面结合具体的实验过程和结果来说明本发明的技术效果：
1材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1实验材料
发酵主料及辅料：川明参(成熟川明参清洗后直接烘干，无硫磺熏蒸，含水量低于15％)；辅料：乳酸发酵菌剂(泡乐美-I号，市售)、安琪果酒酵母(安琪葡萄酒果酒专用酵母RW)、焦亚硫酸钠、柠檬酸(均为食品级)。
待测样品分离：在2mL EP管取少量发酵醪液在2400×g冷冻离心机(4℃)中离心1min，再以孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤发酵液，-20℃保存备用。
1.1.2主要仪器
YJ-875型医用超净工作台、恒温摇床培养箱、台式干燥箱 重庆医疗设备厂；751GW紫外、可见分光光度计 惠普上海分析仪器有限公司；JA2003电子天平 上海天平仪器厂；LD5-2A离心机 北京医用离心机厂；酶标仪 美国Bio-Rad公司；气质联用系统 日本岛津公司GC20，配GC-Solution 7.0数据分析工作站。
1.2实验方法
1.2.1主要培养基的制作
安琪果酒酵母活化培养基(g/L)：葡萄糖5.0，酵母粉5.0，蛋白胨5.0，(NH4)2SO4 1.5，KH2PO4 1.5，MgSO4.7H2O 0.65，CaCl2 2.8，pH 6.0，115℃条件下高压蒸汽灭菌15min。
乳酸发酵菌剂活化培养基(MRS培养基，g/L)：葡萄糖20.0、蛋白胨10、牛肉膏5.0、酵母粉4.0、柠檬酸铵2.0、KH2PO42、乙酸钠5、MgSO4.7H2O0.2、MnSO40.05、吐温80 1ml、pH6.4。
菌种活化：取质量体积百分比为1％(w/v)菌粉至预先配制的活化培养基中，摇床培养16h(酵母菌30℃，乳酸菌37℃)，摇床转速150r/min。
1.2.2工艺流程
见实施例1
1.2.3发酵过程中还原糖、乙醇、生物量的测定
还原糖测定以无水葡萄糖为对照，采用略作改进的3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法。具体为：吸取0.25～1.5mL 0.2％标准葡萄糖溶液，置于25mL容量瓶中，再加入3，5-二硝基水杨酸溶液3mL，用蒸馏水补足至总体积5mL沸水浴中显色5min，然后以流动水迅速冷却，蒸馏水定容至刻度，摇匀。以蒸馏水2mL与3，5-二硝基水杨酸溶液3mL试剂同样操作为空白调零，在波长540nm处比色，得到吸光度值，参照葡萄糖标准曲线，求出还原糖的量。
乙醇测定采用气相色谱法，以正丙醇为内标，氢火焰离子化检测器，Agilent DB-WAX型柱(30m×0.32mm×0.25μm)。具体为：进样口温度220℃，检测器220℃，柱流速1.6mL/min；载气为40mL/min氢气，空气流速400mL/min；采用分流进样，分流比30:1，进样量1μL；程序升温条件：初始温度50℃，保持2min，以10℃/min升至100℃，再以20℃/min升至160℃，保持1min；单个样检测时间为10min。
生物量的测定：酵母发酵液经过过滤后，稀释20倍，利用分光度计分别测定OD600。
1.2.4抗氧化活性能力测定
为考察川明参发酵菌液的抗氧化能力，本发明分别考察了其ABTS自由基清除能力、超氧化物自由基清除能力和DPPH自由基清除能力的变化情况。ABTS测定，采用试剂盒法(方法见http://www.senbeijia.com/njsbjsw-Products-4874682/。购自南京森贝伽生物科技有限公司，货号SBJ-0186)。DPPH法根据文献方法略作改进测定，具体为：取1mL用甲醇稀释至一定浓度的样品，加入2mL的DPPH溶液(0.5mol/mL)，摇匀至暗处反应20min后，于波长517nm处测定吸光值，以清水作为对照，DPPH自由基清除率(％)＝(Acontrol-Asample)/Acontrol×100。超氧自由基采用试剂盒方法(购自碧云天生物科技公司，产品标号S0116，方法见http://www.beyotime.com/reactive-oxygen/s0116.html)。
2结果与分析
2.1不同接种量对酵母发酵的影响情况
由于酵母发酵阶段采用的是同步糖化发酵(SSF)，接种量将决定于酵母的生长繁殖速度，采用较大的接种量可以缩短发酵体系中微生物繁殖达到高峰的时间，使产物的形成速度加快，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大过大会引起溶氧不足，影响产物合成。同时，过大的接种量也有可能造成发酵高峰过早到来，与糖化步骤不相协调。而过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率，因此有必要确定其最佳的接种量。
本发明考察了初始总糖浓度260g/kg，发酵20h条件下，0.5％、1％、2％、4％、8％、12％(w/w)预活化好的酵母种子液接种量对川明参醪液发酵过程的影响，结果如表1所示。从表1可以看出，接种量的大小对发酵结果影响较大。当接种量为2％-8％时，各发酵参数相差不大，而与12％和0.5％接种量的发酵参数则差异明显。由于二次乳酸菌剂发酵需要留下一定数量的糖，如果酵母发酵阶段过强则会影响后续的乳酸发酵，对酵素生产造成不利影响。
川明参酵素产品的酵母发酵阶段，其目的不仅是要获得较多的优质酵母益生菌及其单细胞蛋白，同时也要获取足够多的酵母代谢途径中的一些关键酶。酿酒酵母(S.cerevissae)在对数生长期时的葡萄糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇酶、丙酮酸激酶等酶都显示了较高的表达量，而这些酶类都是包括糖酵解途径、磷酸戊糖途径、三羧酸循环途径的关键限制性酶类，因此选择酵母菌对数生长期就逐渐停止其作为主体发酵的地位，有利于酵素产品的生产。
从发酵调控角度来看，影响后续乳酸菌剂发酵的环境因素主要是较低的pH值，高酒精浓度和残糖浓度及组成，12.5％vol的酒精浓度就会造成乳酸菌的大量死亡，8-10％vol的乙醇浓度就会影响乳酸菌的生长。pH至低于3.2时，乳酸菌很难生长。综合以上因素并符合集约化生产原则，选择2％的接种量不仅使酵母菌处于对数生长阶段中期，残总糖、残还原糖浓度和发酵pH为45.91g/kg、33.49g/kg和3.47也不至于抑制后续乳酸发酵的快速启动和正常进行。
表1不同接种量对发酵的影响
2.2川明参酵素酵母发酵阶段随时间变化的情况
图1考察了初始总糖浓度260g/kg，接种量2％情况下，18h内不同发酵时间点川明参醪液发酵的变化过程。从图1中可以看出，川明参泥发酵状况较好，发酵12h之后残总糖、残还原糖、乙醇含量和生物量变化逐渐趋于缓慢。在12h内，残总糖和残还原糖从发酵初期的260g/kg和123.8g/kg快速下降至67.4g/kg和57.7g/kg，而乙醇浓度和生物量则增加到92.1g/kg和0.86(OD600)。
发酵液中的残还原糖浓度存在先升高后降低的情况，发酵第4h的糖浓度达到峰值的190.1g/kg，究其原因，是由于酵母增殖和代谢速度利用还原糖的速度低于SSF过程当中糖化酶新释放还原糖的速度。众所周知，酵素的生产是为了获得一定量的有益微生物及其代谢产物，残留的糖也将进一步丰富酵素的营养组成。因此，我们认为发酵12h不仅有利于提高生产效益也保障了酵素成分的营养组成更加合理。随着发酵时间的增加，发酵液中酵母菌个数不断增加，在18h之后增长缓慢，此时SOD活性为250.04U/g，因此将最佳发酵时间设定为18～24h。
本发明的酵母发酵阶段采用SSF发酵工艺，即是糖化和发酵同时在同一容器中进行，该发酵策略具有工艺简单、设备利用效率高、能耗低、发酵迅速、底物利用度高等众多优点。但是同步糖化发酵法存在糖化和发酵温度不协调等缺点，一般来说，糖化的最适温度高于50℃，而酵母发酵的理想温度约在30℃左右。在川明参酵素发酵生产过程中，还存在二次乳酸菌剂发酵过程，在实际生产过程中，可在发酵12h之后，就接种已活化完成的乳酸菌剂，然后逐渐升高发酵液温度，抑制乙醇发酵过程，为乳酸菌剂发酵创造条件。
本发明所提供的制备方法中，整体工艺适合工业化连续生产，节约生产设备；功能性有效成分大部分得以保留；DPPH、ABTs自由基清除能力和超氧自由基清除能力分别为38.39％、52.66％和90.14％，相比二段发酵开始阶段分别上升了57.42％、28.51％和11.76％。相比市售果蔬酵素和谷物酵素产品，本品在色泽、滋味和总活菌数上具有明显优势。在色泽方面呈白色偏黄，发酵菌液喷雾干燥后呈乳白色，市售产品多为黑褐色、绿色或灰色。香气方面呈现川明参特有的风味。总活菌数方面本品总活菌数可达1.6×109CFU/ml。
在22-30h的发酵周期内，总糖和还原糖从发酵初期的260g/kg和123.8g/kg快速下降至37.4g/kg和17.7g/kg，较低的糖浓度也有利于长期保存本产品。
从图2可以看出，在发酵52h内，DPPH自由基清除能力逐渐下降，能力从12h的28.95％下降至32h后的12.33％，在随后的16h又逐步上升至14.5％左右。超氧自由基清除能力的变化则较为显著，从发酵24h的最高值90.14，降至了发酵44h的最低值34.17％。DPPH自由基是一个以氮为中心的脂溶性的自由基，相对于其他方法，被广泛的运用于评价短时间内的抗氧化活性。DPPH自由基比羟基自由基和超氧自由基更稳定，这使得它更有利于运用于抗氧化性的评价。ABTs自由基清除能力则呈现随发酵时间延长稳定向上的趋势，从乳酸菌剂发酵初期的47.12％，上升至发酵52h的55.36％，但总体变化范围不及DPPH自由基清除能力和超氧自由基清除能力的变化剧烈。
ABTS法与DPPH法相似，均是基于分光光度测定反应体系的颜色改变来确定待测液的抗氧化活性。ABTS法和DPPH法测定柑橘、柠檬、白柚和橘子果汁的抗氧化能力变化结果基本一致。但是，从图2中可以看出，ABTS与DPPH法测定的抗氧化能力存在明显相反的变化。究其原因，ABTS法本质是一种间接方法，是反应发酵液清除ABTS+自由基的能力，与真实的氧化分解过程没有关系，ABTS+的氧化还原电势为0.68V，也就是说只要某化合物的氧化还原电势低于0.68V就能将ABTS+还原，出现颜色变化，进而出现ABTS自由基清除能力。川明参酵素发酵醪液是一个复杂体系，其中有大量物质的氧化还原电势均低于0.68V，均可将ABTS+还原，因此存在测量结果不稳定的情况。
在发明川明参酵素天然发酵过程中抗氧化能力变化的过程中DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力和ABTS自由基清除能力呈逐渐增加趋势，发酵前后分别提高了3.6％，5.7％和16.5％。在冬枣酵素发酵过程中随着生物量的增加，还原力、羟自由基清除率和SOD酶活力均不断升高。结合图2发明结果表明，应当适当控制发酵时间，乳酸菌剂发酵阶段的时间控制在12h即可，此时的DPPH、ABTs自由基清除能力和超氧自由基清除能力分别为38.39％、52.66％和90.14％，相比二段发酵开始阶段分别下降57.42％和上升28.51％、11.76％。
2.4川明参酵素发酵结果验证与感官评定分析
经过前期实验优化，川明参经过清洗、蒸煮、液化酶解、灭菌、同步糖化酵母发酵(12h)、乳酸菌剂发酵12h后，活菌数可达108-109CFU/ml，残还原糖浓度低于20g/kg，残总糖浓度大于35g/kg，不仅保留了一定的川明参多糖和微生物胞外多糖营养成分，也降低了微生物污染的风险。
由于酵素产品目前国内没有感官评定的相关标准可供执行，本发明依据“GB/T 29605感官分析食品感官质量控制导则”和“GB/T29604-2013感官分析建立感官特性参比样的一般导则”，参考“GB/T15038葡萄酒、果酒通用分析方法”、“GB/T 10789饮料通则”和“GB/T 29602固体饮料”统计了30人的感官评定结果。表2是本发酵产品经过喷雾干燥后与市售台湾某果蔬酵素产品A和日本谷物酵素产品B的感官分析与关键指标比较。
结果表明：本产品在色泽、滋味和总活菌数上具有明显优势。在色泽方面，由于川明参本身颜色呈白色偏黄，发酵菌液喷雾干燥后呈乳白色，而产品A呈现淡绿色，产品B呈灰色。但是香气方面不及产品A和B，本品呈现一定的中药味。总活菌数方面本品总活菌数可达1.6×109CFU/ml，相对于产品A和B具有明显优势。
表2发酵成品酵素的分析结果
3结论
本发明通过对川明参的两段发酵生产川明参酵素产品，得到优化有的发酵工艺为：总发酵时间为24h，其中初段酵母发酵时间为12h，酵母接种量的2％，此时的残总糖浓度为67.4g/kg，乙醇浓度为92.1g/kg，残还原糖浓度为57.7g/kg，生物量OD600为0.86；之后接种乳酸发酵菌剂，继续发酵10-14小时即可，发酵24h的DPPH、ABTs自由基清除能力和超氧自由基清除能力分别为18.39％、52.66％和90.14％，相比二段发酵开始阶段分别下降57.42％和上升28.51％11.76％。
对比例1和对比例2中的产品呈黑紫色，滋味酸涩微甜，总活菌数在108CFU/ml，相比对比例1和对比例2中的产品，本品在色泽、滋味和总活菌数上具有明显优势，可达1.6×109CFU/ml，呈现一定的中药味，本发明为进一步开发川明参精深加工产品提供了一条可行途径。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种基于复合菌分段发酵的川明参酵素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备基于川明参的发酵醪液；
2)使用糖化酶和酵母菌对发酵醪液进行同步糖化发酵；
3)使用乳酸菌发酵菌剂对糖化发酵后的发酵醪液进行发酵，制备得到川明参酵素。
2.根据权利要求1所述的基于复合菌分段发酵的川明参酵素的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的制备基于川明参的发酵醪液具体为：
1.1)制备川明参泥：川明参原料清洗去除表面泥土后，按照固液比(g/ml)2:1-5:1加水预煮，破碎成泥，即得到川明参泥；
1.2)将川明参泥与大豆粉或大豆蛋白粉按照质量比(g/g)为1:0.05-1:0.2混合，按照固液比(g/ml)1:0.2-1添加水，在发酵罐当中预煮5-10min保持温度90-95℃；随后降温至75-85℃按照40KNU/kg川明参泥添加液化酶，液化至碘反应为红棕色；115℃灭菌15min同时使液化酶失活，制备得到基于川明参的发酵醪液。
3.根据权利要求2所述的基于复合菌分段发酵的川明参酵素的制备方法，其特征在于，所述大豆粉或大豆蛋白粉的目数为40目以上。
4.根据权利要求1所述的基于复合菌分段发酵的川明参酵素的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中使用酵母菌对发酵醪液进行同步糖化发酵具体为：将预处理好的发酵醪液按照质量比(g/g)为1:50-1:25添加预活化好的酵母种子液；同时按0.4AUG/g添加糖化酶；在30-32℃发酵10-14h，期间不断搅拌，搅拌转速为120-200r/min，保持发酵罐搅拌桨转速。
5.根据权利要求4所述的基于复合菌分段发酵的川明参酵素的制备方法，其特征在于，所述酵母种子液的活菌数大于107CFU/ml。
6.根据权利要求4所述的基于复合菌分段发酵的川明参酵素的制备方法，其特征在于，所述预活化好的酵母种子液通过以下方法制备得到：
a)制备酵母活化培养基(g/L)：称量葡萄糖5.0，酵母粉5.0，蛋白胨5.0，(NH4)2SO4 1.5，KH2PO4 1.5，MgSO4.7H2O 0.65，CaCl2 2.8，pH 6.0，于115℃条件下高压蒸汽灭菌15min，制备得到酵母活化培养基；
b)菌种活化：取质量体积百分比为1％的菌粉至预先配制的活化培养基中，于30℃温度条件下摇床培养16h，摇床转速150r/min。
7.根据权利要求1所述的基于复合菌分段发酵的川明参酵素的制备方法，其特征在于，所述步骤3)使用乳酸菌发酵菌剂对糖化发酵后的发酵醪液进行发酵，制备得到川明参酵素具体为：将乳酸菌发酵菌剂培养好的发酵醪液加温至37℃，接入预活化好的乳酸菌发酵菌剂，在35-39℃继续发酵发酵12-16h，制备得到川明参酵素；其中，乳酸菌发酵菌剂是由肠系膜明串珠菌、胚牙乳杆菌、短乳杆菌和乳酸片球菌按照菌落总数1:1:1:1混合而成。
8.根据权利要求7所述的基于复合菌分段发酵的川明参酵素的制备方法，其特征在于，所述预活化好的乳酸菌发酵菌剂的活菌数大于107CFU/ml。
9.根据权利要求7所述的基于复合菌分段发酵的川明参酵素的制备方法，其特征在于，所述预活化好的乳酸菌具体通过以下方法制备得到：
a1)制备乳酸发酵菌剂活化培养基(g/L)：葡萄糖20.0、蛋白胨10、牛肉膏5.0、酵母粉4.0、柠檬酸铵2.0、KH2PO4 2.0、乙酸钠5.0、MgSO4.7H2O 0.2、Mn SO40.05、吐温80 1ml、pH6.4，按照常规工艺制备得到乳酸发酵菌剂活化培养基；
b1)菌种活化：取质量体积百分比为1％的菌粉至预先配制的活化培养基中，于37℃温度条件下摇床培养16h，摇床转速150r/min。
10.一种由权利要求1至9中任一权利要求所述的制备方法制备得到的基于复合菌分段发酵的川明参酵素。
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