CN105823841B - 一种烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚的检测方法，采用溶剂萃取、固相萃取净化，再采用多模式进样口与毛细色谱柱预柱配合进样，气相色谱‑三重四极杆质谱联用法测定，从而对烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚进行定性定量检测。本发明提供的一种烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚的检测方法，与现有技术相比，具备定性准确、抗干扰能力强及灵敏度高等特点，能够进一步降低色谱系统污染，减少分析结果干扰，具有较好的准确性和精密度。

Description

一种烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚的检测方法
技术领域
本发明属于卷烟质量安全领域，涉及一种烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚的检测方法，具体涉及一种使用气相色谱-三重四极杆质谱(GC-MS/MS)检测烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚的方法。
背景技术
烟草及烟草制品霉变会对产品质量产生重大影响，建立准确、灵敏、易实现的化学分析方法用于卷烟中霉变的检测非常必要。在不当的储存环境中，烟草及烟草制品会发生霉变，由于霉菌(如曲霉、毛霉、根霉、青霉)作用，会形成具有强烈霉味的物质——氯代茴香醚。研究表明，在各种氯代茴香醚的同分异构体中，对霉味起决定性作用的主要有2,4,6-三氯代茴香醚(2,4,6-TCA)、2,3,4,6-四氯代茴香醚(TeCA)等。
国内外对氯代茴香醚的分析研究主要集中在对葡萄酒和软木塞中2,4,6-三氯代茴香醚(TCA)的检测，对于烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚的检测鲜有报道。目前，利用顶空固相微萃取-气相色谱法(HS-SPME-GC-ECD)进行检测的研究较多，但是这种方法的缺点在于，虽然电子捕获检测器(ECD)灵敏度较高，但无法准确定性，受样品基质影响较大，氯代茴香醚色谱峰和复杂基质物质峰无法达到有效的分离，检测结果容易假阳性。同时采用顶空固相微萃取(HS-SPME)前处理手段灵敏度受到一定限制。除此之外，还有采用溶剂萃取净化后，利用气相色谱质谱法(GC-MS)对氯代茴香醚类物质进行定性和定量分析检测，虽然质谱(MS)的定性能力较强，可以避免假阳性的干扰，但由于氯代茴香醚的阈值要低于0.1ng/g，质谱(MS)的灵敏度远远达不到要求。
综上所述，对于氯代茴香醚的检测，难点主要有二点：一、基质对氯代茴香醚的检测干扰较大；二、检测需要的灵敏度较高。而烟草基质的化学组分与葡萄酒和软木塞基质相比更为复杂，以致目前尚无针对烟草及烟草制品中氯代茴香醚的成熟检测方法。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚的检测方法，该检测方法准确、可靠、灵敏度较高，能够实现烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚的准确定量及定性测定。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚的检测方法，采用溶剂萃取、固相萃取净化，再采用多模式进样口与毛细色谱柱预柱配合进样，气相色谱-三重四极杆质谱联用法(GC-QQQ-MS/MS)测定，从而对烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚进行定性定量检测。
较佳地，所述烟草选自烤烟、白肋烟、晾晒烟、香料烟等烟草原料中的一种。
优选地，所述烟草原料选自烟叶或烟丝的一种或两种混合。
较佳地，所述烟草制品为烟叶原料制成的卷烟成品。具体来说，所述烟草制品为中华牌卷烟、双喜牌卷烟等。
较佳地，所述烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚共4种，包括有2,4-二氯代茴香醚(2,4-DCA)、2,6-二氯代茴香醚(2,6-DCA)、2,4,6-三氯代茴香醚(2,4,6-TCA)、2,3,4,6-四氯代茴香醚(TeCA)。
较佳地，所述多模式进样口为安捷伦(Agilent)公司制造的气相色谱仪(GC)上的MMI进样口。所述多模式进样口能够以一个进样口实现通常需要两个或更多进样口的功能，可采用大体积进样功能提高分析的灵敏度，同时仍然能够实现通常采用分流/不分流进样口进行的标准进样功能。
较佳地，所述毛细色谱柱预柱为去活性无固定相石英毛细管色谱柱。
较佳地，所述一种烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚的检测方法，具体包括以下步骤：
1)标准溶液的配制：配制内标溶液和混合标准溶液；
A)分别称取2,4-DCA、2,6-DCA、2,4,6-TCA、TeCA的标准品，加入正己烷定容，配成混合标准储备溶液；
B)称取氘代2,4,6-三氯茴香醚(2,4,6-TCA，d5)，加入正己烷定容，配成内标溶液；
优选地，所述内标溶液中氘代2,4,6-三氯茴香醚的浓度为1-100ng/mL。更优选地，所述内标溶液中氘代2,4,6-三氯茴香醚的浓度为10ng/mL。
所述氘代2,4,6-三氯茴香醚(2,4,6-TCA，d5)为商品化试剂，其化学性质稳定，适于作为内标。
C)分别移取不同体积的步骤A中混合标准储备溶液，再分别加入一定体积的步骤B中内标溶液，用正己烷定容配制为一系列不同浓度的混合标准溶液。
优选地，所述混合标准溶液中多种氯代茴香醚的含量分别为0.05-100ng。
2)样品前处理：称取烟草或烟草制品样品，进行溶剂萃取后，离心，取上清液，进行固
相萃取净化，收集净化后的溶液进行浓缩后，待测；
优选地，所述烟草或烟草制品样品需要研磨成粉末。所述烟草或烟草制品样品的用量为1-2g。
优选地，所述溶剂萃取是将烟草或烟草制品样品，加入水振荡混匀后，再加入正己烷和步骤1)所述内标溶液，进行涡旋震荡。
更优选地，所述烟草或烟草制品样品的质量与水加入的体积之比为1-2：5-10(g/ml)。进一步优选地，所述烟草或烟草制品样品的质量与水加入的体积之比为2：10(g/ml)。、
更优选地，所述加入水振荡混匀为常规手动振荡混匀方式。
更优选地，所述烟草或烟草制品样品的质量与正己烷、内标溶液加入的体积之比为1-2：5-10：0.05-0.1(g/ml/ml)。进一步优选地，所述烟草或烟草制品样品的质量与正己烷、内标溶液加入的体积之比为2：10：0.1(g/ml/ml)。
更优选地，所述涡旋震荡的条件为：震荡频率：2000-3000r/min；震荡时间：5-15min。进一步优选地，所述涡旋震荡的条件为：震荡频率：2500r/min；震荡时间：10min。
优选地，所述离心条件为：离心频率：1000-6000r/min；离心时间：2-6min。更优选地，所述离心条件为：离心频率：2000-5000r/min；离心时间：3-5min。
优选地，所述固相萃取净化是将上清液过固相萃取柱，再用有机溶剂过固相萃取柱进行洗脱，收集过固相萃取柱后的溶液。
更优选地，所述固相萃取柱要使用正己烷进行活化。进一步优选地，所述正己烷用量为5mL。
更优选地，所述有机溶剂为正己烷与乙酸乙酯的混合溶液。进一步优选地，所述正己烷与乙酸乙酯的体积之比为100：1(v/v)。
优选地，所述浓缩为旋蒸浓缩。更优选地，所述旋蒸浓缩条件为：频率：200-400r/min；时间：5-15min；真空度：195-241kPa。
优选地，所述浓缩后的体积为0.1-1mL。更优选地，所述浓缩后的体积为0.5mL。
3)样品定性检测：分别将步骤1)配制的混合标准溶液和步骤2)中待测液采用多模式进样口与毛细色谱柱预柱配合进样，再进行GC-QQQ-MS/MS检测，根据内标法比较保留时间进行定性，确定待测液中多种氯代茴香醚成分；
所述内标法(标准加入法)定性的原理为：通过标准样品中各组分和内标的保留时间和实际样品中各组分和内标的保留时间对比分析是否一致，从而确认实际样品中各组分成分。
4)样品定量检测：分别将步骤1)配制的混合标准溶液和步骤2)中待测液采用多模式进样口与毛细色谱柱预柱配合进样，再进行GC-QQQ-MS/MS检测，采用内标标准曲线法进行定量，获得待测液中多种氯代茴香醚成分的含量；
优选地，所述内标标准曲线法包括以下步骤：
所述内标标准曲线法是指在标准溶液中加入内标物质，进行仪器测定，获得标准工作曲线，进而测定含有内标物质的待测液中样品含量的方法。
ⅰ、将步骤1)的C中一系列不同浓度的混合标准溶液分别进行GC-QQQ-MS/MS检测，分别获得4种氯代茴香醚成分/内标物的二级选择离子峰面积比与4种氯代茴香醚成分/相应内标物的质量浓度比的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，分别计算得到4种氯代茴香醚成分标准工作曲线的回归方程。
进一步的，所述标准曲线中，以4种氯代茴香醚成分与相应内标物的二级选择离子峰面积比为纵坐标(Y轴)，其4种氯代茴香醚成分与相应内标物的质量浓度比为横坐标(X轴)。
ⅱ、将步骤2)中待测液，进行GC-QQQ-MS/MS检测，将获得的待测液中4种氯代茴香醚成分/相应内标物的二级选择离子峰面积比，代入步骤ⅰ中相应的4种氯代茴香醚成分标准工作曲线的回归方程，并根据加入相应内标物的已知质量浓度，计算得到待测液中4种氯代茴香醚成分的质量。
优选地，所述步骤3)或4)中多模式进样口与毛细色谱柱预柱配合进样条件为：
进样口：多模式进样口(MMI进样口)；色谱进样口温度：初始70-80℃，保持0.05-0.2min，500-700℃/min速率升至180-200℃；进样量：20-30μl；进样方式：冷不分流进样；载气：高纯氦气，载气纯度≥99.999％；载气流速：初始流速1.1-1.3mL/min，保持0.05-0.15min，再以90-110mL/min速率升至1.9-2.1mL/min，保持3.8-3.9min，最后以90-110mL/min速率降至1.1-1.3mL/min；色谱柱预柱：去活性无固定相石英毛细管色谱柱(5m×0.32mm×0.25μm)。
更优选地，所述多模式进样口与毛细色谱柱预柱配合进样条件为：
进样口：多模式进样口(MMI进样口)；色谱进样口温度：初始75℃，保持0.1min，600℃/min速率升至190℃；进样量：25μl；进样方式：冷不分流进样；载气：高纯氦气，载气纯度≥99.999％；载气流速：初始流速1.2mL/min，保持0.1min，再以100mL/min速率升至2mL/min，保持3.892min，最后以100mL/min速率降至1.2mL/min；色谱柱预柱：去活性无固定相石英毛细管色谱柱(5m×0.32mm×0.25μm)。
优选地，所述步骤3)或4)中GC-QQQ-MS/MS检测条件为：
气相色谱条件为：色谱柱1：DB-35MS UI石英毛细管色谱柱(10m×0.25mm×0.25μm)；色谱柱2：DB-35MS UI石英毛细管色谱柱(20m×0.25mm×0.25μm)：升温程序：初始温度60-80℃保持3-5min，以25-35℃/min的速率升至120-140℃，再以4-6℃/min的速率升至190-210℃，保持0.5-1.5min；反吹系统条件为：在升温程序后开始进行反吹；反吹运行时间：7-9min；反吹运行压力：19-21psi；反吹运行温度：290-310℃。
所述反吹系统在升温程序完成后立即开始，与升温程序保持连续。
质谱条件为：传输线温度：220-240℃；电离方式：电子轰击电离(EI)；离子源温度：220-240℃；四级杆温度：140-160℃；Q2碰撞气：高纯氮气(N2)；溶剂延迟时间：6-8min；扫描方式：多反应监测(MRM)。
更优选地，所述GC-QQQ-MS/MS检测条件为：
气相色谱条件为：色谱柱1：DB-35MS UI石英毛细管色谱柱(10m×0.25mm×0.25μm)；色谱柱2：DB-35MS UI石英毛细管色谱柱(20m×0.25mm×0.25μm)：升温程序：初始温度70℃保持4min，以30℃/min的速率升至130℃，再以5℃/min的速率升至200℃，保持1min；反吹系统条件为：在升温程序后开始进行反吹；反吹运行时间：8min；反吹运行压力：20psi；反吹运行温度：300℃。
质谱条件为：传输线温度：230℃；电离方式：电子轰击电离(EI)；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；Q2碰撞气：高纯氮气(N2)；溶剂延迟时间：7min；扫描方式：多反应监测(MRM)。
5)实际样品含量的测定：将步骤4)获得的待测液中多种氯代茴香醚成分的含量分别代入计算公式，计算得到实际烟草或烟草制品样品中多种氯代茴香醚成分的含量。
优选地，所述计算公式为X＝m/[m0×(1-w)]，其中，X为实际烟草或烟草制品样品中各组分的含量，单位为ng/g；m为通过内标标准曲线法得到的待测液中多种氯代茴香醚成分的含量，单位为ng；m0为称取的实际烟草或烟草制品样品的质量，单位为g；w为样品含水率，单位为％。所述含水率通过行业标准YC/T31-1996《烟草及烟草制品试样的制备和水分测定烘箱法》测定获得。
如上所述，本发明的一种烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚的检测方法，通过将烟草或烟草制品样品进行溶剂萃取、离心、固相萃取净化、浓缩后，采用多模式进样口(MMI进样口)与经去活性无固定相毛细色谱柱预柱配合的的大体积进样方式，再采用气相色谱-三重四极杆质谱联用法对烟草或烟草制品样品中的4种氯代茴香醚进行定性定量检测。
本方法与现有技术相比，通过大体积进样提高检测灵敏度，同时，由于采用的三重四级杆质谱(MS/MS)具备定性准确、抗干扰能力强及灵敏度高等特点，特别适用于分析背景干扰严重、定性困难、被测化合物含量低的样品。此外，引入气相色谱反吹系统，在目标组分准确分离检测后，控制载气流向变化，将保留较强的高沸点杂质吹出前段色谱柱外，进一步降低色谱系统污染，减少分析结果干扰。本方法的标准工作曲线的相关系数r＝0.9988～0.9998，方法检出限(LOD)为0.0029-0.0061ng/g，定量检出限(LOQ)为0.010-0.020ng/g，具有较高的灵敏度。方法的回收率为95～111％，平均相对标准偏差(RSD％)小于6％，具有较好的准确性和精密度。
附图说明
图1显示为含有内标溶液的4种氯代茴香醚的混合标准溶液在GC-MS/MS上的总离子色谱图。
图2显示为烟末中多种氯代茴香醚的GC-MS/MS检测MRM图2a、2b、2c、2d，其中，2a为2,4-二氯代茴香醚(2,4-DCA)、2,6-二氯代茴香醚(2,6-DCA)的MRM图；2b为2,4,6-三氯代茴香醚(2,4,6-TCA)的MRM图；2c为2,3,4,6-四氯代茴香醚(TeCA)的MRM图；2d为内标物质氘代2,4,6-三氯茴香醚(2,4,6-TCA，d5)的MRM图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指相对压力。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
以下实施例使用的试剂与仪器如下：
1、试剂
烟草及烟草制品(选自上海烟草集团)；2,4-二氯代茴香醚、2,6-二氯代茴香醚、2,4,6-三氯代茴香醚、2,3,4,6-四氯代茴香醚(纯品，纯度＞99.99％，德国DR公司)；氘代2,4,6-三氯茴香醚(纯品，纯度＞99.99％，德国DR公司)；正己烷、乙酸乙酯(色谱纯，TEDIA公司)；水(纯水机自制纯水)。
2、仪器
7890A型气相色谱-7000B型三重四极杆质谱联用仪(美国Agilent科技有限公司)；涡旋震荡仪(CAT NO：945066、SN：140919007，Talboys公司)；RJ-LDL-50G型离心机(无锡市瑞江分析仪器有限公司)；Mega BE-FI型固相萃取柱(美国Agilent科技有限公司)；Q-101型旋转蒸发仪(BUCHI公司)；色谱柱：DB-35MS(UI)石英毛细管色谱柱(美国Agilent科技有限公司)；色谱柱：去活性无固定相石英毛细管色谱柱预柱(美国Agilent科技有限公司)。
实施例1
1、标准溶液的配制
分别称取2,4-二氯代茴香醚(2,4-DCA)、2,6-二氯代茴香醚(2,6-DCA)、2,4,6-三氯代茴香醚(2,4,6-TCA)、2,3,4,6-四氯代茴香醚(TeCA)的标准品，加入正己烷定容，配成混合标准储备溶液。
同时，称取氘代2,4,6-三氯茴香醚(2,4,6-TCA，d5)，加入正己烷定容，配成内标溶液，内标溶液中氘代2,4,6-三氯茴香醚的浓度为1-100ng/mL。
然后，分别移取不同体积的混合标准储备溶液，再分别加入一定体积的内标溶液，用正己烷定容配制为一系列不同浓度的混合标准溶液。混合标准溶液中多种氯代茴香醚的含量分别为0.05-100ng。
2、样品前处理
准确称取研磨成粉末的烟草或烟草制品样品1-2g，加入5-10ml纯水振荡混匀后，再加入5-10ml正己烷和0.05-0.1ml内标溶液，进行涡旋震荡后，离心。涡旋震荡的条件为：震荡频率：2000-3000r/min；震荡时间：5-15min。离心条件为：离心频率：1000-6000r/min；离心时间：2-6min。然后，取上清液过固相萃取柱，再用正己烷与乙酸乙酯(v/v为100：1)的混合溶液过固相萃取柱进行洗脱，收集过固相萃取柱后的溶液。收集净化后的溶液进行旋蒸浓缩后，待测。浓缩后的体积为0.1-1mL。固相萃取柱使用前需要使用正己烷进行活化，正己烷用量为5mL。
3、样品含量计算
分别将步骤1中配制的混合标准溶液和步骤2中待测液采用多模式进样口与毛细色谱柱预柱配合进样，再进行GC-QQQ-MS/MS检测，根据内标法比较保留时间进行定性，确定待测液中4种氯代茴香醚成分，同时，采用内标标准曲线法进行定量，获得待测液中4种氯代茴香醚成分的含量。
具体来说，内标标准曲线法是先将上述步骤1中一系列不同浓度的混合标准溶液分别进行GC-QQQ-MS/MS检测，别获得4种氯代茴香醚成分/相应内标物的二级选择离子峰面积比与4种氯代茴香醚成分/相应内标物的质量浓度比的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，以4种氯代茴香醚成分与相应内标物的二级选择离子峰面积比为纵坐标(Y轴)，其4种氯代茴香醚成分与相应内标物的质量浓度比为横坐标(X轴)，分别计算得到4种氯代茴香醚成分标准工作曲线的回归方程。
再将上述步骤2中待测液进行GC-QQQ-MS/MS检测，将获得的待测液中4种氯代茴香醚成分/相应内标物的二级选择离子峰面积比，代入相应的4种氯代茴香醚成分标准工作曲线的回归方程，并根据加入相应内标物的已知质量浓度，计算得到待测液中4种氯代茴香醚成分的质量。
其中，多模式进样口与毛细色谱柱预柱配合进样条件为：进样口：多模式进样口(MMI进样口)；色谱进样口温度：初始70-80℃，保持0.05-0.2min，500-700℃/min速率升至180-200℃；进样量：20-30μl；进样方式：冷不分流进样；载气：高纯氦气，载气纯度≥99.999％；载气流速：初始流速1.1-1.3mL/min，保持0.05-0.15min，再以90-110mL/min速率升至1.9-2.1mL/min，保持3.8-3.9min，最后以90-110mL/min速率降至1.1-1.3mL/min；色谱柱预柱：去活性无固定相石英毛细管色谱柱(5m×0.32mm×0.25μm)。
GC-QQQ-MS/MS检测条件为：
气相色谱条件为：色谱柱1：DB-35MS UI石英毛细管色谱柱(10m×0.25mm×0.25μm)；色谱柱2：DB-35MS UI石英毛细管色谱柱(20m×0.25mm×0.25μm)：升温程序：初始温度60-80℃保持3-5min，以25-35℃/min的速率升至120-140℃，再以4-6℃/min的速率升至190-210℃，保持0.5-1.5min；反吹系统条件为：在升温程序后开始进行反吹；反吹运行时间：7-9min；反吹运行压力：19-21psi；反吹运行温度：290-310℃。
质谱条件为：传输线温度：220-240℃；电离方式：电子轰击电离(EI)；离子源温度：220-240℃；四级杆温度：140-160℃；Q2碰撞气：高纯氮气(N2)；溶剂延迟时间：6-8min；扫描方式：多反应监测(MRM)。另外，目标物及内标物的质谱分析参数见表1。
表1目标物及内标物的MRM参数
然后，将获得的待测液中多种氯代茴香醚成分的含量分别代入计算公式，计算得到实际烟草或烟草制品样品中多种氯代茴香醚成分的含量。所述计算公式为X＝m/[m0×(1-w)]，其中，X为实际烟草或烟草制品样品中各组分的含量，单位为ng/g；m为通过内标标准曲线法得到的待测液中多种氯代茴香醚成分的含量，单位为ng；m0为称取的实际烟草或烟草制品样品的质量，单位为g；w为样品含水率，单位为％。
实施例2
1、标准溶液的配制
分别称取2,4-二氯代茴香醚(2,4-DCA)、2,6-二氯代茴香醚(2,6-DCA)、2,4,6-三氯代茴香醚(2,4,6-TCA)、2,3,4,6-四氯代茴香醚(TeCA)的标准品，加入正己烷定容，配成混合标准储备溶液。
同时，称取氘代2,4,6-三氯茴香醚(2,4,6-TCA，d5)，加入正己烷定容，配成内标溶液，内标溶液中氘代2,4,6-三氯茴香醚的浓度为10ng/mL。
然后，分别移取不同体积的混合标准储备溶液，再分别加入一定体积的内标溶液，用正己烷定容配制为一系列不同浓度的混合标准溶液。混合标准溶液一共8级，其中4种氯代茴香醚的含量分别为：0.05ng、0.1ng、0.5ng、1.00ng、5.00ng、10.00ng、50.00ng、100.00ng，即配即用。
2、样品前处理
准确称取研磨成粉末的烟草或烟草制品样品2g，置于50mL离心管中，加入10ml纯水振荡混匀后，再加入10ml正己烷和0.1ml内标溶液，进行涡旋震荡后，离心。涡旋震荡的条件为：震荡频率：2500r/min；震荡时间：10min。离心条件为：离心频率：2000r/min；离心时间：5min。然后，取上清液过固相萃取柱，再用6mL正己烷与乙酸乙酯(v/v为100：1)的混合溶液过固相萃取柱进行洗脱，收集过固相萃取柱后的溶液。收集净化后的溶液进行旋蒸浓缩后，待测。浓缩后的体积为0.5mL。固相萃取柱使用前需要使用正己烷进行活化，正己烷用量为5mL。
3、样品含量计算
分别将步骤1中配制的混合标准溶液和步骤2中待测液采用多模式进样口与毛细色谱柱预柱配合进样，再进行GC-QQQ-MS/MS检测，根据内标法比较保留时间进行定性，确定待测液中4种氯代茴香醚成分，同时，采用内标标准曲线法进行定量，获得待测液中4种氯代茴香醚成分的含量，具体数据见图1-2。
具体来说，内标标准曲线法是先将上述步骤1中一系列不同浓度的混合标准溶液分别进行GC-QQQ-MS/MS检测，别获得4种氯代茴香醚成分/相应内标物的二级选择离子峰面积比与4种氯代茴香醚成分/相应内标物的质量浓度比的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，以4种氯代茴香醚成分与相应内标物的二级选择离子峰面积比为纵坐标(Y轴)，其4种氯代茴香醚成分与相应内标物的质量浓度比为横坐标(X轴)，分别计算得到4种氯代茴香醚成分标准工作曲线的回归方程。再将上述步骤2中待测液进行GC-QQQ-MS/MS检测，将获得的待测液中4种氯代茴香醚成分/相应内标物的二级选择离子峰面积比，代入相应的4种氯代茴香醚成分标准工作曲线的回归方程，并根据加入相应内标物的已知质量浓度，计算得到待测液中4种氯代茴香醚成分的质量。
其中，所述多模式进样口与毛细色谱柱预柱配合进样条件为：进样口：多模式进样口(MMI进样口)；色谱进样口温度：初始75℃，保持0.1min，600℃/min速率升至190℃；进样量：25μl；进样方式：冷不分流进样；载气：高纯氦气，载气纯度≥99.999％；载气流速：初始流速1.2mL/min，保持0.1min，再以100mL/min速率升至2mL/min，保持3.892min，最后以100mL/min速率降至1.2mL/min；色谱柱预柱：去活性无固定相石英毛细管色谱柱(5m×0.32mm×0.25μm)。
GC-QQQ-MS/MS检测条件为：
气相色谱条件为：色谱柱1：DB-35MS UI石英毛细管色谱柱(10m×0.25mm×0.25μm)；色谱柱2：DB-35MS UI石英毛细管色谱柱(20m×0.25mm×0.25μm)：升温程序：初始温度70℃保持4min，以30℃/min的速率升至130℃，再以5℃/min的速率升至200℃，保持1min；反吹系统条件为：在升温程序后开始进行反吹；反吹运行时间：8min；反吹运行压力：20psi；反吹运行温度：300℃。
质谱条件为：传输线温度：230℃；电离方式：电子轰击电离(EI)；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；Q2碰撞气：高纯氮气(N2)；溶剂延迟时间：7min；扫描方式：多反应监测(MRM)。另外，目标物及内标物的质谱分析参数见表1。
然后，将获得的待测液中4种氯代茴香醚成分的含量分别代入计算公式，计算得到实际烟草或烟草制品样品中多种氯代茴香醚成分的含量。所述计算公式为X＝m/[m0×(1-w)]，其中，X为实际烟草或烟草制品样品中各组分的含量，单位为ng/g；m为通过内标标准曲线法得到的待测液中多种氯代茴香醚成分的含量，单位为ng；m0为称取的实际烟草或烟草制品样品的质量，单位为g；w为样品含水率，单位为％。
实施例3
如实施例2中步骤1所示，分别移取不同体积的混合标准储备溶液，再分别加入一定体积的浓度为10ng/ml的内标溶液，用正己烷定容配制为一系列不同浓度的混合标准溶液。混合标准溶液一共8级，其中4种氯代茴香醚的含量分别为：0.05ng、0.1ng、0.5ng、1.00ng、5.00ng、10.00ng、50.00ng、100.00ng。
将上述配制好的一系列不同浓度的混合标准溶液分别采用多模式进样口与毛细色谱柱预柱配合进样，再进行GC-QQQ-MS/MS检测，以4种氯代茴香醚成分与相应内标物的二级选择离子峰面积比为纵坐标(Y轴)，其4种氯代茴香醚成分与相应内标物的质量浓度比为横坐标(X轴)，进行回归分析，得到回归方程及其相关系数，如表2所示。
由表2可知，回归方程的线性关系良好，相关系数r＝0.9988～0.9998。对混合标准溶液中的目标物响应信号，采用最低浓度标样重复进样10次，进行GC-QQQ-MS/MS分析，以3倍信噪比为方法的检出限(LOD)，10倍信噪比为定量限(LOQ)，换算为样品含量后得出目标物的方法检出限为0.0029-0.0061ng/g，定量限为0.010-0.020ng/g，具有较高的灵敏度。
表2工作曲线和检出限
Y：离子峰面积比；X：浓度比
实施例4
选取烟草或烟草制品粉末样品，称取1g样品，加入已知浓度的混合标准溶液，然后进行如实施例2的步骤2中的前处理，并采用多模式进样口与毛细色谱柱预柱配合进样，再进行GC-QQQ-MS/MS分析，按照加标量(低浓度0.1ng、中浓度1ng、高浓度10ng)和测定值计算其回收率，结果见表3。同时对同一待测样品溶液平行测定5次(n＝5)，得到4种氯代茴香醚成分的精密度测定数据，结果见表4。
表3 4种氯代茴香醚成分的回收率
表4 5种氯代茴香醚成分的的精密度(n＝5)
由表3-4可以看出，目标物的回收率在95～111％之间，相对标准偏差(RSD)小于6％，说明本发明方法的回收率高、准确性和重复性好，可以满足定量需要。
所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (8)

1.一种烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚的检测方法，采用溶剂萃取、固相萃取净化，再采用多模式进样口与毛细色谱柱预柱配合进样，气相色谱-三重四极杆质谱联用法测定，从而对烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚进行定性定量检测；
所述烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚共4种，包括有2,4-DCA、2,6-DCA、2,4,6-TCA、TeCA；
具体包括以下步骤：
1)标准溶液的配制：配制内标溶液和混合标准溶液；
2)样品前处理：称取烟草或烟草制品样品，进行溶剂萃取后，离心，取上清液，进行固相萃取净化，收集净化后的溶液进行浓缩后，待测；
3)样品定性检测：分别将步骤1)配制的混合标准溶液和步骤2)中待测液采用多模式进样口与毛细色谱柱预柱配合进样，再进行GC-QQQ-MS/MS检测，根据内标法比较保留时间进行定性，确定待测液中多种氯代茴香醚成分；
4)样品定量检测：分别将步骤1)配制的混合标准溶液和步骤2)中待测液采用多模式进样口与毛细色谱柱预柱配合进样，再进行GC-QQQ-MS/MS检测，采用内标标准曲线法进行定量，获得待测液中多种氯代茴香醚成分的含量；
5)实际样品含量的测定：将步骤4)获得的待测液中多种氯代茴香醚成分的含量分别代入计算公式，计算得到实际烟草或烟草制品样品中多种氯代茴香醚成分的含量；
步骤3)或4)中，所述GC-QQQ-MS/MS检测条件为：
气相色谱条件为：色谱柱1：DB-35MS UI石英毛细管色谱柱；色谱柱2：DB-35MS UI石英毛细管色谱柱：升温程序：初始温度60-80℃保持3-5min，以25-35℃/min的速率升至120-140℃，再以4-6℃/min的速率升至190-210℃，保持0.5-1.5min；反吹系统条件为：在升温程序后开始进行反吹；反吹运行时间：7-9min；反吹运行压力：19-21psi；反吹运行温度：290-310℃；
质谱条件为：传输线温度：220-240℃；电离方式：电子轰击电离；离子源温度：220-240℃；四级杆温度：140-160℃；Q2碰撞气：高纯氮气；溶剂延迟时间：6-8min；扫描方式：多反应监测。
2.根据权利要求1所述的烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚的检测方法，其特征在于，步骤1)中，具体包括以下步骤：
A)分别称取2,4-DCA、2,6-DCA、2,4,6-TCA、TeCA的标准品，加入正己烷定容，配成混合标准储备溶液；
B)称取氘代2,4,6-三氯茴香醚，加入正己烷定容，配成内标溶液；
C)分别移取不同体积的步骤A中混合标准储备溶液，再分别加入一定体积的步骤B中内标溶液，用正己烷定容配制为一系列不同浓度的混合标准溶液。
3.根据权利要求1所述的烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚的检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述溶剂萃取是将烟草或烟草制品样品，加入水振荡混匀后，再加入正己烷和步骤1)所述内标溶液，进行涡旋震荡。
4.根据权利要求3所述的烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚的检测方法，其特征在于，所述烟草或烟草制品样品的质量与水加入的体积之比为1-2：5-10；所述烟草或烟草制品样品的质量与正己烷、内标溶液加入的体积之比为1-2：5-10：0.05-0.1。
5.根据权利要求1所述的烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚的检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述固相萃取净化是将上清液过固相萃取柱，再用有机溶剂过固相萃取柱进行洗脱，收集过固相萃取柱后的溶液。
6.根据权利要求5所述的烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚的检测方法，其特征在于，所述有机溶剂为正己烷与乙酸乙酯的混合溶液。
7.根据权利要求1所述的烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚的检测方法，其特征在于，步骤3)或4)中，所述多模式进样口与毛细色谱柱预柱配合进样条件为：进样口：MMI进样口；色谱进样口温度：初始70-80℃，保持0.05-0.2min，500-700℃/min速率升至180-200℃；进样量：20-30μl；进样方式：冷不分流进样；载气：高纯氦气，载气纯度≥99.999％；载气流速：初始流速1.1-1.3mL/min，保持0.05-0.15min，再以90-110mL/min速率升至1.9-2.1mL/min，保持3.8-3.9min，最后以90-110mL/min速率降至1.1-1.3mL/min；色谱柱预柱：去活性无固定相石英毛细管色谱柱。
8.根据权利要求1所述的烟草及烟草制品中多种氯代茴香醚的检测方法，其特征在于，步骤5)中，所述计算公式为X＝m/[m0×(1-w)]，其中，X为实际烟草或烟草制品样品中各组分的含量，单位为ng/g；m为通过内标标准曲线法得到的待测液中多种氯代茴香醚成分的含量，单位为ng；m0为称取的实际烟草或烟草制品样品的质量，单位为g；w为样品含水率，单位为％。
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