CN105816433A - 粉防己碱纳米微球冻干制剂及其制备方法 - Google Patents

粉防己碱纳米微球冻干制剂及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105816433A
CN105816433A CN201610375940.8A CN201610375940A CN105816433A CN 105816433 A CN105816433 A CN 105816433A CN 201610375940 A CN201610375940 A CN 201610375940A CN 105816433 A CN105816433 A CN 105816433A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tetrandrine
nano microsphere
preparation
nanoparticle
lyophilized formulations
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610375940.8A
Other languages
English (en)
Inventor
朱华旭
郭立玮
段金廒
胡涛
李博
陆瑾
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing University of Chinese Medicine
Original Assignee
Nanjing University of Chinese Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing University of Chinese Medicine filed Critical Nanjing University of Chinese Medicine
Priority to CN201610375940.8A priority Critical patent/CN105816433A/zh
Publication of CN105816433A publication Critical patent/CN105816433A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4748—Quinolines; Isoquinolines forming part of bridged ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0002—Galenical forms characterised by the drug release technique; Application systems commanded by energy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供粉防己碱纳米微球冻干制剂及其制备方法，涉及药物制剂领域。粉防己碱纳米微球，它是包含药物粉防己碱和载体的缓释纳米微球，所述载体为聚乳酸‑羟基乙酸共聚物；所述缓释纳米微球中粉防己碱的质量百分含量为4‑6%，所述纳米微球的平均粒径为300‑400nm；所述聚乳酸‑羟基乙酸共聚物的数均分子量为9000‑10000，其中乳酸与羟基乙酸的质量比为85：15～75：25。采用本发明方法制备的粉防己碱纳米微球冻干制剂，微球的粒径均一，可以调节粉防己碱的释放，延长药物的作用时间，显著提高粉防己碱对肝脏的靶向性能，减少用药剂量，降低肾脏毒性。

Description

粉防己碱纳米微球冻干制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，具体涉及粉防己碱纳米微球冻干制剂及其制备方法。
背景技术
粉防己碱是从防己科植物粉防己的块根中提取的生物碱，为双苄基异喹啉类生物碱，研究发现粉防己碱具有保肝护肝、抗肝纤维、诱导肿瘤细胞凋亡和逆转肿瘤细胞多药耐药性的作用，高浓度的粉防己碱在体外可诱导肝癌细胞凋亡，而较低浓度的粉防己碱不影响细胞存活，但能显著诱导肝癌细胞自噬。
临床应用中，粉防己碱因服用剂量大，靶向性不强，肾脏毒性较大，影响其临床应用。
发明内容
本发明的目的是提供粉防己碱纳米微球及其冻干制剂，微球的粒径均一，可以调节粉防己碱的释放，延长药物的作用时间，显著提高粉防己碱对肝脏的靶向性能，减少用药剂量，降低肾脏毒性。
本发明的再一目的是提供粉防己碱纳米微球冻干制剂的制备方法，该方法能够制备粒径均一、尺寸可控的微球。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
粉防己碱纳米微球，它是包含药物粉防己碱和载体的缓释纳米微球，所述载体为聚乳酸-羟基乙酸共聚物；所述缓释纳米微球中粉防己碱的质量百分含量为4～6％，所述纳米微球的平均粒径为300～400nm；所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的数均分子量为9000～10000，其中乳酸与羟基乙酸的质量比为85：15～75：25。
本发明还提供粉防己碱纳米微球冻干制剂，含有90～99质量份权利要求1所述粉防己碱纳米微球和1～10质量份冻干保护剂，所述冻干保护剂为甘露醇。
本发明还提供所述粉防己碱纳米微球冻干制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)储液罐依次吸入油相和水相，所述油相含有2～3g/L的粉防己碱和30～33g/L聚乳酸-羟基乙酸共聚物，溶剂为醋酸乙酯；所述水相是浓度为10～50g/L的聚乙烯醇水溶液；
(2)所述储液罐中物料搅拌后在1000～1500kPa的高压作用下通过SPG膜，被收集于收集罐内；所述SPG膜的孔径为1～5μm；
(3)萃取收集罐内物料中的有机溶剂，搅拌后离心取沉淀，洗涤后添加甘露醇，冷冻干燥。
优选的技术方案中，油相和水相的体积比1∶1～10。
优选的技术方案中，步骤(3)中在所述物料中加入物料体积2～10倍的聚乙烯醇水溶液以萃取有机溶剂，所述聚乙烯醇水溶液的浓度为1～20g/L。
优选的技术方案中，步骤(3)中离心的条件为：离心机转速为10000～20000r·min-1，离心时间为1～20min。
优选的技术方案中，所述储液罐中物料的搅拌速度为10000-15000rpm，搅拌时间为0.5～10min。
优选的技术方案中，所述步骤(2)重复2～5次后再进行步骤(3)，通过泵将物料从收集罐吸入储液罐内。
本发明中SPG膜是Shirasu Porous Glass membrane的简称，是一种多孔玻璃膜。
本发明所制备纳米粒子为大小均一，表面光滑的微球；药物与载体间没产生新的化学键，模型粉防己碱改变了原有晶型，以无定型态分散于载体材料中；体外释放符合Ritger-Peppas模型，属于浓度依赖型渗透释药。
本发明粉防己碱纳米微球，粒径均一，可以调节粉防己碱的释放，延长药物的作用时间，显著提高粉防己碱对肝脏的靶向性能，减少用药剂量，降低肾脏毒性。以人肝癌细胞HepG2细胞株作为研究对象，通过体外实验证明本发明制备的粉防己碱纳米微球具有显著的抑制肿瘤的作用。靶向性评价结果显示粉防己碱纳米微球可显著提高粉防己碱的肝脏靶向性，粉防己碱纳米微球在肝脏中的浓度超过游离药物的2倍，将显著减少用药剂量，对肝癌的治疗具有重要的临床意义；另外，同游离药物相比，粉防己碱纳米微球在各时间点肺、肾脏浓度均显著降低，可以减少其肾脏毒性。
采用本发明方法，能够获得粒径均一、尺寸可控的粉防己碱纳米微球。
附图说明
图1是实施例1中制备明胶微球的装置，其中1-氮气进气阀、2-真空泵吸气阀、3-储液罐、4-排气阀，5-阀门，6-阀门，7-进气阀，8-排气阀，9-阀门，10-排气阀，11-收集罐，12-加热装置，13-夹套，16-微孔膜管。
图2显示了X-射线衍射图，A是TET原料药，B是空白纳米粒子，C是TET与空白纳米粒子物理混合，D是载药纳米粒子。
图3是不同粒子的DSC图，其中A是空白纳米粒与TET物理混合，B是载药纳米粒子，C是空白辅料(甘露醇)与TET物理混合，D是空白纳米粒子，E是TET原料药。
图4显示了不同粒子的红外光谱图，其中A是TET原料药，B是TET和空白纳米粒子物理混合红外光谱图，C是载药纳米粒子，D是空白纳米粒子。
图5是不同条件下尼罗红纳米粒子的激光共聚焦图像和扫描电镜图，其中(A)微球扫描电镜图，(B)微球Z轴方向某一切面图，(C)微球Z轴光切图，(D)微球Z轴方向不同位置切面图。
图6显示了不同微球溶液的激光共聚焦图，其中(A)空白纳米粒子吸附尼罗红(离心前)，(B)空白微球吸附尼罗红(离心静置后)，(C)尼罗红纳米粒子。
图7体外释放曲线不同模型拟合图，(A)零级动力学拟合，(B)一级动力学方程拟合(C)Higuchi方程拟合，(D)Ritger-Peppas模型拟合，(E)Weibull分布模型。
图8 TET原料药与粉防己碱纳米微球作用于HepG 2细胞的浓度-抑制率图。
图9是空白载体细胞毒性评价。
图10是包载香豆素-6纳米粒子的体外细胞摄取。
图11是小鼠尾静脉注射粉防己碱(TET，对照药品溶液)和粉防己碱纳米微球(TET-NP)后粉防己碱浓度分布图。
具体实施方式
制备粉防己碱纳米微球采用如图1所示装置制备。该装置包括依次相连的储液罐3、微孔膜管16和收集罐11。微孔膜管中装有充分润湿的SPG膜。SPG膜规格:外径10mm，内径8mm，长12.5cm，孔径1μm。储液罐还连接有进气阀1、排气阀4和用于吸入物料(油相连续相和水相)的泵，泵可以选择真空泵或蠕动泵。进气阀用于通入高压氮气，使物料通过SPG膜，排气阀用于排净管道内气体。微孔膜管连接有进气阀7和排气阀8。储液罐外侧带有可以储存保温介质的夹套，夹套与加热装置相连。保温介质优选40-60度的水。储液罐通过管道与收集罐相连，以便通过泵将收集罐内物料送到储液罐内，重复乳化、过SPG膜、收集过程。储液罐内还设有搅拌器。收集罐底部有磁力搅拌装置。
实施例1 制备粉防己碱纳米微球冻干制剂
本实施例采用的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)的数均分子量为9152，乳酸与羟基乙酸的质量比为50:50。聚乙烯醇(PVA)的平均分子量为80000。
1.采用图1中装置制备粉防己碱纳米微球冻干制剂，具体方法如下：
(1)将PLGA与粉防己碱溶于醋酸乙酯中作为油相，油相中粉防己碱和PLGA浓度分别为2.5mg/ml和31.71mg/ml(过0.45μm微孔滤膜除去不溶物)。利用真空泵或蠕动泵将该物料泵入储液罐中，开启储液罐内搅拌器；10.3g/L的PVA水溶液作为水相(使用前过0.45μm微孔滤膜)，缓缓泵入储液罐中。油相与水相的体积比为1：5。
(2)以12000r·min-1的速度搅拌储液罐中物料，乳化45s，将物料均质乳化制备成油/水(O/W)型预乳液。打开进气阀1和6，向储液罐内通入压力较低的氮气使乳液充满整个管道，防止乳化时SPG膜前段有一段空气，而造成液滴与膜管的碰撞，产生过小的液滴。然后打开阀门9，向储液罐内通入压力为1180kPa的高压氮气，使储液罐内物料通过微孔膜管内的SPG膜，然后被收集于收集罐内。
(3)重复步骤(2)2次，即在整个制备过程中步骤(2)共操作3次，得到均一乳液。为了能够重复步骤(2)，通过泵将收集罐内物料送入储液罐中，此过程中阀门5打开。
(4)向步骤(3)得到的均一乳液中添加其体积6倍、浓度为5g/L的PVA水溶液，以萃取方法除去其中的醋酸乙酯，剩余溶液在常温下磁力搅拌6h，16000r·min-1离心10min取沉淀，用蒸馏水洗涤纳米粒3次，加入甘露醇，冷冻干燥，即得粉防己碱纳米微球冻干制剂。在冻干制剂中甘露醇的质量分数为6％。
采用上述相同方法制备未包载粉防己碱的空白纳米微球。
将空白纳米微球与TET(粉防己碱)原料药进行物理混合，其中TET(粉防己碱)原料药的含量与粉防己碱纳米微球冻干制剂中相同。
粉防己碱纳米微球的表征：纳米微球的平均包封率为66.57％、载药量为4.86％，平均粒径为343.2nm，PDI为0.037，扫描电镜下可见纳米粒子为大小均一，表面光滑的微球。
实施例2 粉防己碱纳米微球冻干制剂的表征
将实施例1制备的粉防己碱纳米微球冻干制剂(缩写为载药纳米粒子)、空白纳米微球(粒子)、空白纳米微球与TET(粉防己碱)原料药的物理混合物，TET(粉防己碱)原料药分别进行下列相关表征。
1.XRD分析
如图2所示，TET原料药及其与空白纳米粒子的物理混合混合物的特征图谱在8～30°有很强的TET结晶衍射峰，8.68°和15.66°为其中两个较强峰，在空白纳米粒子和载药纳米粒子中均不见TET的衍射尖峰，TET为无定形结构，其特征峰主要呈现为一个矮胖峰，推测TET以无定形状态分散于载体中。
2.DSC分析
如图3所示，粉防己碱原料药在226℃有1个很尖锐的吸热峰，这与粉防己碱的熔点相接近，空白纳米粒子与TET物理混合、空白纳米粒子和载药纳米粒在50℃附近出现吸热峰，这与PLGA的玻璃化温度相接近，物理混合物中可以看到粉防己碱的吸收峰，而在载药粒子中无粉防己碱的特征吸收峰，且与物理混合明显不同，说明粉防己碱在纳米粒子中改变了原有的晶型，以非结晶形式分散于载体骨架中，而没有吸附在载体材料表面。
3.IR分析
如图4所示，PLGA在1758cm-1附近出现酯C＝O吸收峰；TET原料药及其与空白纳米粒子的物理混合物在1505cm-1处有很强的峰，为粉防己碱中苯环特征吸收峰；物理混合中，PLGA在1350-1100cm-1处峰被粉防己碱烷基芳香醚C-O-C和C-N振动峰淹没。空白纳米粒、载药纳米粒中2994cm-1、2946cm-1、1459cm-1、1430cm-1、1400cm-1处为PLGA中饱和碳氢伸缩振动吸收峰，3448cm-1处为PLGA中羟基吸收峰，从图中可以看出两者的特征峰没有明显差异，在物理混合中也没有新的峰形成，可见载药纳米粒子中TET与PLGA之间并没有产生新的化学键。
4.内部结构模拟研究结果
采用制备粉防己碱纳米微球冻干制剂的方法将尼罗红包载制成纳米微球(缩写为尼罗红纳米粒子)。
4.1包载尼罗红粒子内部结构研究
如图5所示，(A)扫描电镜可见微球大小均一，表面光滑无粘连现象，(B)为包载尼罗红微球Z轴方向某一切面图，荧光物质尼罗红均匀分散于切面圆之中，荧光强度较强，图(D)为Z轴方向从上到下不同位置切面图，图(C)是由图(D)经计算机处理而得，X-Y轴切面为圆形，而Y-Z、X-Z轴由于扫描层数有限叠加而成椭圆形，从而说明荧光物质尼罗红均匀分布于微球之中。
4.2空白纳米粒子体外释放与吸附尼罗红研究
在空白纳米粒子溶液中添加尼罗红，然后离心，静置，观察离心前后空白纳米粒子对尼罗红的吸附情况。观察尼罗红纳米粒子溶液中尼罗红的释放情况。
如图6(C)所示：包载尼罗红微球(尼罗红纳米粒子)溶液在放置2h后，溶液环境中无尼罗红的荧光干扰；体外释放研究表明，在4h内，尼罗红纳米粒子的累积释放率低于1％。不仅如此，脂溶性的空白纳米粒子可以吸附水中少量的尼罗红，如图(A)、(B)所示，粒径较小的空白纳米粒子已被尼罗红完全浸透，粒径较大的尚未完全浸透，而造成中空假象，离心前微球溶液内荧光强度己高于背景，离心静置后整个溶液环境中几乎无荧光现象。该现象从反面进一步说明PLGA与尼罗红具有较强亲和性，能吸附水中少量尼罗红，且短时间内未见尼罗红泄露干扰背景。表明尼罗红可以作为荧光探针，研究粒子的内部结构。
5.体外释放结果
体外释放数据：包载粉防己碱纳米粒在0.5、1、2、4、8、12、24、48、72、120、180、228h，释放了6.53、8.51、12.48、16.04、21.76、24.12、28.64、35.20、40.26、52.49、55.61、67.45％，分别用零级动力学拟合(Mt/M∞＝kt)、一级动力学方程拟合(ln(1-Mt/M∞)＝-kt)、Higuchi方程拟合(Mt/M∞＝kt1/2)、Ritger-Peppas(Mt/M∞＝ktn)模型拟合和Weibull分布模型参数拟合，为了方便拟合，将上述模型做适当变换，可将表达式由对数式ln(1-Mt/M∞)＝-kt(一级动力学方程)的变换为指数式Mt＝M∞(1-e-kt)方程，然后则可以直接拟合。拟合结果如图7，表1所示。
表1 不同模型拟合方程
上述研究表明，粉防己碱纳米粒的体外释放符合Ritger-Peppas模型，226h累积释放约67.50％，其体外释放属于浓度依赖型渗透释药。因此，将粉防己碱包载于纳米微球中，可以调节粉防己碱的释放速率，延长药物的作用时间。
实施例三 粉防己碱纳米微球对肿瘤抑制作用的体外细胞研究
以人肝癌细胞HepG2细胞株作为研究对象，通过体外实验研究本发明所制备的粉防己碱纳米微球的肿瘤抑制作用。
1.仪器与材料
HERA Cell 150 CO2培养箱(美国热电集团)；LABCONCO ClassⅡ生物安全柜(美国公司)；COIC XDS-1B相差倒置显微镜(重庆光电仪器总公司)；LeicaTCS-SP5激光共聚焦显微镜(德国)；DZX-50KB立式压力蒸气灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；ZW-A微量振荡器(常州国华电器有限公司)；酶标仪(美国热电集团)；细胞计数板(上海市求精生化仪器厂)；96孔培养板(Grerner Bio-one公司)。
PLGA(LA-GA＝50∶50，平均相对分子质量15kDa，山东省医疗器械研究所)；聚乙烯醇(PVA 1788，上海阿拉丁试剂有限公司)；醋酸乙酯(EA，上海国药)；无水乙醇(分析纯，中国医药集团上海试剂公司)；香豆素-6(美国Sigma-Aldrich，含量≥98.0％)；甲醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯(分析纯)。胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；RPMI-1640培养基(GIBCO公司)；胰蛋白酶溶液(GIBCO公司)；二甲基亚砜(分析纯，南京化学试剂有限公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT，SunShine公司)；人肝癌细胞HepG 2细胞株：购自于中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所。
2.实验方法与结果
2.1给药药液的制备
2.1.1TET给药溶液配制：称取TET原料药3.0mg，加入DMSO溶解定容至1mL，得到浓度为3mg/mL的TET溶液，后用RPMI 1640不完全培养基分别稀释到不同浓度。
2.1.2TET-NP给药溶液配制：称取粉防己碱纳米微球冻干制剂(实施例1制备)适量，加蒸馏水溶解，使粉防己碱浓度为3mg/mL，得到粉防己碱纳米微球(缩写为TET-NP)给药溶液，后用RPMI 1640不完全培养基分别稀释到与TET溶液对应的不同浓度。另外配制空白纳米粒子给药溶液，其浓度与TET-NP给药溶液中微球浓度相对应，作为对照。
2.2包载香豆素-6荧光探针纳米粒的制备与评估
2.2.1包载香豆素-6纳米粒的制备
采用实施例1中方法制备包载香豆素-6纳米粒，不同之处在于采用香豆素-6代替粉防己碱。
2.2.2HPLC方法检测香豆素-6
色谱条件：Waters Xbridge C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；Waters2695检测器:Waters 2475MultiλFluorescence Detector荧光检测器；流动相：甲醇-水(95：5)；流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL；检测波长：激发波长Ex＝466nm，发射波长Em＝504nm。
2.2.3包载香豆素-6纳米粒体外释放研究
称取包载香豆素-6纳米粒适量，加入预先处理好的透析袋中，加入2.0mLpH为7.4的磷酸盐缓冲液，将透析袋两端扎紧不得漏液，将其放入装有48mL相同磷酸缓冲液的避光具塞锥形瓶中，置于恒温振荡器中，在温度37℃，振荡频率为100r·min-1的条件下振摇，分别于5min，15min，30min，60min，120min，240min，480min，720min用移液枪吸取释放介质500μL，立即向锥形瓶内添加同温度下的释放介质500μL，HPLC测定香豆素-6浓度，代入标准曲线计算香豆素纳米粒释放量，同时称取香豆素纳米粒适量，加入乙腈溶解，并稀释至适当浓度，HPLC测定香豆素-6含量，计算香豆素纳米粒的累积释放量，结果包载香豆素-6纳米粒在24h累积释放率<2.5％，表明香豆素能够稳定的包载于纳米粒中，短时间内无突释现象。
2.3MTT实验研究
MTT测定的具体试验方法如下：分别检测TET原料药、粉防己碱纳米微球以及空白纳米粒子对人肝癌细胞HepG2细胞株的体外细胞毒作用。将处于对数生长期的人肝癌HepG2细胞用胰酶消化，用含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基配成浓度为5×104个·mL-1细胞悬液，接种在96孔板，每孔加入200μL，置于37℃、5％CO2培养箱及饱和的湿度条件下培养，在24h后弃去含有胎牛血清的培养基，采用MTT法测定细胞的增殖。分别加入不同浓度(0.5、1、2、2.5、5、10、30μg/mL)的TET原料药、粉防己碱纳米微球以及空白纳米粒子，给药药液200μL，每组设6个平行孔。在37℃、5％CO2培养箱培养24h后，每孔加入MTT溶液(5mg·mL-1)10μL，培养4h后终止，弃掉孔中上清液，然后每孔加入100μL的DMSO，微型振荡器振荡10min，用酶标仪于490nm处测定每孔的吸光度(A)值。数据采用SPSS 16.0统计软件处理，计算药液的细胞生长抑制率，用表示，求出半数抑制浓度(IC50)。细胞生长抑制率(％)＝(1-实验组A值平均值/空白对照组A值平均值)×100％。
粉防己碱纳米微球和TET原料药在不同浓度下对人肝癌细胞HepG2细胞株的体外抗肿瘤活性见图8。无论是原料药还是纳米粒，其抑制肿瘤细胞增殖的作用均随着浓度的升高而增加。纳米粒和裸药比较两者的IC50相当，没有明显差别，分别为8.44和8.34μg/mL，在低浓度时，纳米粒的抑制作用要强于原料药，在高浓度时，原料药的抑制作用要强于纳米粒。
2.4空白纳米粒子对肝癌细胞毒性评价
空白纳米粒子作用于肝癌细胞后，细胞活力的变化见图9。从图中可见，随着空白纳米粒子浓度的不断增加，肝癌细胞活力没有明显变化。空白纳米粒子对人体肝癌细胞HepG2细胞无明显的抑制作用，说明制备的纳米粒子具有较好的生物相容性。纳米粒子是抗肿瘤药物及其他药物的良好载体，尤其是以聚乳酸-羰基乙酸共聚物为材料制备的纳米粒。因其良好的生物相容性和生物可降解性而得到了广泛研究，高浓度的载体材料，对于肝癌细胞正常生长也没有明显抑制作用，说明真正发挥抗癌作用的是其中包载的药物。
2.5纳米粒子的细胞摄取实验
将肝癌细胞接种于预先消毒处理过的6孔板内的盖玻片上，将6孔板置37℃、含5％CO2培养箱中培养24小时，吸出培养液，加入包载香豆素-6的纳米粒子，培养4小时后，弃去培养基，用37℃的PBS缓冲液冲洗盖玻片3-4次，洗去多余的纳米混悬粒子，将盖玻片置于荧光显微镜下观察。
从图10中看出，包载香豆素-6的纳米粒子与细胞共同作用4小时后，在荧光显微镜下观察，可发现肿瘤细胞发出香豆素-6的绿色荧光，绿色荧光主要分布在细胞质中，细胞边缘有少许荧光亮点。由于包载香豆素-6纳米粒子体外释放实验显示包载香豆素-6的纳米粒子在24h内累积释放率小于2.5％，因此短时间内香豆素-6的体外泄漏量很少，而肿瘤细胞内有香豆素的绿色荧光，这也提示纳米粒进入肿瘤细胞。与通过弥散方式进入细胞的小分子药物不同，纳米粒可能是通过细胞胞吞作用进入细胞，胞吞作用可使药物投递系统进入细胞内，然后缓慢释放出药物，不仅可以使药物浓集于靶区、提高疗效，而且可以部分逆转肿瘤细胞的MDR效应[47]。由此可见，粉防己碱纳米微球具有一定的体外抗肿瘤效果，纳米粒可通过胞吞作用进入癌细胞，载体材料本身安全无毒，因此在治疗肝癌方面具有非常好的前景。
实施例四 粉防己碱纳米微球的体内组织分布研究
本实施例主要研究粉防己碱纳米微球在体内的组织分布情况。
1.仪器与材料
1.1材料
Agilent 1100高效液相色谱；高速离心机(贝克曼公司)；AUW120D十万分之一电子天平(岛津，日本)；10、200、1000μL的微型移液器(eppendor公司，德国)；超细均浆器(E6/10-8G型，上海弗鲁克流体机械制造有限公司)；氮气浓缩仪(MTN-2000W，奥特赛恩斯仪器有限公司，天津)。
1.2试剂
粉防己碱对照品(粉防己碱，批号110711-200708，中国食品药品检定研究院)；粉防己碱提取物(南京泽朗医药有限公司，纯度98％)；肝素钠(Sigma公司)；乙腈(色谱纯，默克公司)；甲醇(色谱纯，江苏汉邦科技有限公司)。
1.3实验动物
消洁级ICR小鼠，18-22g，雄性，实验动物许可证号SCXK(苏)2012-0004(扬州大学比较医学中心)。实验动物饲养于南京屮医药大学实验动物屮心。
2.实验方法
2.1色谱条件与溶液的配制
Waters Symmetry C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)，流动相为甲醇-水(含0.2％三乙胺)＝80∶20(体积比)，检测波长为282nm，柱温:30℃，流速:1.0mL·min-1，进样量20μL。
2.2.1标准溶液的制备
精密称取粉防己碱对照品适量，加乙腈制成每毫升含TET 0.188mg的对照品储备液。将对照品储备液分别稀释10、50、100、250和500、1000倍制成标准曲线溶液。
2.2.2对照药品溶液的配制
称取粉防己碱提取物20mg，用少许2mol/mL的HC1溶解，用2mol/L的NaOH溶液调节pH值在5-7之间，加入生理盐水稀释至10mL，即得到浓度为2mg/mL的粉防己碱水溶液，溶液呈澄清透明状。
2.2.3粉防己碱纳米微球分散液的配制
称取粉防己碱纳米微球冻干制剂适量，加入少许生理盐水使其均匀分散，移取200μL于10ml溶量瓶中，用乙腈超声溶解、放冷，过0.22μm微孔滤膜，进HPLC检测峰面积，代入标准曲线，计算含量。粉防己碱纳米微球溶于生理盐水，调节pH，使其中的粉防己碱浓度与对照品溶液相同，得到粉防己碱纳米微球分散液。
2.2动物给药方法与样品的处理
2.2.1动物给药方法
粉防己碱纳米微球在小鼠体内的组织分布实验：取体重22-25g的雄性小鼠60只，随机分为12组，每组5只。给药前禁食，不禁水12h。前6组小鼠尾静脉注射对照药品溶液，后6组注射粉防己碱纳米微球分散液，其中粉防己碱给药剂量是10mg/kg-1，在给药后的0.25、1、2、4、6、12h时，眼匡取血置肝素化离心管后处死小鼠，、取心、肝、脾、肺、肾于-40℃冰箱中保存。
2.2.2样品处理方法
吸取小鼠血浆200μL于1.5mL离心管中，加入3倍体积的乙腈，涡旋3min，于10000rpm转速下离心10min，取上清液氮气下挥干，再用100μL的乙腈复溶，涡旋3min，10000rpm离心10min，取上清液进样20μL。
由于小鼠脾脏较小，因此取各组织适量，加入5倍量的生理盐水，匀浆，精密吸匀浆液200μL于离心管中，加入3倍量的乙腈，涡旋3min，10000rpm离心10min，取上清液氮气下挥干，再用100μL的乙腈复溶，涡旋3min，10000rpm离心10min，取上清液进样20μL。
3.实验结果
采用HPLC检测各样品中粉防己碱浓度，具体见表2和图11。图中部分血、心脏、脾脏样品由于低于检测限未能检出，在图中未列出。肝、脾组织的分布结果显示(图9)，与原料药相比，将粉防己碱制成纳米粒后，可明显提高其在肝、脾组织中的浓度，各时间点的肝、脾药物浓度均明显高于其普通剂型，由表2可知肝脏和脾脏的Ce(峰浓度)分别为2.09和2.04，Re(相对摄取率)为1.84和1.43，给药后纳米粒能够迅速浓集定位于肝脏、脾脏，可能是纳米粒给药能很快被网状内皮系统丰富的肝、脾组织所摄取。靶向性评价结果显示纳米粒可显著提高粉防己碱的肝脏靶向性，粉防己碱纳米微球在肝脏中的浓度超过游离药物的2倍，将显著减少用药剂量，对肝癌的治疗具有重要的临床意义；另外，同游离药物相比，粉防己碱纳米微球在各时间点肺、肾脏浓度均降低，可以减少其肾脏毒性。
表2 粉防己碱(TET，对照药品溶液)和粉防己碱纳米微球(TET-NP)的靶向性评价

Claims (8)

1.粉防己碱纳米微球，其特征在于它是包含药物粉防己碱和载体的缓释纳米微球，所述载体为聚乳酸-羟基乙酸共聚物；所述缓释纳米微球中粉防己碱的质量百分含量为4～6%，所述纳米微球的平均粒径为300～400nm；所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的数均分子量为9000～10000，其中乳酸与羟基乙酸的质量比为85：15～75：25。
2.粉防己碱纳米微球冻干制剂，其特征在于含有90～99质量份权利要求1所述粉防己碱纳米微球和1～10质量份冻干保护剂，所述冻干保护剂为甘露醇。
3.权利要求2所述粉防己碱纳米微球冻干制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)储液罐依次吸入油相和水相，所述油相含有2～3g/L的粉防己碱和30～33g/L聚乳酸-羟基乙酸共聚物，溶剂为醋酸乙酯；所述水相是浓度为10～50g/L的聚乙烯醇水溶液；
(2)所述储液罐中物料搅拌后在1000～1500kPa的高压作用下通过SPG膜，被收集于收集罐内；所述SPG膜的孔径为1～5μm；
(3)萃取收集罐内物料中的有机溶剂，搅拌后离心取沉淀，洗涤后添加甘露醇，冷冻干燥。
4.根据权利要求3所述粉防己碱纳米微球冻干制剂的制备方法，其特征在于油相和水相的体积比1∶1～10。
5.根据权利要求3或4所述粉防己碱纳米微球冻干制剂的制备方法，其特征在于步骤（3）中在所述物料中加入物料体积2～10倍的聚乙烯醇水溶液以萃取有机溶剂，所述聚乙烯醇水溶液的浓度为1～20g/L。
6.根据权利要求5所述粉防己碱纳米微球冻干制剂的制备方法，其特征在于步骤（3）中离心的条件为：离心机转速为10000 ～20000 r·min-1，离心时间为1～20 min。
7.根据权利要求6所述粉防己碱纳米微球冻干制剂的制备方法，其特征在于所述储液罐中物料的搅拌速度为10000～15000rpm，搅拌时间为0.5～10min。
8.根据权利要求7所述粉防己碱纳米微球冻干制剂的制备方法，其特征在于所述步骤（2）重复2～5次后再进行步骤（3），通过泵将物料从收集罐吸入储液罐内。
CN201610375940.8A 2016-05-31 2016-05-31 粉防己碱纳米微球冻干制剂及其制备方法 Pending CN105816433A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610375940.8A CN105816433A (zh) 2016-05-31 2016-05-31 粉防己碱纳米微球冻干制剂及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610375940.8A CN105816433A (zh) 2016-05-31 2016-05-31 粉防己碱纳米微球冻干制剂及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105816433A true CN105816433A (zh) 2016-08-03

Family

ID=56532563

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610375940.8A Pending CN105816433A (zh) 2016-05-31 2016-05-31 粉防己碱纳米微球冻干制剂及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105816433A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023015851A1 (zh) * 2021-08-10 2023-02-16 山东谷雨春生物科技有限公司 一种注射用曲安奈德微球植入剂及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105311631A (zh) * 2014-07-02 2016-02-10 北京亦科为生物技术有限公司 CaP-PLA/PLGA纳微球及其制备方法与应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105311631A (zh) * 2014-07-02 2016-02-10 北京亦科为生物技术有限公司 CaP-PLA/PLGA纳微球及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨梦琪等: "SPG 膜乳化法制备溶菌酶-PLGA微球的研究", 《中国药师》 *
殷爱玲: "SPG膜乳化法制备汉防己甲素肺靶向微球", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
陆瑾等: "SPG膜乳化制备汉防己甲素-丹参酮ⅡA-PLGA二元微球及其体外表征", 《中国中药杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023015851A1 (zh) * 2021-08-10 2023-02-16 山东谷雨春生物科技有限公司 一种注射用曲安奈德微球植入剂及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105853365B (zh) 一种兼具pH响应性及叶酸靶向性并负载熊果酸的二氧化硅-壳聚糖-叶酸纳米材料及应用
CN101721350B (zh) 一种叶酸介导靶向的聚合物胶束
Zhu et al. Preparation, characterization, and anti-tumor property of podophyllotoxin-loaded solid lipid nanoparticles
CN104163915B (zh) 胆固醇-泊洛沙姆-胆固醇三嵌段共聚物及其制备方法和应用
CN108619094A (zh) 一种抗癌天然产物藤黄酸的纳米制剂及其制备方法
CN103751787A (zh) 维生素e tpgs在制备多孔药物载体微粒中的用途
CN104367552A (zh) 载白藜芦醇的氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒的制备方法
CN103435718A (zh) Peg修饰的透明质酸胆固醇酯
CN104116710A (zh) 靶向肿瘤的pH敏感聚合物胶束组合物
CN106729727A (zh) 靶向配体修饰的还原响应型磁性纳米载体及其制备方法
CN110840837B (zh) 一种汉防己甲素纳米混悬液及其制备方法和应用
Yi et al. Synthesis, characterization, and formulation of poly-puerarin as a biodegradable and biosafe drug delivery platform for anti-cancer therapy
CN104116709A (zh) 靶向肿瘤的抗肿瘤耐药的pH敏感聚合物胶束组合物
CN102139113B (zh) 新的药物增溶载体及其制备方法和应用
CN101831005B (zh) pH敏感型壳聚糖衍生物及其在药剂学中的应用
CN104116711A (zh) 抗肿瘤耐药的pH敏感聚合物胶束组合物
CN106361724B (zh) 一种20(R)-人参皂苷Rg3缓释纳米微球组合及其制备方法
CN104324007B (zh) 一种天然重组纳米脂质载体制备技术与应用
CN104415029A (zh) 一种穿心莲内酯聚合物胶束及其制备方法与医药用途
CN105816433A (zh) 粉防己碱纳米微球冻干制剂及其制备方法
CN108309938A (zh) 主动定制白蛋白冕的药物传递载体及其在药学中的应用
CN104225612A (zh) 一种基于天然p-糖蛋白抑制剂构建的口服吸收促进剂的制备及其应用
CN103494820A (zh) 一种尼莫地平/川芎嗪双载药plga纳米粒及其制备方法
CN103768022B (zh) 一种用作靶向性输送紫杉醇的自组装纳米粒、其制备方法和用途
CN102940606A (zh) 一种金针菇甾醇提取物脂质体制剂及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160803

RJ01 Rejection of invention patent application after publication