CN105803011A - 一种高产dha的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高产DHA的方法，该方法通过四阶段供养策略实现，且在特制的搅拌式生物反应器中实现。通过该方法培养获得的裂殖壶菌，生物量可达150 – 200 g/L，油脂含量100 – 120 g/L，油脂中DHA含量50% – 60%，底物转化率25% – 30%。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及利用耗氧方式培养微生物生产多不饱和油脂领域，还涉及利用具有特殊构造的生物反应器实现该工艺的方法。
背景技术
二十二碳六烯酸（DHA,Docosahexaenoicacid，C22:6）是一种重要的ω-3型长链多不饱和脂肪酸，是大脑和视网膜中细胞膜的重要组成成分，具有增强视力、促进大脑发育等生理功效，被誉为“脑黄金”。目前已应用于食品、医疗、保健品等行业，特别是保健品、婴幼儿奶粉等高端产品领域。DHA的传统来源主要是深海鱼油，但随着渔业资源的不断匮乏、海洋污染的不断加剧及人们对高品质DHA的追求，深海鱼油已经不能满足市场的要求。随着鱼油中DHA来源的发现和工业发酵技术的强大，一系列具有积累DHA的海洋微藻（寇氏隐甲藻、裂壶藻、破囊壶藻、吾肯氏壶藻等）不断被挖掘出来，DHA的商业化发酵生产也取得了飞速的发展。
目前国内涉及裂殖弧菌发酵产DHA油脂的专利主要有二十余篇，主要可以分为三方面内容：（1）优良菌种的选育，（2）培养基优化，（3）发酵过程补料及控制策略优化。这三方面的主要目的是通过筛选、培养高生长速率和高DHA含量的菌株；通过改变培养基中的组分，如制备全合成培养基并适当调整发酵液的渗透压，优化微量元素及维生素的用量，发酵过程中加入可提高菌种活性的物质，从而达到高产的目的；还有则是通过发酵工艺的优化的方法完成产业的放大及降低发酵成本。
现有技术中也提到，通过多阶段优化发酵过程中的氧含量，可以有效达到高产DHA的目的，但是裂殖壶菌是对氧气、剪切力、渗透压等参数及其敏感的微生物；获得使用于该产业的特殊发酵工艺，并开发与之匹配的反应器，实现生物量、油脂含量及DHA含量的高产，是DHA工业化进一步快速发展的关键所在。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提高裂殖壶菌产DHA的效率，同时实现生物量、油脂含量、DHA含量的高产。为了解决上述问题，本发明提供了一种高产DHA的工艺，并提供了适用于该工艺的特殊反应器的构造，使得该反应器能够满足该工艺的技术特征需求。
具体的，本发明的技术方案为：
一种高产DHA的方法，其中，以裂殖壶菌为发酵菌株，在发酵罐中，采用四阶段供氧工艺发酵生产DHA，第一阶段为发酵0-40h，控制通气量为1.0vvm-2.0vvm；第二阶段为发酵40h–60h，通气量为0.5vvm–1.0vvm；第三阶段为发酵60h–80h，通气量为1.0vvm–2.0vvm；第四阶段为发酵90h–110h时，通气量为1.0vvm–2.0vvm，停止碳源的补加。
本发明所述的方法，其中，在所述工艺中，发酵罐的搅拌转速为50-200rpm。
本发明所述的方法，其中，发酵培养的温度为28-30℃。
本发明所述的方法，其中，所述供氧工艺采用特制的反应器，该反应器采用三层螺旋桨结构，上层及中间层桨叶为任意桨叶组合，底层桨为特殊的微膜曝气推进式叶轮。
本发明所述的方法，其中，所述反应器包括风管（3）通过无缝焊接与气盒（2）连接，气盒（2）通过调节螺栓（1）进行高度调节，气盒（2）通过特殊的机械密封（4）与微膜曝气螺旋桨轴（6）连接，微膜曝气螺旋桨轴（6）通过特殊的密封连轴器（8、9）与转动轴（11）连接。
本发明所述的方法，其中，所述反应器的微膜曝气螺旋桨轴（6）、膜搅拌桨（5）、密封连轴器（8、9）、通过联轴器固定螺丝（7、10）定位，并与转动轴（11）连接。
搅拌桨叶5是上下表面由微孔烧结板焊接而成的中空桨叶。在工作时，气流通过通气管3进入气室2，气流进而进入搅拌桨叶轮轴6的轴心，并通过搅拌桨叶轮轴6与桨叶焊接处的气孔进入桨叶5的空腔中，桨叶5的空腔中的气体在压力的作用下透过搅拌桨叶5微孔烧结板的上下表面，形成直径在10-100nm的微小气泡，气泡在搅拌桨的作用下分散到发酵液中。
本发明所述的方法，其发酵体系中的气含量为20-25%。
本发明所述的方法中的反应器能够满足高耗氧低剪切的发酵体系，在搅拌桨搅拌速度为50-200rpm，通气量为0.5vvm-2.0vvm的时候，发酵体系中的气含量也能达到20-25%。
具体的，如图1所示，特殊反应器的风管（3）通过无缝焊接与气盒（2）连接，气盒（2）通过调节螺栓（1）进行高度调节，微膜曝气螺旋桨轴（6）与气盒（2）通过机械密封动静连接，微膜曝气螺旋桨轴（6）的动环端面与气盒（2）的静环端面连接，机械密封其结构是一种系单端面、多弹簧、转动螺钉转动的专用于发酵罐的机械密封，其特征在于静环与转动轴法兰之间的静环密封圈采用平垫密封圈进行密封，微膜曝气螺旋桨轴（6）通过特殊的密封连轴器（8、9）与转动轴（11）连接。反应器的微膜曝气螺旋桨轴（6）、膜搅拌桨（5）、密封连轴器（8、9）、通过联轴器固定螺丝（7、10）定位，并与转动轴（11）连接。
在发酵罐灭菌时，蒸汽通过风管进入微膜曝气螺旋桨轴空心轴到达微膜曝气螺旋桨的叶片，进而借助螺旋桨的离心作用均匀的分布的溶液中，到对管路及发酵液灭菌的目的。在培养过程中，无菌空气通过空心轴到达微膜结构的螺旋桨的叶片形成小气泡，气泡通过离心作用均匀的分布于发酵液中，再通过螺旋桨的推动作用促进流体湍流，增加反应器的传质系数。同时，利用搅拌叶轮的转动使膜片与溶液形成错流，不断的冲刷膜表面防止曝气膜孔的堵塞。同时微膜搅拌浆主体的特殊结构设计，并且不需要搅拌叶轮来粉碎气泡，因此搅拌叶片形式可以做成多种结构来满足不同的发酵体系。
在一个优选的实施方案中，以裂殖壶菌为发酵菌株，在发酵罐中，采用四阶段供氧工艺发酵生产DHA，第一阶段为发酵0-40h，控制通气量为1.0vvm-2.0vvm；第二阶段为发酵40h–60h，通气量为0.5vvm–1.0vvm；第三阶段为发酵60h–80h，通气量为1.0vvm–2.0vvm；第四阶段为发酵90h–110h时，通气量为1.0vvm–2.0vvm，停止碳源的补加，搅拌转速为50-200rpm，发酵温度为30℃；其中该发酵罐采用三层螺旋桨结构，上层及中间层桨叶为任意桨叶组合，底层桨为特殊的微膜曝气推进式叶轮，且包括风管（3）通过无缝焊接与气盒（2）连接，气盒（2）通过调节螺栓（1）进行高度调节，气盒（2）通过特殊的机械密封（4）与微膜曝气螺旋桨轴（6）连接，微膜曝气螺旋桨轴（6）通过特殊的密封连轴器（8、9）与转动轴（11）连接；微膜曝气螺旋桨轴（6）、膜搅拌桨（5）、密封连轴器（8、9）、通过联轴器固定螺丝（7、10）定位，并与转动轴（11）连接；整个发酵过程中，发酵体系气含量为20-25%。
在本发明的有益效果在于：
（1）本发明提供了一种高产DHA的工艺，并提供了一种能够满足该工艺的特殊反应器。
（2）本发明所提供的新型反应器可以利用微膜叶片布气，分布出的气泡粒径小，不需要依赖叶轮的搅拌作用来打散，极大的提高了发酵液中的气含率、气泡停留时间及气泡的比表面积，进而提高了氧传递系数。同时低剪切力的轴向流搅拌器使用，不仅解决了生物反应器整体混合问题，还解决了高剪切力问题。
（3）本发明所提供的发酵工艺可达到细胞生长速度快、底物转化率高、油脂产量高、DHA含量高，发酵过程稳定等目的。在上述的工艺条件下，可获得生物量为150–200g/L，油脂含量100–120g/L，油脂中DHA含量50%–60%，底物转化率25%–30%。
附图说明
图1为本发明实施例不同发酵时间裂殖弧菌在显微镜下的形态；
图2为发酵设备组装图；
标记：1-调节螺栓；2-气盒；3-风管；4-机械密封；5-膜搅拌叶；6-微膜曝气螺旋桨轴；7-联轴器固定螺丝；8-密封连轴器；9-密封连轴器；10-联轴器固定螺丝；11-转动轴。
具体实施方式
本实施例中所使用的菌种为现有技术方案中的任意裂殖壶菌菌种，例如本发明优选使用裂殖壶菌（Schizochytriumsp.HX-308），由本实验室自主筛选获得，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号CCTCCM209059，在先专利公开号CN101575584A。
实施例1本实施例说明特制发酵设备的结构以及使用方法
该发酵设备采用三层桨结构，上层及中间层桨叶为推进式桨叶，底层桨为特殊的微膜曝气推进式叶轮。发酵设备组装图如附图2所示，特殊反应器的风管（3）通过无缝焊接与气盒（2）连接，气盒（2）通过调节螺栓（1）进行高度调节，微膜曝气螺旋桨轴（6）与气盒（2）通过机械密封动静连接，微膜曝气螺旋桨轴（6）的动环端面与气盒（2）的静环端面连接，机械密封其结构是一种系单端面、多弹簧、转动螺钉转动的专用于发酵罐的机械密封，其特征在于静环与转动轴法兰之间的静环密封圈采用平垫密封圈进行密封，微膜曝气螺旋桨轴（6）通过特殊的密封连轴器（8、9）与转动轴（11）连接。反应器的微膜曝气螺旋桨轴（6）、膜搅拌桨（5）、密封连轴器（8、9）、通过联轴器固定螺丝（7、10）定位，并与转动轴（11）连接。在发酵罐灭菌时，蒸汽通过风管进入微膜曝气螺旋桨轴空心轴到达微膜曝气螺旋桨的叶片，进而借助螺旋桨的离心作用均匀的分布的溶液中，到对管路及发酵液灭菌的目的。在培养过程中，无菌空气通过空心轴到达微膜结构的螺旋桨的叶片形成小气泡，气泡通过离心作用均匀的分布于发酵液中，再通过螺旋桨的推动作用促进流体湍流，增加反应器的传质系数。同时，利用搅拌叶轮的转动使膜片与溶液形成错流，不断的冲刷膜表面防止曝气膜孔的堵塞。
在发酵之前，发酵罐用高压水枪清洗干净，120℃空消10分钟；按照需要投料，120℃灭菌20min，通风搅拌至28-30℃，接种发酵。
实施例2单阶段供氧策略发酵制备DHA油脂。
本实施例在实施例1所述的发酵罐中实施，将保存在甘油管中的DHA菌种接入装有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，在摇床上进行种子的活化，温度30℃，转速170rpm，培养24h，获得活力较高的种子液。按照同样的方法活化三代后，将种子液接入装有培养基的种子罐中，接种量10%（v/v），通气量0.6vvm，搅拌转速200rpm，罐温30℃，加入消泡剂siliconeSE-2，添加量为0.3g/L，发酵培养20h–48h，获得高活性种子。将已培养好的种子液接入50L发酵罐，工作体积30L，接种量10%（v/v），通气量1.0vvm，搅拌转速200rpm，罐温30℃，加入消泡剂siliconeSE-2，添加量为0.3g/L，发酵培养120h，得到富含DHA的油脂。
实施例3：两阶段供氧策略发酵制备DHA油脂。
本实施例在实施例1所述的发酵罐中实施，将保存在甘油管中的DHA菌种接入装有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，在摇床上进行种子的活化，温度30℃，转速170rpm，培养24h，获得活力较高的种子液。按照同样的方法活化三代后，将种子液接入装有培养基的种子罐中，接种量10%（v/v），通气量0.6vvm，搅拌转速200rpm，罐温30℃，加入消泡剂siliconeSE-2，添加量为0.3g/L，发酵培养20h–48h，获得高活性种子。将已培养好的种子液接入50L发酵罐，工作体积30L，接种量10%（v/v），通气量1.0vvm，搅拌转速200rpm，罐温30℃，加入消泡剂siliconeSE-2，添加量为0.3g/L，发酵培养120h，在发酵进入油脂积累期（发酵40h）将通气量调至0.5vvm，使发酵进入低供氧阶段，直至发酵结束，得到富含DHA的油脂。
实施例4：三阶段供氧策略发酵制备DHA油脂。
本实施例在实施例1所述的发酵罐中实施，将保存在甘油管中的DHA菌种接入装有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，在摇床上进行种子的活化，温度30℃，转速170rpm，培养24h，获得活力较高的种子液。按照同样的方法活化三代后，将种子液接入装有培养基的种子罐中，接种量10%（v/v），通气量0.6vvm，搅拌转速200rpm，罐温30℃，加入消泡剂siliconeSE-2，添加量为0.3g/L，发酵培养20h–48h，获得高活性种子。将已培养好的种子液接入50L发酵罐，工作体积30L，接种量10%（v/v），通气量1.0vvm，搅拌转速200rpm，罐温30℃，加入消泡剂siliconeSE-2，添加量为0.3g/L，发酵培养120h，在发酵进入油脂积累期（发酵40h）将通气量调至0.5vvm，使发酵进入低供氧阶段，进而降低细胞活性，待细胞活性相对稳定之后（即低供氧持续16h）将供氧水平提高至1.0vvm直至发酵结束，得到富含DHA的油脂。
实施例5：四阶段控制策略发酵制备DHA油脂。
本实施例在实施例1所述的发酵罐中实施，将保存在甘油管中的DHA菌种接入装有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，在摇床上进行种子的活化，温度30℃，转速170rpm，培养24h，获得活力较高的种子液。按照同样的方法活化三代后，将种子液接入装有培养基的种子罐中，接种量10%（v/v），通气量0.6vvm，搅拌转速200rpm，罐温30℃，加入消泡剂siliconeSE-2，添加量为0.3g/L，发酵培养20h–48h，获得高活性种子。将已培养好的种子液接入50L发酵罐，工作体积30L，接种量10%（v/v），通气量1.0vvm，搅拌转速200rpm，罐温30℃，加入消泡剂siliconeSE-2，添加量为0.3g/L，发酵培养120h，在发酵进入油脂积累期（发酵40h）将通气量调至0.5vvm，使发酵进入低供氧阶段，进而降低细胞活性，待细胞活性相对稳定之后（即地供氧持续16h）将供氧水平提高至1.0vvm直至发酵结束，在发酵100h时停止碳源的补加，使菌体进入饥饿状态迫使其进行油脂的返耗，得到富含DHA的油脂。实施例中各阶段裂殖壶菌发酵形态如图1所述。
实施例6本实施例在现有技术的发酵罐中实施，该实施例的发酵与实施例1的区别在于，该发酵罐不具有实施例1所述的微膜曝气推进式叶轮而采用常规的推进式叶轮发酵罐。
将保存在甘油管中的DHA菌种接入装有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，在摇床上进行种子的活化，温度30℃，转速170rpm，培养24h，获得活力较高的种子液。按照同样的方法活化三代后，将种子液接入装有培养基的种子罐中，接种量10%（v/v），通气量0.6vvm，搅拌转速200rpm，罐温30℃，加入消泡剂siliconeSE-2，添加量为0.3g/L，发酵培养20h–48h，获得高活性种子。将已培养好的种子液接入50L发酵罐，工作体积30L，接种量10%（v/v），通气量1.0vvm，搅拌转速200rpm，罐温30℃，加入消泡剂siliconeSE-2，添加量为0.3g/L，发酵培养120h，在发酵进入油脂积累期（发酵40h）将通气量调至0.5vvm，使发酵进入低供氧阶段，进而降低细胞活性，待细胞活性相对稳定之后（即地供氧持续16h）将供氧水平提高至1.0vvm直至发酵结束，在发酵100h时停止碳源的补加，使菌体进入饥饿状态迫使其进行油脂的返耗，得到富含DHA的油脂。
表1不同实施例的实施结果列表
Claims (9)
1.一种高产DHA的方法，其特征在于，以裂殖壶菌为发酵菌株，在发酵罐中，采用四阶段供氧工艺发酵生产DHA，第一阶段为发酵0-40h，控制通气量为1.0vvm-2.0vvm；第二阶段为发酵40h–60h，通气量为0.5vvm–1.0vvm；第三阶段为发酵60h–80h，通气量为1.0vvm–2.0vvm；第四阶段为发酵90h–110h时，通气量为1.0vvm–2.0vvm，停止碳源的补加。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述工艺中，发酵罐的搅拌转速为50-200rpm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于发酵培养的温度为28-30℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供氧工艺采用特制的反应器，该反应器采用三层螺旋桨结构，上层及中间层桨叶为任意桨叶组合，底层桨为特殊的微膜曝气推进式叶轮。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述反应器包括风管（3）通过无缝焊接与气盒（2）连接，气盒（2）通过调节螺栓（1）进行高度调节，气盒（2）通过特殊的机械密封（4）与微膜曝气螺旋桨轴（6）连接，微膜曝气螺旋桨轴（6）通过特殊的密封连轴器（8、9）与转动轴（11）连接。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述反应器的微膜曝气螺旋桨轴（6）、膜搅拌桨（5）、密封连轴器（8、9）、通过联轴器固定螺丝（7、10）定位，并与转动轴（11）连接。
7.上述任一权利要求所述的方法，其发酵体系中的气含量为20-25%。
8.上述任一权利要求所述的方法，其发酵体系中的氧传质系数KLa为30-40h-1。
9.上述任一权利要求所述的方法，其发酵体系中的气泡直径为10-100nm。
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