CN105794643B - 地桃花组织培养与快速繁殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物培养技术领域，涉及一种地桃花组织培养与快速繁殖的方法。包括地桃花的消毒、腋芽萌发不定芽的诱导、丛生芽的诱导、不定芽的增殖、再生植株的生根培养、炼苗移栽的步骤。本发明能够不受地桃花种子数量、萌发率和气候限制而快速地获得与母株相同性状的地桃花植株，利于产业化生产。
Description
技术领域
本发明属于植物培养技术领域，涉及一种地桃花组织培养与快速繁殖的方法。
背景技术
地桃花(Urena lobata Linn.)，又名肖梵天花，为锦葵科(Malvaceae)梵天花属(Urena)直立亚灌木状草本，产长江以南各省区，喜生于干热的空旷地、草坡或疏林下。其茎皮富含坚韧的纤维，供纺织和搓绳索，常用为麻类的代用品；其花艳丽，有用作花卉的潜力；其根或全草可入药，名为地桃花，别称天下捶《生草药性备要》、八卦拦路虎《福建民间草药》、假桃花、粘油子《南宁市药物志》、八卦草《闽南民间草药》、迷马桩、野桃花《贵州草药》、梵尚花《广西药用植物图志》、羊带归、虱麻头《广西中药志》、寄马桩、红孩儿、石松毛、牛毛七《四川中药志》、半边月、拔脓膏、大梅花树、野茄子《广西民间常用中药手册》、油玲花、土杜仲、野桐乔、山棋菜《福建中草药》、刀伤药(南川《常用中草药手册》)、肖梵天花、三角风、桃子草《湖南药物志》、刺头婆《常用中草药彩色图谱》、千下锤(江西《草药手册》)、大迷马桩棵、土黄芪、巴巴叶、窝吼《云南中草药》、地马椿《贵州中草药名录》，全年均可采，洗净，鲜用或晒干。其性凉，味甘、辛，具祛风利湿、活血消肿、清热解毒之功效，主治感冒、风湿痹痛、痢疾、泄泻、淋证、带下、月经不调、跌打肿痛、喉痹、疮疖和毒蛇咬伤等症，是我国西南地区少数民族习用草药。已有研究表明，地桃花的化学成分主要为黄酮类、甾醇、鞣质、酚类、糖类、皂苷等。地桃花水提液在体外对大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、普通变形菌(Proteus vulgaris)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)均有一定的抑菌活性。目前，地桃花尚未被《中国药典》收录，但含有地桃花药材的花红片和花红颗粒为2010年版《中国药典》收录品种。
在我国，目前地桃花主要靠种子繁殖，受制于种子数量、萌发率和气候限制，不能得到快速繁殖。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种地桃花组织培养与快速繁殖的方法。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：一种地桃花组织培养与快速繁殖的方法，包括以下步骤：
(1)地桃花的消毒
剪取当年抽出的、带叶的地桃花茎段，刷洗后减去叶片，留若干叶柄，置于洗洁精溶液中搅拌后用流水冲洗0.5h以上，在无菌环境下依次转入到70％的酒精溶液和0.1％HgCl2溶液内浸泡消毒，即为消毒完成的茎段外植体，取出放入已灭菌的湿滤纸上待接种；
(2)腋芽萌发不定芽的诱导
用消毒后的刀具将上一步获得的茎段外植体两端各切除少量茎段，以正常的极性方向接种到添加有6-BA 0-5mg/L，IBA 0-1.0mg/L，AC 0-2.0g/L的1/2MS基本培养基中，接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为25±1℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/m2·s，得腋芽萌发的不定芽；
(3)丛生芽的诱导
将上一步得到的腋芽萌发的不定芽切成带一叶的茎段，以正常的极性方向接种到添加有ZT 0-1.0mg/L，IBA 0-1.0mg/L，CH 0-1.0g/L，AC 0.5-1.0g/L的1/2MS基本培养基中，接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为25±1℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/m2·s，得不定芽丛；14h光/10h暗是指一天光照14h，在黑暗中培养10h，交替进行，以下同。
(4)不定芽的增殖
将上一步诱导获得的不定芽丛从茎段中分离，然后切成2-3株不定芽的芽块，接种到添加有6-BA 0-5.0mg/L，IBA 0-1.0mg/L，CH 0-1.0g/L，AC 0.5-1.0g/L的1/2MS基本培养基中，接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为25±1℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/m2·s；
(5)再生植株的生根培养
切取叶片嫩绿、生长旺盛且2-3cm高的不定芽，插入到添加IBA 0-1.0mg/L，AC0.5-1.0g/L，1/8-1/4MS基本培养基的生根培养基中，接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)，得生根的组培苗；
(6)炼苗移栽
待生根的组培苗的苗高长至5cm以上，根长超过3cm时，将组培苗定植于高压湿热灭菌过的珍珠岩、泥炭重量比为1：1-9的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在15-25℃之间；3d后，揭开薄膜一角，让内外空气相通，适应1d后将薄膜全部揭开，于叶面喷雾以保持湿润，待新叶长出后移栽大田中继续种植。
在上述的地桃花组织培养与快速繁殖的方法中，在步骤(1)中，所述的无菌环境为经紫外线消毒30min以上并开启无菌风的超净工作台，茎段转入70％的酒精溶液中浸泡40s，取出用无菌水冲洗3次，再浸入滴加有吐温-80和1mol/L NaOH溶液的0.1％HgCl2溶液内浸泡消毒9-10min，然后用无菌水充分浸洗3次。
在上述的地桃花组织培养与快速繁殖的方法中，在步骤(2)中，所述的刀具为经过高温灼烧消毒的解剖刀，培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/2，微量元素、铁盐、有机物质、肌醇等含量均与MS基本培养基相同，该培养基中的蔗糖添加量为30.0g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基预先在121℃下高温高压灭菌20min；
在上述的地桃花组织培养与快速繁殖的方法中，在步骤(3)中，培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/2，微量元素、铁盐、有机物质、肌醇等含量均与MS基本培养基相同，该培养基中的蔗糖添加量为30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基预先在121℃下高温高压灭菌20min；
在上述的地桃花组织培养与快速繁殖的方法中，在步骤(4)中，培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/2，微量元素、铁盐、有机物质、肌醇等含量均与MS基本培养基相同，该培养基中的蔗糖添加量为30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基预先在121℃下高温高压灭菌20min；
在上述的地桃花组织培养与快速繁殖的方法中，在步骤(5)中，生根培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/8-1/4，微量元素、铁盐、有机物质等含量均为MS基本培养基的1/4-1/2，而肌醇添加量为0mg/L，该培养基中的蔗糖添加量为10-50g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基预先在121℃下高温高压灭菌20min。
在上述的地桃花组织培养与快速繁殖的方法中，在步骤(6)中，组培苗从组培瓶中取出的方法为：松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量无菌水，以防止培养基干裂、组培苗失水，盖住瓶盖，12h后半挪开瓶盖，再过12h，移走瓶盖，让灯光直照组培苗培养2d；然后将培养基捣碎，夹出组培苗，用流水将残留的琼脂冲洗干净。
在上述的地桃花组织培养与快速繁殖的方法中，步骤(2)中的1/2MS基本培养基中添加了6-BA 2.0mg/L，IBA 0.2mg/L，AC 1.0g/L，步骤(3)中的1/2MS基本培养基中添加了ZT0.5mg/L，IBA 0.2mg/L，CH 0.5-1.0g/L，AC 0.5-1.0g/L，步骤(4)中的1/2MS基本培养基中添加了6-BA 1.0mg/L，IBA 0.3mg/L，CH 0.5g/L，AC 0.5-1.0g/L。
在上述的地桃花组织培养与快速繁殖的方法中，步骤(5)中的1/4MS基本培养基中添加了IBA 0.1-0.2mg/L，AC 0.5-1.0g/L，蔗糖20-30g/L。
在上述的地桃花组织培养与快速繁殖的方法中，步骤(6)的混合基质中珍珠岩与泥炭的重量比为1：3-4，且所用基质均经高压湿热消毒。
与现有的技术相比，本发明的优点在于：能够不受地桃花种子数量、萌发率和气候限制而快速地获得与母株相同性状的地桃花植株，利于产业化生产。
具体实施方式
下述实施例中所用的试剂，如无特殊说明，可以从常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量数据，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1
本实施例提供一种地桃花组织培养与快速繁殖的方法，包括以下步骤：
(1)地桃花的消毒
剪取当年抽出的、带叶的茎段，先用软毛刷于自来水下轻柔刷洗，剪去叶片，仅留少量叶柄，放入添加少量洗洁精的容器内搅拌浸泡2-4min，倒去洗洁精溶液，于流水冲洗0.5h后，转入已经紫外消毒30min以上的超净台中，将茎段转入70％的酒精溶液中浸泡40s，用无菌水冲洗3次，浸入滴加有1滴吐温-80和1滴1mol/L NaOH溶液的0.1％HgCl2溶液内浸泡消毒9-10min，然后用无菌水充分浸洗3次，即为消毒完成的茎段外植体，放入已高温高压灭菌的湿滤纸上待接种；
(2)腋芽萌发不定芽的诱导
将上一步获得的茎段外植体在无菌湿滤纸上用灼烧冷却的解剖刀切去少量的消毒液接触的两端，以正常的极性方向接种到添加有6-BA 2.0mg/L，IBA 0.2mg/L，AC 1.0g/L的1/2MS基本培养基中，该培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/2，微量元素、铁盐、有机物质、肌醇等含量均与MS基本培养基相同，该培养基中的蔗糖添加量为30.0g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20min；接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)，25d后统计发现，腋芽不定芽的诱导率达96％，生长正常；
(3)丛生芽的诱导
将上一步得到的腋芽萌发的不定芽切成带一叶的茎段，以正常的极性方向接种到添加有ZT 0.5mg/L，IBA 0.2mg/L，CH 0.5-1.0g/L，AC 0.5-1.0g/L的1/2MS基本培养基中，该培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/2，微量元素、铁盐、有机物质、肌醇等含量均与MS基本培养基相同，该培养基中的蔗糖添加量为30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20min；接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)；25d后统计发现，丛生芽的诱导率为93.5％，诱导出的不定芽数平均为6.5个，茎和叶色正常。
(4)不定芽的增殖
将上一步诱导获得的不定芽丛从茎段中分离，然后切成2-3株不定芽的芽块，接种到添加有6-BA 1.0mg/L，IBA 0.3mg/L，CH 0.5g/L，AC 0.5-1.0g/L的1/2MS基本培养基中，该增殖培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/2，微量元素、铁盐、有机物质、肌醇等含量均与MS基本培养基相同，该培养基中的蔗糖添加量为30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20min；接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)；25d后统计发现，不定芽的增殖倍数为4.6倍，且生长速度快，叶色绿。
(5)再生植株的生根培养
切取叶片嫩绿、生长旺盛且2-3cm高的不定芽，插入到添加IBA 0.1-0.2mg/L，AC0.5-1.0g/L的1/4MS基本培养基中，该生根培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/4，微量元素、铁盐、有机物质等含量均为MS基本培养基的1/2，而肌醇添加量为0mg/L，该培养基中的蔗糖添加量为20-30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20min；接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)；25d后统计发现，无根组培苗的生根率达97.9-98.5％，根粗适中，根数3.2-3.3根，根长4.4-4.6cm。
(6)炼苗移栽
待生根的组培苗的苗高长至5cm以上，根长超过3cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量无菌水，以防止培养基干裂、组培苗失水，但先不移开瓶盖，12h后半挪开瓶盖，再过12h，移走瓶盖，让灯光直照再生植株培养2d；然后小心地将培养基捣碎，夹出再生植株，用流水将残留的琼脂冲洗干净，将植株定植于高压湿热灭菌过的珍珠岩、泥炭重量比为1：3-4的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在15-25℃之间；3d后，揭开薄膜一角，让内外空气相通，适应1d后将薄膜全部揭开，于叶面喷雾以保持湿润。15d后统计后发现，炼苗成活率达96.2-96.4％。
文中涉及的缩略词：
AC 活性炭
6-BA 6-苄氨基腺嘌呤
CH 水解酪蛋白
IBA 吲哚丁酸
ZT 玉米素。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于步骤(2)：将步骤(1)获得的茎段外植体在无菌湿滤纸上用灼烧冷却的解剖刀切去少量的消毒液接触的两端，以正常的极性方向接种到添加有6-BA 0-5mg/L，IBA 0-1.0mg/L，AC 0-2.0g/L的1/2MS基本培养基中，该培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/2，微量元素、铁盐、有机物质、肌醇等含量均与MS基本培养基相同，该培养基中的蔗糖添加量为30.0g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20min；接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)；25d统计后发现，随着BA浓度的提高，不定芽诱导率随之提高，说明6-BA诱导了不定芽的萌发，但高浓度的6-BA会诱导玻璃化现象的发生；随着IBA浓度的升高，不定芽的生长加快，但较高的IBA浓度会促进玻璃化的发生和发展；AC所起的作用为吸附外植体褐化产生的物质，在较低浓度时确实起了良好的作用，但是较高的浓度却会起吸附培养基营养的作用，不利于外植体的生长；从表1来看，添加6-BA 2.0mg/L，IBA 0.2mg/L，AC 1.0g/L的1/2MS基本培养基的不定芽诱导率虽然不是最高的，但是综合不定芽的生长来看却是最好的，其不定芽的诱导率为93.5％，不定芽的生长也表现佳。
表1不同处理对腋芽不定芽诱导的影响
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于步骤(3)：丛生牙的诱导：将步骤(2)得到的腋芽萌发的不定芽切成带一叶的茎段，以正常的极性方向接种到添加有ZT 0-1.0mg/L，IBA 0-1.0mg/L，CH 0-1.0g/L，AC 0.5-1.0g/L的1/2MS基本培养基中，该培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/2，微量元素、铁盐、有机物质、肌醇等含量均与MS基本培养基相同，该培养基中的蔗糖添加量为30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20min；接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)；培养25d后统计发现，随着ZT含量的升高，丛生芽诱导不断提高，不定芽数也随之提高，但ZT浓度过高却容易导致不定芽的水渍化倾向；IBA的作用在于促进不定芽的生长，但同样高浓度的IBA对不定芽的生长也是不利的，植物生长变快，导致茎变细弱，会加重或诱导玻璃化苗的形成。综合来看，以添加有ZT 0.5mg/L，IBA 0.2mg/L，CH 0.5-1.0g/L，AC 0.5-1.0g/L的1/2MS基本培养基的表现最佳，其丛生芽的诱导率为93.5％，不定芽数为6.5，生长快速且叶色正常。
表2不同处理对丛生芽诱导的影响
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于步骤(4)不定芽的增殖：将步骤(3)诱导获得的不定芽丛从茎段中分离，然后切成2-3株不定芽的芽块，接种到添加有6-BA 0-5.0mg/L，IBA0-0.5mg/L，CH 0-1.0g/L，AC 0.5-1.0g/L的1/2MS基本培养基中，该增殖培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/2，微量元素、铁盐、有机物质、肌醇等含量均与MS基本培养基相同，该培养基中的蔗糖添加量为30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20min；接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)；培养25d后统计发现，不定芽的增殖应适当降低6-BA的浓度而提高IBA的浓度，适量的CH有助于不定芽的增殖，从表4可以看出添加有6-BA 1.0mg/L，IBA 0.3mg/L，CH 0.5g/L，AC 0.5-1.0g/L的1/2MS基本培养基中的不定芽增殖效果最好，增殖倍数为4.6，且不定芽生长快，叶色正常。高浓度的6-BA会导致不定芽的玻璃化现象，不利于接下来的生根培养。
表4不同处理对不定芽增殖的影响
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于步骤(5)再生植株的生根培养：切取叶片嫩绿、生长旺盛且2-3cm高的不定芽，插入到添加IBA 0-1.0mg/L，AC 0.5-1.0g/L的1/8-1/4MS基本培养基中，该生根培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/8-1/4，微量元素、铁盐、有机物质等含量均为MS基本培养基的1/4-1/2，而肌醇添加量为0mg/L，该培养基中的蔗糖添加量为10-50g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20min；接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)；25d统计发现，随着MS浓度的降低、IBA浓度的升高或蔗糖含量的下降生根率会随之升高，MS浓度的降低或IBA浓度的降低会使根变细变长，地上部叶色会变差，茎变细变矮，较低浓度的蔗糖会促进生根，但过低的蔗糖浓度会使碳源过少，叶和地上部的生长变弱，蔗糖浓度过高却会影响组培苗的自主营养。综合生根率、地上部和根的生长情况来看，表4列出的含IBA 0.2mg/L，蔗糖30g/L的1/4MS基本培养基表现最好，生根率达97.9％，地上部和根生长良好，而在另一项的实验中发现含IBA 0.2mg/L，蔗糖20g/L的1/4MS基本培养基中的生根率达98.5％，地上部和根的生长同样良好。
表4不同培养基对生根的影响
实施例6
本实施例与实施例1的区别在于步骤(6)炼苗移栽：待生根的组培苗的苗高长至5cm以上，根长超过3cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量无菌水，以防止培养基干裂、组培苗失水，但先不移开瓶盖，12h后半挪开瓶盖，再过12h，移走瓶盖，让灯光直照再生植株培养2d；然后小心地将培养基捣碎，夹出再生植株，用流水将残留的琼脂冲洗干净，将植株定植于高压湿热灭菌过的珍珠岩、泥炭重量比为1：3-4的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在15-25℃之间；3d后，揭开薄膜一角，让内外空气相通，适应1d后将薄膜全部揭开，于叶面喷雾以保持湿润。25d后统计后发现，炼苗成活率为89.8-96.4％，泥炭含量较少，由于有机质含量较低，苗生长得较慢，叶色稍黄，而随着泥炭含量增加，炼苗成活率提高，苗生长速度提高，且叶片颜色也变绿，但当泥炭含量较高而珍珠岩含量较少时，炼苗成活率反而呈现下降趋势，苗的生长速度较慢，而叶色较为浓绿，可能是由于生长变缓后叶绿素积累的原因所致。从数据来看当珍珠岩、泥炭重量比为1：3-4时，炼苗成活率最高，苗生长也最佳。
表5不同基质组分比例对炼苗成活率的影响
对比实施例1至6可知，实施例1为最优选的实施例，实施例1的每个步骤均采用了实施例2至6所述的最佳培养条件，能够获得最高的地桃花植株产量。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
Claims (7)
1.一种地桃花组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)地桃花的消毒
剪取当年抽出的、带叶的地桃花茎段，刷洗后剪去叶片，留若干叶柄，置于洗洁精溶液中搅拌后用流水冲洗0.5h以上，在无菌环境下依次转入到70％的酒精溶液和0.1％HgCl2溶液内浸泡消毒，即为消毒完成的茎段外植体，取出放入已灭菌的湿滤纸上待接种；
(2)腋芽萌发不定芽的诱导
用消毒后的刀具将上一步获得的茎段外植体两端各切除少量茎段，以正常的极性方向接种到1/2MS基本培养基中，接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为25±1℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/m2·s，得腋芽萌发的不定芽；
(3)丛生芽的诱导
将上一步得到的腋芽萌发的不定芽切成带一叶的茎段，以正常的极性方向接种到1/2MS基本培养基中，接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为25±1℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/m2·s，得不定芽丛；
(4)不定芽的增殖
将上一步诱导获得的不定芽丛从茎段中分离，然后切成2-3株不定芽的芽块，接种到1/2MS基本培养基中，接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为25±1℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/m2·s；
(5)再生植株的生根培养
切取叶片嫩绿且2-3cm高的不定芽，插入到添加IBA 0.1-0.2mg/L，AC 0.5-1.0g/L的1/4MS基本培养基中，该生根培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/4，微量元素、铁盐、有机物质等含量均为MS基本培养基的1/2，而肌醇添加量为0mg/L，接好外植体的培养基先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)，得生根的组培苗；
(6)炼苗移栽
待生根的组培苗的苗高长至5cm以上，根长超过3cm时，将组培苗定植于高压湿热灭菌过的珍珠岩、泥炭重量比为1：1-9的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在15-25℃之间；3d后，揭开薄膜一角，让内外空气相通，适应1d后将薄膜全部揭开，于叶面喷雾以保持湿润，待新叶长出后移栽大田中继续种植，
在步骤(2)中，所述的刀具为经过高温灼烧消毒的解剖刀，培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/2，微量元素、铁盐、有机物质、肌醇等含量均与MS基本培养基相同，该培养基中的蔗糖添加量为30.0g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基预先在121℃下高温高压灭菌20min，
步骤(2)中的1/2MS基本培养基中添加了6-BA 2.0mg/L，IBA 0.2mg/L，AC 1.0g/L，步骤(3)中的1/2MS基本培养基中添加了ZT 0.5mg/L，IBA 0.2mg/L，CH 0.5-1.0g/L，AC 0.5-1.0g/L，步骤(4)中的1/2MS基本培养基中添加了6-BA 1.0mg/L，IBA 0.3mg/L，CH 0.5g/L，AC 0.5-1.0g/L。
2.根据权利要求1所述的地桃花组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述的无菌环境为经紫外线消毒30min以上并开启无菌风的超净工作台，茎段转入70％的酒精溶液中浸泡40s，取出用无菌水冲洗3次，再浸入滴加有吐温-80和1mol/L NaOH溶液的0.1％HgCl2溶液内浸泡消毒9-10min，然后用无菌水充分浸洗3次。
3.根据权利要求1所述的地桃花组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于，在步骤(3)中，培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/2，微量元素、铁盐、有机物质、肌醇等含量均与MS基本培养基相同，该培养基中的蔗糖添加量为30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基预先在121℃下高温高压灭菌20min。
4.根据权利要求1所述的地桃花组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于，在步骤(4)中，培养基的大量元素含量为MS基本培养基的1/2，微量元素、铁盐、有机物质、肌醇等含量均与MS基本培养基相同，该培养基中的蔗糖添加量为30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基预先在121℃下高温高压灭菌20min。
5.根据权利要求1所述的地桃花组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于，在步骤(6)中，组培苗从组培瓶中取出的方法为：松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量无菌水，以防止培养基干裂、组培苗失水，盖住瓶盖，12h后半挪开瓶盖，再过12h，移走瓶盖，让灯光直照组培苗培养2d；然后将培养基捣碎，夹出组培苗，用流水将残留的琼脂冲洗干净。
6.根据权利要求1所述的地桃花组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于，步骤(5)中的1/4MS基本培养基中添加了IBA 0.1-0.2mg/L，AC 0.5-1.0g/L，蔗糖20-30g/L。
7.根据权利要求1所述的地桃花组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于，步骤(6)的混合基质中珍珠岩与泥炭的重量比为1：3-4，且所用基质均经高压湿热消毒。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1883258A (zh) * | 2006-07-07 | 2006-12-27 | 大连民族学院 | 一种建立海滨锦葵再生体系的方法 |
| CN101715729A (zh) * | 2009-12-29 | 2010-06-02 | 江西农业大学 | 黄蜀葵组培快繁方法 |
-
2016
- 2016-04-07 CN CN201610211475.4A patent/CN105794643B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN1883258A (zh) * | 2006-07-07 | 2006-12-27 | 大连民族学院 | 一种建立海滨锦葵再生体系的方法 |
| CN101715729A (zh) * | 2009-12-29 | 2010-06-02 | 江西农业大学 | 黄蜀葵组培快繁方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 不同植物生长调节剂对黄秋葵组织培养的影响;孙骏威等;《北方园艺》;20121231(第07期);第139-141页，尤其是第1节及第2.1-2.3节 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| CN105794643A (zh) | 2016-07-27 |
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