CN105792843A - 佐剂组合物及包含其的疫苗组合物、以及它们的制造方法 - Google Patents
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Abstract
通过本发明,可提供安全性高、并且可有效地诱导CTL的载体。本发明提供一种佐剂组合物,其包含pH敏感性载体、和具有活化固有免疫的刺激的物质。
Description
技术领域
本发明涉及佐剂组合物及包含其的疫苗组合物、以及它们的制造方法。
背景技术
免疫系统是排除侵入机体内的异物、异常细胞等从而保护机体免受疾病等的侵害的防御机构。
免疫系统的功能通常介由体液免疫及细胞免疫这2种机制而呈现。
体液免疫的免疫应答通常如下所述地呈现。即,侵入机体内的细菌等外源性抗原通过内吞(endocytosis)而被摄入至抗原呈递细胞中,在抗原呈递细胞内的核内体(endosome)中被蛋白分解酶消化,从而被分解成肽片段。该肽片段与主要组织相容性基因复合体(MHC)II类(MHCclassII)分子结合,所得到的复合体在抗原呈递细胞的表面被呈递至CD4阳性T细胞,将CD4阳性T细胞活化。而后,被活化的CD4阳性T细胞进行细胞因子的释放等,由此,最终从B细胞中产生抗体。需要说明的是,上述MHCII类分子在巨噬细胞、树突状细胞、活化T细胞、B细胞等中表达。
另一方面,细胞免疫的免疫应答通常如下所述地呈现。即,在病毒感染细胞、癌细胞中产生的蛋白质等内源性抗原被泛素化,然后通过蛋白酶体的作用而被分解成肽。分解成的肽与MHCI类(MHCclassI)分子结合,所得到的复合体在抗原呈递细胞的表面被呈递至CD8阳性T细胞,将CD8阳性T细胞活化。而后,被活化的CD8阳性T细胞分化成细胞毒性T细胞(CTL)。需要说明的是,上述MHCI类分子存在于几乎所有的有核细胞及血小板的细胞表面。
另外,担负细胞免疫功能的CTL由于可排除病毒感染细胞、癌细胞而特别受到关注。近年来,尝试了有关利用外源性抗原进行CTL的诱导的所谓交叉呈递(crosspresentation)的研究。更详细而言,如上所述,外源性抗原在抗原呈递细胞内的核内体内被分解,与MHCII类分子结合。然而,在交叉呈递中,使(可以是部分量的)外源性抗原通过细胞膜或核内体的膜而转移至细胞质基质内,由此,已转移至细胞质基质内的外源性抗原像内源性抗原那样发挥作用,最终与MHCI类分子结合,从而诱导CTL。
在交叉呈递中,外源性抗原需要通过核内体的膜,对此进行了多种研究。例如,非专利文献1中记载了使用pH敏感性的聚(丙烯酸丙酯)(PPAA)共轭体将抗原高效地输送至细胞质基质内。另外,非专利文献2中记载了用于癌免疫疗法的基于纳米粒子的疫苗递送(vaccinedelivery)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:BioconjugChem.2009Feb.20(2):241-248
非专利文献2:ImmuneNetw.2013Oct13(5)177-183
发明内容
从以治疗为目的的疫苗开发的观点考虑,强烈希望实现担负细胞免疫功能的CTL的诱导,虽然积极地进行了佐剂分子的探索和改良,但诱导CTL的效果仍不能说是充分的。
另外,在以CTL的强力诱导为目的而着眼于交叉呈递的研究例中,使用了新型的合成材料、或病毒的成分的例子较多,从安全性的观点出发令人担忧。
因此,本发明的目的在于提供安全性高、并且能有效地诱导CTL的载体。
本申请的发明人进行了深入研究。结果发现,通过在对pH具有敏感性的载体中并用具有活化固有免疫的刺激的物质,可解决上述课题,从而完成了本发明。
即,本发明的上述目的可通过以下手段达成。
(1)佐剂组合物,包含pH敏感性载体、和具有活化固有免疫的刺激的物质;
(2)如(1)所述的佐剂组合物,其中,上述pH敏感性载体表现促进膜破坏功能的效果,且包含下述物质:
选自脱氧胆酸、胆酸、熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、高级胆汁酸、甘氨脱氧胆酸、甘草酸、甘草亭酸及它们的盐中的至少1种pH敏感性化合物,和
选自碳原子数10~12的磷脂酰胆碱、碳原子数12~18的聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯、碳原子数16~18的山梨糖醇酐脂肪酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油及α-生育酚中的至少1种两亲性物质;
(3)如(1)或(2)所述的佐剂组合物,其中,上述具有活化固有免疫的刺激的物质为单磷酰脂质A;
(4)如(2)或(3)所述的佐剂组合物,其中,相对于100mol上述两亲性物质,上述具有活化固有免疫的刺激的物质的含量为0.0227~22.7mol;
(5)疫苗组合物,包含抗原及(1)~(4)中任一项所述的佐剂组合物;
(6)如(5)所述的疫苗组合物,其中,上述抗原为肽或蛋白质;
(7)如(5)或(6)所述的疫苗组合物,其中,相对于100nmol上述两亲性物质,上述抗原的含量为3.2~400μg;
(8)佐剂组合物的制造方法,包括使pH敏感性化合物和两亲性物质和具有活化固有免疫的刺激的物质缔合的工序,
所述pH敏感性化合物为选自脱氧胆酸、胆酸、熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、高级胆汁酸、甘氨脱氧胆酸、甘草酸、甘草亭酸及它们的盐中的至少1种,
所述两亲性物质为选自碳原子数10~12的磷脂酰胆碱、碳原子数12~18的聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯、碳原子数16~18的山梨糖醇酐脂肪酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油及α-生育酚中的至少1种;
(9)疫苗组合物的制造方法,包括以下工序:
使pH敏感性化合物和两亲性物质和具有活化固有免疫的刺激的物质缔合的工序;
在通过上述缔合而得到的缔合体中混合抗原的工序;
将通过上述混合而得到的混合物冷冻融化的工序;以及
将通过上述冷冻融化而得到的融化物冷冻干燥的工序,
所述pH敏感性化合物为选自脱氧胆酸、胆酸、熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、高级胆汁酸、甘氨脱氧胆酸、甘草酸、甘草亭酸及它们的盐中的至少1种,
所述两亲性物质为选自碳原子数10~12的磷脂酰胆碱、碳原子数12~18的聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯、碳原子数16~18的山梨糖醇酐脂肪酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油及α-生育酚中的至少1种。
附图说明
图1为本发明的一个实施方式涉及的佐剂组合物及包含其的疫苗组合物的模式图。
图2为基于ELIspot法(enzymelinkedimmunospotassay,酶联免疫斑点法)的CTL诱导的评价结果。(A)为评价IFNγ的斑点(spot)形成数的图表,(B)为单独使用了肽时的斑点形成情况,(C)为使用了肽和含有MPL的DLPC-脱氧胆酸复合体(佐剂组合物)时的斑点形成情况。评价条件为2×106个细胞/孔。
图3为基于细胞内细胞因子染色(IntracellularCytokineStaining)(ICS)法的CTL诱导率的评价结果。(A)为单独使用了肽时的结果,(B)为使用了肽和MPL分散液时的结果,(C)为使用了肽和含有单磷酰脂质A(MPL)的DLPC-脱氧胆酸复合体(佐剂组合物)时的结果。
图4为使用了利用各种制备方法制备的疫苗组合物的情况下的CTL诱导率的评价结果。(A)为使用了含有MPL的DLPC-脱氧胆酸复合体(分散制备法)时的结果,(B)为使用了含有MPL的DLPC-脱氧胆酸复合体(混合制备法)时的结果,(C)为使用了含有MPL的DLPC-脱氧胆酸复合体(冷冻融化-冷冻干燥制备法)时的结果。
图5为整合率的评价结果。(A)为表示肽溶液的过滤前后的、Lowrry法的吸光度的图表,(B)为表示佐剂组合物的过滤前后的、基于磷脂TestWako(PhospholipidTestWako)的吸光度的图表。(C)为评价各种疫苗组合物中的整合率的结果。
图6为用于进行评价体系的确认的、进行活化固有免疫的刺激的评价的图。(A)为未经染色地评价经培养的小鼠脾细胞的流式细胞术(flowcytometry)的结果,(B)及(C)为对PBS单独时、添加了LPS时的CD80的表达增强进行确认的结果,(D)为汇总了以各种浓度添加了LPS时的流式细胞术的结果的图表,(E)及(F)为对作为其他辅助刺激分子的CD86、及CD40的表达增强进行确认的结果。
图7(A)为评价CD80的产生增强的结果,(B)及(C)为评价作为其他指标的CD86、CD40的表达增强的结果。
图8为考察各种材料中有无活化固有免疫的刺激的结果。(A)为以各种量添加不含MPL的DLPC-脱氧胆酸复合体并考察CD80的产生增强的结果,(B)为在经培养的小鼠脾细胞中添加各种样品溶液并考察CD80的产生增强的结果。
图9(A)为施予了相当于MPL含有率0.227的量的MPL时的溶出率,(B)为含有MPL的DLPC-脱氧胆酸复合体在各pH条件下的溶出率,(C)为改变MPL的含量时的DLPC-脱氧胆酸复合体在pH7.4和pH5.0时的溶出率的结果。
图10为考察通过分散制备法、混合制备法、冷冻融化-冷冻干燥制备法制备的疫苗组合物的pH7.4和pH5.0的溶出率的结果。
图11为在各种脱氧胆酸复合化量下考察含有MPL对佐剂组合物的促进膜破坏功能的效果的影响的结果。(A)为复合化量为10时的结果,(B)为复合化量为20时的结果,(B)为复合化量为640时的结果。
图12为考察含有MPL对佐剂组合物的促进膜融合的效果的影响的结果。
图13为考察抗原量对疫苗组合物的固有免疫活化的影响的结果。(A)为使用了肽时的结果,(B)为使用了OVA时的结果。
图14为考察两亲性物质对佐剂组合物的活化固有免疫的刺激的影响的结果。
图15为考察pH敏感性化合物的复合化对佐剂组合物、及疫苗组合物的活化固有免疫的刺激的强度的影响的结果。(A)为MPL含有率为0.0227时的、使用各种复合化量的脱氧胆酸进行制备时的结果,(B)为MPL含有率为22.7时的、使用各种复合化量的脱氧胆酸进行制备时的结果。
图16为考察pH敏感性化合物的种类对疫苗组合物的活化固有免疫的刺激的强度的影响的结果。(A)为MPL含有率为0.0227时的、使用各种pH敏感性化合物进行制备时的结果,(B)为MPL含有率为22.7时的、使用各种pH敏感性化合物进行制备时的结果。
图17为使用了疫苗组合物时的、ELIspot法的评价结果。(A)为在高MPL的条件下、使用了肽和MPL分散液时的斑点形成情况,(B)为在高MPL的条件下、使用了肽和佐剂组合物时的斑点形成情况。评价条件为1×106个细胞/孔。
图18使用各种pH敏感性化合物制备的疫苗组合物的、ELIspot法的评价结果。抗原使用OVA,作为刺激固有免疫的物质、或佐剂组合物,(A)为使用了MPL分散液时的斑点形成情况,(B)为使用了含有MPL的DLPC-脱氧胆酸时的斑点形成情况,(C)为使用了含有MPL的DLPC-胆酸时的斑点形成情况,(D)为使用了含有MPL的DLPC-熊脱氧胆酸时的斑点形成情况,(E)为使用了含有MPL的DLPC-猪脱氧胆酸时的斑点形成情况。评价条件为2×106个细胞/孔。
图19为表示各制备方法中制备的疫苗组合物的CTL诱导率的图表。
图20为评价通过疫苗组合物诱导的CTL的抗原特异性的结果。(A)为施加抗原的再刺激时的CTL诱导率,(B)为不施加抗原的再刺激时的CTL诱导率。
图21为评价CTL的抗原特异性的ELIspot法的评价结果。(A)~(F)为存在再刺激时的斑点形成情况,(G)~(L)为不存在再刺激时的斑点形成情况。作为施予小鼠的施予物,(A)和(G)为使用了80μg的OVA和MPL分散液时的结果,(B)和(H)为使用了80μg的OVA、和用160nmol的脱氧胆酸制备的佐剂组合物时的结果,(C)和(I)为使用了80μg的OVA、和用640nmol的脱氧胆酸制备的佐剂组合物时的结果,(D)和(J)为使用了80μg的肽和MPL分散液时的结果,(E)和(K)为使用了80μg的肽、和用160nmol的脱氧胆酸制备的佐剂组合物时的结果,(F)和(L)为使用了80μg的肽、和用640nmol的脱氧胆酸制备的佐剂组合物时的结果。评价条件为2×106个细胞/孔。
图22为表示使用了各制备方法中制备的疫苗组合物时的IgG抗体效价(antibodytiter)的图表。
图23为使用了CpG-ODN时的、ELIspot法的评价结果。(A)为向小鼠施予80μg的OVA和单独CpG-ODN时的斑点形成情况,(B)为使用了80μg的OVA、和包含CpG-ODN的佐剂组合物时的斑点形成情况,(C)为未施加抗原的再刺激时的、向小鼠施予80μg的OVA和单独CpG-ODN时的斑点形成情况,(D)为未施加抗原的再刺激时的、使用了80μg的OVA、和包含CpG-ODN的佐剂组合物时的斑点形成情况。
具体实施方式
根据本发明的一个实施方式,可提供包含pH敏感性载体、和具有活化固有免疫的刺激的物质的佐剂组合物。通过上述佐剂组合物,可提供能够有效地诱导CTL的载体。另外,通过该佐剂组合物,可提供安全性高的载体。
<佐剂组合物>
本方式涉及的佐剂组合物包含pH敏感性载体(以下,有时简称为“载体”、“缔合体”、或“复合体”)、和具有活化固有免疫的刺激的物质。
另外,本方式涉及的佐剂组合物中,pH敏感性载体表现促进膜破坏功能的效果,且包含下述物质:选自脱氧胆酸、胆酸、熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、高级胆汁酸、甘氨脱氧胆酸、甘草酸、甘草亭酸及它们的盐中的至少1种pH敏感性化合物,和选自碳原子数10~12的磷脂酰胆碱、碳原子数12~18的聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯、碳原子数16~18的山梨糖醇酐脂肪酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油及α-生育酚中的至少1种两亲性物质。
以下,参照附图来说明本实施方式,但本发明的技术范围应当基于权利要求书的记载而确定,并不仅限于以下的形态。需要说明的是,附图的尺寸比率有时为了便于说明而进行了夸张处理,与实际比率不同。
图1为本发明的一个实施方式涉及的佐剂组合物及包含其的疫苗组合物的模式图。
根据图1,佐剂组合物4包含两亲性物质1、pH敏感性化合物2、和具有活化固有免疫的刺激的物质3。如图1所示,根据一个实施方式,具有活化固有免疫的刺激的物质3与pH敏感性化合物2一同缔合于两亲性物质1构成的疏水性部分。这种情况下,佐剂组合物4也可称为佐剂复合体。另外,根据另一实施方式,具有活化固有免疫的刺激的物质3与包含两亲性物质1和pH敏感性化合物2的pH敏感性载体独立地存在。
另外,疫苗组合物6包含佐剂组合物4、和抗原5。如图1所示那样,抗原5可被包含在上述2种形态的佐剂组合物4中,也可独立存在。其中,尤其是对于在佐剂复合体4中包含抗原5的疫苗组合物6而言,也可称为疫苗复合体。
本说明书中,“佐剂组合物”是指包含pH敏感性载体及具有活化固有免疫的刺激的物质的组合物,对其形态没有特别限制。即,“佐剂组合物”可以是将pH敏感性载体及具有活化固有免疫的刺激的物质混合而成的组合物,也可以是在pH敏感性载体中担载或包含具有活化固有免疫的刺激的物质而成的复合体(佐剂复合体),本说明书中,将两者统称为“佐剂组合物”。
另外,本说明书中,“疫苗组合物”是指包含佐剂组合物及抗原的组合物,对其形态没有特别限制。即,对于“疫苗组合物”而言,可以是将选自由佐剂组合物的构成要素及抗原组成的组中的2种以上混合而成的组合物,也可以是在佐剂复合体中担载或包含抗原而成的复合体(疫苗复合体),本说明书中,将两者统称为“疫苗组合物”。
[pH敏感性载体]
pH敏感性载体具有相对于pH的敏感性,具有下述功能:在pH成为酸性时,能将细胞内的抗原输送至细胞质基质内。
作为pH敏感性载体,没有特别限制,优选的是,表现促进膜破坏功能的效果,且包含下述物质:选自脱氧胆酸、胆酸、熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、高级胆汁酸、甘氨脱氧胆酸、甘草酸、甘草亭酸及它们的盐中的至少1种pH敏感性化合物,和选自碳原子数10~12的磷脂酰胆碱、碳原子数12~18的聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯、碳原子数16~18的山梨糖醇酐脂肪酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油及α-生育酚中的至少1种两亲性物质。需要说明的是,本说明书中,两亲性物质中的“碳原子数”是指,构成两亲性物质的疏水部的脂肪酸成分(酰基)的碳原子数。
以下,对上述的包含pH敏感性化合物及两亲性物质的、表现促进膜破坏功能的效果的pH敏感性载体详细进行说明。
(pH敏感性载体的结构)
认为pH敏感性载体是在生理pH以上时pH敏感性化合物与两亲性物质缔合而形成的。更详细而言,认为pH敏感性载体是pH敏感性化合物缔合于两亲性物质所构成的疏水性部分而形成的。需要说明的是,pH敏感性载体的该缔合形式是推测的,pH敏感性载体不限于该缔合形式。
(促进膜破坏功能的效果)
“膜破坏功能”是指在溶出性试验中发生溶出的功能。此处,本说明书中的溶出性试验是指下述试验:将包封有含消光物质和荧光物质的水溶液的脂质体(分散液)、和评价样品分散液添加到已调节成规定的pH的水溶液中,于37℃孵育该水溶液90分钟或30分钟,然后测定该水溶液的荧光。通过该方法,可测定从脂质体溶出的荧光物质量,可确认pH敏感性载体对脂质体的膜破坏功能。需要说明的是,关于溶出性试验,在后述的实施例中详细进行说明。
另外,“表现促进膜破坏功能的效果”是指满足以下两者:(1)在溶出性试验中,与生理pH条件下的溶出率相比,低于生理pH的规定的pH条件下的溶出率上升,并且其上升幅度大于单独使用pH敏感性化合物进行实验时的上升幅度;以及,(2)在该低于生理pH的规定的pH条件下的溶出性试验中,pH敏感性化合物与两亲性物质形成复合体(pH敏感性载体)时的溶出率大于pH敏感性化合物单独的溶出率与两亲性物质单独的溶出率之和。更具体而言,表现促进膜破坏功能的效果是指,在pH7.4、和pH5.0或pH4.5的溶出性试验中,pH敏感性载体(pH敏感性化合物与两亲性物质的复合体)的溶出率Lc、与pH敏感性化合物单独的溶出率La和两亲性物质单独的溶出率Lb满足下述两种关系。即,上述(1)由下式(1)表示,上述(2)由下式(2)表示。需要说明的是,下式中,将pH7.4的溶出率分别表示为Lc7.4、La7.4、Lb7.4,将pH5.0或4.5的溶出率分别表示为Lcx、Lax、Lbx。
式(1)Δ=(Lcx-Lc7.4)-(Lax-La7.4)>0
式(2)Δ’=Lcx-(Lax+Lbx)>0
上式(1)中,Δ超过0即可,优选为5以上,更优选为10以上,进一步优选为30以上。另外,上式(2)中,Δ’超过0即可,优选为5以上,更优选为10以上,进一步优选为15以上。
本发明的一个实施方式中,上式(1)及上式(2)中的Δ及Δ’分别为5以上,并且,包含胆汁酸及脂质的pH敏感性载体是优选的。另外,本发明的另一实施方式中,上式(1)及上式(2)中的Δ及Δ’分别为5以上,并且,包含甘草酸或甘草亭酸及脂质的pH敏感性载体是优选的。
此处,本说明书中,“生理pH”是指正常组织、正常体液中的pH。生理pH通常为7.4,根据正常组织、正常体液的不同而存在少许差异(±0.1)。另外,所谓“低于生理pH的规定的pH”,低于pH7.4即可,优选为pH3.0以上且低于pH7.4,更优选为pH4.0以上且低于pH7.3,进一步优选为pH4.5以上且低于pH7.0。
pH敏感性载体表现促进膜破坏功能的效果的机制尚不明确,但可推测如下。需要说明的是,本发明不受下述推测的限制。
对于pH敏感性载体而言,认为在周边环境的pH低于生理pH时,pH敏感性化合物与两亲性物质的缔合形态发生变化,结果,具有促进膜破坏功能的效果。例如,推测在存在有pH敏感性载体、和生物膜(例如,细胞膜、小泡膜等)的体系中,pH成为低于生理pH的值时,pH敏感性载体的缔合形态发生变化,在与生物膜接触后,因该变化而诱发生物膜的膜结构也发生变化。即,pH敏感性载体诱发生物膜的膜结构变化。认为其原因在于,由于pH变成弱酸性,因而pH敏感性载体中的pH敏感性化合物在该载体的结构中变得不稳定,结果,pH敏感性载体与存在于体系内的生物膜重新排列,表现促进膜破坏功能的效果。另外,换言之,认为pH敏感性化合物是下述分子:pH变成弱酸性时,由于质子化的作用而使其在疏水性的缔合中的溶解性发生变化。即,可以认为,包含pH敏感性化合物的疏水性的缔合能响应弱酸性环境而表现出功能。需要说明的是,“膜破坏”是指如上所述的膜结构的变化,膜构成成分可以不全部分离或分解。通过产生这样的“膜破坏”,从而,可在生物膜(例如,核内体)的膜内部含有的成分向生物膜的外部(例如,细胞质基质)溶出等。
对于pH敏感性载体而言,优选的是,pH为7.4时,溶出性试验中的溶出率小于20%,并且,pH为4.0时,溶出性试验中的溶出率大于20%。另外,更优选的是,pH为6.5时,溶出性试验中的溶出率小于20%,并且,pH为4.0时,溶出性试验中的溶出率大于20%。另外,上述中,pH为7.4时或pH为6.5时的溶出率更优选为15%以下,进一步优选为10%以下。另外,pH为4.0时的溶出率更优选为40%以上,进一步优选为50%以上。通过使pH敏感性载体的溶出率为上述范围,可进一步促进表现:弱酸性pH条件下的促进膜破坏功能的效果。
另外,pH敏感性载体不仅表现促进膜破坏功能的效果,而且也可表现促进膜融合功能的效果。
本发明中,“膜融合功能”是指在膜融合试验中发生膜融合的功能。此处,本说明书中的膜融合试验是指下述试验:将在双分子膜中整合有2种荧光物质的脂质体(分散液)、和评价样品分散液添加到已调节成规定的pH的水溶液中,于37℃孵育该水溶液60分钟,然后测定该水溶液的荧光。通过该方法,可测定在脂质体中整合的2种荧光物质的能量共振转移的变化,可确认pH敏感性载体的膜融合功能。需要说明的是,关于膜融合试验,在后述的实施例中详细说明。
另外,“表现促进膜融合功能的效果”是指,在膜融合试验中满足下述条件:与生理pH条件下的融合率相比,低于生理pH的规定的pH条件下的融合率上升,而且其上升幅度比用pH敏感性化合物单独进行实验时的上升幅度大。更具体而言,表现促进膜融合功能的效果是指,在pH7.4和pH5.0的膜融合试验中,pH敏感性载体(pH敏感性化合物与两亲性物质的复合体)的融合率Rc(%)与pH敏感性化合物单独的融合率Ra(%)满足下式(3)的关系。需要说明的是,下式中,pH7.4的融合率分别表示为Rc7.4、Ra7.4,pH5.0的融合率分别表示为Rcx、Rax。
式(3)ΔR=(Rcx–Rc7.4)–(Rax–Ra7.4)>0
上式(3)中,ΔR超过0即可,优选为2以上,更优选为5以上,进一步优选为10以上。
优选的是,为上式(3)中ΔR为2以上的pH敏感性载体,并且该载体包含胆汁酸和脂质。
在弱酸性pH(低于生理pH的规定的pH)条件下,pH敏感性载体表现促进膜融合功能的效果。其机制尚不明确,但可考虑与上述的促进膜破坏功能的效果为同样的机制。需要说明的是,本发明不受该推测的限制。
即,可推测对于本发明的pH敏感性载体而言,周边环境低于生理pH时,pH敏感性化合物与两亲性物质的缔合形态发生变化,与存在于体系内的生物膜重新排列,从而进行膜融合。此时,对于膜融合而言,相互具有亲和性的成分彼此重新排列,因此,与生物膜不具有亲和性的、或亲和性低的成分(例如,抗原)从重新排列的膜中被排除、释出。
如上所述,通常,抗原被作为生物膜之一的核内体(endosome)包围,被细胞(抗原呈递细胞等)摄取。然后,由于质子泵的作用,核内体内部的pH降低。进而,核内体与包含水解酶的溶酶体融合,抗原被分解(然后,可与MHCII类分子形成复合体,向CD4阳性T细胞呈递抗原)。因此,几乎所有的抗原均未被递送至细胞质基质内。
与此相对,使用本方式涉及的pH敏感性载体时,可将抗原(例如,外源性抗原)递送至细胞质基质内。更详细而言,抗原与pH敏感性载体一同被核内体包围,被摄取到细胞中时,同样地被导入至pH已降低的环境中。而后,随着pH的降低(酸性化),pH敏感性化合物使得pH敏感性载体不稳定,在核内体与pH敏感性载体之间发生膜的重新排列。结果,发生基于pH敏感性载体的膜破坏功能(根据情况与膜融合功能一同表现的膜破坏功能)。伴随着该膜破坏功能(或膜融合功能及膜破坏功能),抗原可被从核内体递送至细胞质基质内。需要说明的是,根据上述机制,原则上,抗原只要与pH敏感性载体一同被核内体摄取,就可被输送至细胞质基质内,因此,应当理解,可以以将抗原与pH敏感性载体混合而得到的组合物的形态使用,也可以以抗原被pH敏感性载体担载或包含的形态使用。
(pH敏感性化合物)
如上所述,pH敏感性化合物为选自脱氧胆酸、胆酸、熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、高级胆汁酸、甘氨脱氧胆酸、甘草酸、甘草亭酸及它们的盐中的至少1种。作为pH敏感性化合物的盐,没有特别限制,可举出锂、钠、钾等碱金属盐;镁、钙、钡等碱土金属盐;铵盐等。这些pH敏感性化合物可单独使用,也可并用使用2种以上。
根据本发明的一个实施方式,pH敏感性化合物优选为选自脱氧胆酸、胆酸、熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘草酸、及它们的盐中的至少1种。
另外,根据本发明的另一实施方式,pH敏感性化合物优选为选自脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘草酸或它们的盐中的至少1种,更优选为选自脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、甘草酸或它们的盐中的至少1种。
可优选用作pH敏感性化合物的脱氧胆酸、胆酸、熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、高级胆汁酸及甘氨脱氧胆酸统称为胆汁酸。胆汁酸作为代表性的甾体衍生物在二十世纪20年代以前就已为人所知,在细菌学的领域中利用。胆汁酸具有在人的机体内与胆固醇(cholesterol)、脂质、脂溶性维生素形成复合体而辅助其吸收的作用。另外,根据物理化学性质,可形成与脂质、蛋白质、疏水性材料的复合体,因此,很早以前就开始用于蛋白质的分离纯化、增溶剂、乳化剂。最近,在疫苗的制造工序的用途中,作为借助胆汁酸转运蛋白的药剂吸收促进剂也受到关注。尤其是,脱氧胆酸钠(别名去氧胆酸钠)和熊脱氧胆酸(别名熊去氧胆酸)作为可向人注射的医药品添加物具有实际成效,优异的安全性得到认可。因此,作为pH敏感性化合物,进一步优选使用脱氧胆酸、熊脱氧胆酸或其盐(例如钠盐)。
对于pH敏感性化合物而言,相对于100mol两亲性物质,优选以10mol以上的比例含有pH敏感性化合物,更优选以10~640mol的比例含有pH敏感性化合物,进一步优选以20~320mol的比例含有pH敏感性化合物,特别优选以20~160mol的比例含有pH敏感性化合物。需要说明的是,本说明书中,也将pH敏感性化合物的、相对于100mol两亲性物质的含量称为“pH敏感性化合物的复合化量”。
(两亲性物质)
如上所述,两亲性物质为选自碳原子数10~12的磷脂酰胆碱、碳原子数12~18的聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯、碳原子数16~18的山梨糖醇酐脂肪酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油及α-生育酚中的至少1种。这些两亲性物质可单独使用,也可并用使用2种以上。
需要说明的是,本说明书中,两亲性物质中的“碳原子数”是指,构成两亲性物质的疏水部的脂肪酸成分(酰基)的碳原子数。
作为碳原子数10~12的磷脂酰胆碱,优选为具有饱和酰基的二酰基磷脂酰胆碱,例如,可举出二癸酰基磷脂酰胆碱(DDPC;1,2-二癸酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC;1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱)。这些中,作为磷脂酰胆碱,可以为天然来源,也可利用已知的方法合成,另外也可使用市售产品。
作为碳原子数12~18的聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯,可举出聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐肉豆蔻酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯等。作为聚氧乙烯的聚合度,没有特别限制,加成至山梨糖醇酐的聚氧乙烯链的合计的聚合度优选为10~200,更优选为15~100,进一步优选为20~50。聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯可使用合成品,也可使用市售品。作为聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯的市售品,例如,可优选使用作为Tween20(聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯)、Tween40(聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯)、Tween60(聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯)、Tween80(聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)而销售的产品。这些中,优选使用碳原子数16~18的聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯(Tween20、Tween40、Tween60、Tween80)。
作为碳原子数16~18的山梨糖醇酐脂肪酸酯,可举出山梨糖醇酐单棕榈酸酯、山梨糖醇酐单硬脂酸酯、山梨糖醇酐单油酸酯等山梨糖醇酐单脂肪酸酯;山梨糖醇酐三棕榈酸酯、山梨糖醇酐三硬脂酸酯、山梨糖醇酐三油酸酯等山梨糖醇酐三脂肪酸酯等。山梨糖醇酐脂肪酸酯可使用合成品,也可使用市售品。作为山梨糖醇酐脂肪酸酯的市售品,例如,可优选使用作为Span40(山梨糖醇酐棕榈酸酯)、Span60(山梨糖醇酐硬脂酸酯)、Span80(山梨糖醇酐油酸酯)、Span65(山梨糖醇酐三硬脂酸酯)、Span85(山梨糖醇酐三油酸酯)而销售的产品。这些中,优选使用Span80、Span65、Span85。
单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯是1分子或2分子脂肪酸以酯键与甘油键合而得到的酰基甘油,脂肪酸所键合的部位没有特别限制。例如,如果是作为单酰基甘油的单油酸甘油酯,则脂肪酸可以以酯键键合于甘油的C1位或C2位。另外,如果是作为二酰基甘油的二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯,则脂肪酸以酯键键合于甘油的C1位及C2位、或C1位及C3位即可。例如,作为二月桂酸甘油酯,优选C1位及C3位被取代的α、α’-二月桂酸酯。作为二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯,优选C1位及C2位被取代的二酰基甘油。作为这些甘油衍生物,可使用合成品,也可使用市售品。
聚氧乙烯蓖麻油是在蓖麻油上加成聚氧乙烯而得到的物质。作为聚氧乙烯的聚合度,没有特别限制,优选为3~200,更优选为5~100,进一步优选为10~50。聚氧乙烯蓖麻油可使用合成品,也可使用市售品。
作为α-生育酚,可使用天然来源或利用已知方法合成的产品,也可使用市售的产品。
上述的两亲性物质中,优选选自碳原子数10~12的磷脂酰胆碱、聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯、山梨糖醇酐单油酸酯、聚氧乙烯蓖麻油及α-生育酚中,更优选选自二月桂酰基磷脂酰胆碱、二癸酰基磷脂酰胆碱、聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯、山梨糖醇酐单油酸酯、聚氧乙烯蓖麻油及α-生育酚中。
(pH敏感性化合物及两亲性物质的组合)
对于pH敏感性载体而言,通过pH敏感性化合物与两亲性物质的组合,在所期望的pH条件下,可表现促进膜破坏功能的效果。此时,根据pH敏感性化合物与两亲性物质的组合的不同,开始表现pH敏感性载体的促进膜破坏功能的效果的pH不同。认为其原因是,根据pH敏感性化合物的不同,pKa存在差异,而且与两亲性物质的缔合的样式根据pH敏感性化合物与两亲性物质的组合的不同而不同。因此可以说,通过适当变更pH敏感性化合物与两亲性物质的组合,可对表现出功能的pH进行选择,可对递送进行详细设定。
pH敏感性载体中,作为pH敏感性化合物与两亲性物质的组合,优选胆酸及DLPC、脱氧胆酸及DDPC、脱氧胆酸及DLPC、脱氧胆酸及Tween20、脱氧胆酸及Tween40、脱氧胆酸及Tween60、脱氧胆酸及Tween80、脱氧胆酸及Span40、脱氧胆酸及Span60、脱氧胆酸及Span80、脱氧胆酸及Span65、脱氧胆酸及Span85、脱氧胆酸及α-生育酚、脱氧胆酸及单油酸甘油酯、脱氧胆酸及二硬脂酸甘油酯、脱氧胆酸及二油酸甘油酯、脱氧胆酸及二月桂酸甘油酯(α、α’-二月桂酸酯)、脱氧胆酸及聚氧乙烯蓖麻油、鹅脱氧胆酸及DLPC、猪脱氧胆酸及DLPC、甘氨脱氧胆酸及DLPC、熊脱氧胆酸及DDPC、熊脱氧胆酸及DLPC、熊脱氧胆酸及Tween20、熊脱氧胆酸及Tween40、熊脱氧胆酸及Tween60、熊脱氧胆酸及Tween80、熊脱氧胆酸及Span40、熊脱氧胆酸及Span60、熊脱氧胆酸及Span80、熊脱氧胆酸及Span65、熊脱氧胆酸及Span85、熊脱氧胆酸及α-生育酚、熊脱氧胆酸及单油酸甘油酯、熊脱氧胆酸及二硬脂酸甘油酯、熊脱氧胆酸及二油酸甘油酯、熊脱氧胆酸及二月桂酸甘油酯(α、α’-二月桂酸酯)、熊脱氧胆酸及聚氧乙烯蓖麻油、甘草酸及DDPC、甘草酸及DLPC、甘草酸及Tween20、甘草酸及Tween40、甘草酸及Tween60、甘草酸及Tween80、甘草酸及Span40、甘草酸及Span60、甘草酸及Span80、甘草酸及Span65、甘草酸及Span85、甘草酸及α-生育酚、甘草酸及单油酸甘油酯、甘草酸及二硬脂酸甘油酯、甘草酸及二油酸甘油酯、甘草酸及二月桂酸甘油酯(α、α’-二月桂酸酯)、甘草酸及聚氧乙烯蓖麻油。
更优选为胆酸及DLPC、脱氧胆酸及DDPC、脱氧胆酸及DLPC、脱氧胆酸及Tween20、脱氧胆酸及Tween40、脱氧胆酸及Tween60、脱氧胆酸及Tween80、脱氧胆酸及Span40、脱氧胆酸及Span65、脱氧胆酸及Span80、脱氧胆酸及Span85、脱氧胆酸及α‐生育酚、脱氧胆酸及单油酸甘油酯、脱氧胆酸及聚氧乙烯蓖麻油、鹅脱氧胆酸及DLPC、猪脱氧胆酸及DLPC、甘氨脱氧胆酸及DLPC、熊脱氧胆酸及DDPC、熊脱氧胆酸及DLPC、熊脱氧胆酸及Tween40、熊脱氧胆酸及Tween60、熊脱氧胆酸及Tween80、熊脱氧胆酸及Span40、熊脱氧胆酸及Span65、熊脱氧胆酸及Span85、熊脱氧胆酸及α‐生育酚、熊脱氧胆酸及油酸单甘油酯、熊脱氧胆酸及聚氧乙烯蓖麻油、甘草酸及DDPC、甘草酸及DLPC、甘草酸及Tween40、甘草酸及Tween60、甘草酸及Tween80、甘草酸及Span40、甘草酸及Span65、甘草酸及Span85、甘草酸及α-生育酚、甘草酸及单油酸甘油酯、甘草酸及聚氧乙烯蓖麻油。
[具有活化固有免疫的刺激的物质]
具有活化固有免疫的刺激的物质是指,可被结构模式识别受体识别,引导免疫活性细胞活化的物质。
作为具有活化固有免疫的刺激的物质,没有特别限制,优选为针对Toll样受体的激动剂(agonist)。
作为具有活化固有免疫的刺激的物质的具体例,没有特别限制,可举出明矾等矿物盐;氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙等凝胶型佐剂;包含CpG序列(CpGmotifs)的免疫调节性DNA序列、免疫刺激性RNA分子、内毒素(脂多糖(LPS;内毒素)、单磷酰脂质A(MPL:注册商标))、外毒素(霍乱毒素、大肠杆菌(E.coli)热不稳定性毒素、百日咳毒素)、胞壁酰二肽、鞭毛蛋白等微生物佐剂;不完全弗氏佐剂(IFA)等油性佐剂、液体石蜡、羊毛脂等油性佐剂生物降解性微球体(microsphere)、皂苷(QS-21、Quil-A等)、非离子性嵌段共聚物、胞壁肽类似物、聚膦腈、合成多核苷酸(非CpG合成多核苷酸等)、咪唑并喹啉等合成佐剂;DOTAP、DC-Chol、DDA等阳离子性脂质;单链RNA;双链RNA等。这些中,上述具有活化固有免疫的刺激的物质优选为明矾等矿物盐;氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙等凝胶型佐剂;包含CpG序列的免疫调节性DNA序列、免疫刺激性RNA分子、单磷酰脂质A(MPL:注册商标))、外毒素(霍乱毒素、大肠杆菌(E.coli)热不稳定性毒素、百日咳毒素)、鞭毛蛋白等微生物佐剂、皂苷(QS-21、Quil-A等)、合成多核苷酸(非CpG合成多核苷酸等)、咪唑并喹啉等合成佐剂、单链RNA;双链RNA等,更优选为单磷酰脂质A、包含CpG序列的免疫调节性DNA序列。
具有活化固有免疫的刺激的物质可单独使用,也可组合使用2种以上。
具有活化固有免疫的刺激的物质的含量根据使用的具有活化固有免疫的刺激的物质的种类的不同而不同,相对于100mol两亲性物质,优选为0.0227~22.7mol,更优选为0.227~2.27mol。具有活化固有免疫的刺激的物质的含量为0.0227mol以上时,能合适地诱导免疫应答,从这方面考虑是优选的。另一方面,具有活化固有免疫的刺激的物质的含量为22.7mol以下时,可降低成本,从这方面考虑是优选的。
[水性溶剂]
佐剂组合物可包含水性溶剂。
佐剂组合物包含水性溶剂时,可形成pH敏感性载体、具有活化固有免疫的刺激的物质分散在水性溶剂中而成的分散液。
此时,对于pH敏感性载体而言,优选在水性介质中形成包含pH敏感性化合物和两亲性物质的复合体。它们的复合体的形态没有特别限制,pH敏感性化合物与两亲性物质可形成膜,也可以是pH敏感性化合物的一部分或整体通过缔合等被埋入到两亲性物质形成的结构中。另外,优选pH敏感性化合物与两亲性物质形成胶束状的粒子(pH敏感性化合物与两亲性物质通过疏水性相互作用而缔合成粒状而得到的粒子,典型的是单分子膜结构的粒子)。另外,基于吞噬(phagocytosis)、内吞的摄取针对一定尺寸以上的粒子活跃地进行,因此,胶束状的粒子的粒径优选为10~200nm,更优选为10~100nm。需要说明的是,上述胶束状的粒子中,不含形成脂质双分子膜结构(例如,脂质体)的物质。另外,本说明书中,pH敏感性载体的粒径可通过动态光散射法(MALVERNInstruments公司制,NanoZS90)测定。
另外,佐剂组合物优选在水性介质中形成包含形成了复合体的pH敏感性载体、和具有活化固有免疫的刺激的物质的复合体(佐剂复合体)。复合体的形态没有特别限制,优选构成pH敏感性载体的pH敏感性物质及两亲性物质、与具有活化固有免疫的刺激的物质形成胶束状的粒子。该胶束状的粒子的粒径优选为10~200nm,更优选为10~100nm。
需要说明的是,包含佐剂组合物的水性溶液中,pH敏感性化合物、两亲性物质、具有刺激固有免疫的活性的物质中的至少1种可以不形成缔合体,而以游离的状态存在。
作为本发明的包含pH敏感性载体的水性溶液的溶剂,优选为包含缓冲剂、NaCl、葡萄糖、蔗糖等糖类的水溶液。
作为缓冲剂,只要是将佐剂组合物的pH维持为生理pH以上的缓冲剂即可,可适当使用已知的缓冲剂,没有特别限制。作为缓冲剂,例如,可使用磷酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、柠檬酸-磷酸缓冲剂、三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲剂(Tris盐酸缓冲剂)、MES缓冲剂(2-吗啉基乙磺酸缓冲剂)、TES缓冲剂(N-三(羟基甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲剂)、乙酸缓冲剂、MOPS缓冲剂(3-吗啉基丙磺酸缓冲剂)、MOPS-NaOH缓冲剂、HEPES缓冲剂(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲剂)、HEPES-NaOH缓冲剂等GOOD缓冲剂、甘氨酸-盐酸缓冲剂、甘氨酸-NaOH缓冲剂、甘氨酰甘氨酸-NaOH缓冲剂、甘氨酰甘氨酸-KOH缓冲剂等氨基酸系缓冲剂;Tris-硼酸缓冲剂、硼酸-NaOH缓冲剂、硼酸缓冲剂等硼酸系缓冲剂;或咪唑缓冲剂等。这些中,优选使用磷酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、柠檬酸-磷酸缓冲剂、Tris盐酸缓冲剂、MES缓冲剂、乙酸缓冲剂、HEPES-NaOH缓冲剂。作为缓冲剂的浓度,没有特别限制,优选为0.1~200mM,更优选为1~100mM。需要说明的是,本说明书中,“缓冲剂的浓度”是指,水性溶液中包含的缓冲剂的浓度(mM)。
作为NaCl、葡萄糖、蔗糖等糖类的浓度,没有特别限制,优选为0.1~200mM,更优选为1~150mM。
作为水性溶液中的pH敏感性载体的浓度,没有特别限制,pH敏感性化合物与两亲性物质的合计摩尔浓度优选为0.73μmol/L~7.4mmol/L,更优选为7.3μmol/L~6.5mmol/L,进一步优选为8.0μmol/L~4.2mmol/L。
另外,水性溶液中的具有活化固有免疫的刺激的物质的摩尔浓度没有特别限制,优选为0.14nmol/L~0.227mmol/L,更优选为1.4nmol/L~0.19mmol/L,进一步优选为1.6nmol/L~0.12mmmol/L。
[其他成分]
佐剂组合物可包含其他成分。作为所述其他成分,没有特别限制,可举出稳定剂等。
作为稳定剂,只要不给pH敏感性载体及具有活化固有免疫的刺激的物质带来不良影响即可,没有特别限制,例如,可使用1-辛醇、1-十二烷醇、1-十六烷醇、1-二十烷醇等饱和及不饱和的碳原子数4~20的醇;月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸等饱和及不饱和的碳原子数12~18的脂肪酸;辛酸甲酯、辛酸乙酯、月桂酸甲酯、月桂酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕榈酸乙酯、硬脂酸乙酯、油酸甲酯、油酸乙酯等饱和及不饱和的碳原子数8~18的脂肪酸烷基酯(碳原子数1~3的烷基);D(L)-丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等D(L)-氨基酸;三己酸甘油酯、三辛酸甘油酯等氨基酸三酸甘油酯;聚氧乙烯山梨糖醇酐三棕榈酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯等碳原子数12~18的聚氧乙烯山梨糖醇酐三脂肪酸酯(例如,Tween65、Tween85);聚氧乙烯月桂酸酯、聚氧乙烯肉豆蔻酸酯、聚氧乙烯棕榈酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯等碳原子数12~18的聚氧乙烯烷基酯(例如,PEG20硬脂基醚、PEG23月桂基醚);聚氧亚烷基氢化蓖麻油(例如,PEG10氢化蓖麻油、PEG40氢化蓖麻油、PEG60氢化蓖麻油);三辛酸甘油酯(辛酸甘油酯)、单癸酸甘油酯、单月桂酸甘油酯、单肉豆蔻酸甘油酯、单棕榈酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯等饱和及不饱和的碳原子数8~18的单脂肪酸甘油酯;二辛酸甘油酯、二癸酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二肉豆蔻酸甘油酯、二棕榈酸甘油酯等碳原子数8~16的二脂肪酸甘油酯;α-生育酚乙酸酯、蓖麻油、大豆油、胆固醇、角鲨烯、角鲨烷、乳糖、抗坏血酸棕榈酸酯、苯甲酸苄酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯等已知的稳定剂。需要说明的是,稳定剂中的“碳原子数”是指构成疏水部的脂肪酸成分(酰基)的碳原子数。
作为上述其他成分的含量,只要不给pH敏感性载体及具有活化固有免疫的刺激的物质带来不良影响即可,没有特别限制,相对于100mol两亲性物质,优选为150mol以下,更优选超过0mol且为66.4mol以下。
通过与抗原一同施予本方式涉及的佐剂组合物,可有效地诱导CTL。
即,本方式涉及的佐剂组合物中,即使将pH敏感性载体与具有活化固有免疫的刺激的物质并用,也可合适地发挥pH敏感性载体的功能、例如促进膜破坏功能的效果(及促进膜融合功能的效果)。另外,与pH敏感性载体一同使用具有活化固有免疫的刺激的物质时,也可合适地发挥具有活化固有免疫的刺激的物质的功能。其原因虽不必然明确,但推测是由于以下这样的原因。
即,优选方式中,pH敏感性载体包含pH敏感性化合物及两亲性物质,表现促进膜破坏功能的效果(根据情况,为促进膜破坏功能的效果及促进膜融合功能的效果)。此时,如上所述,上述促进膜破坏功能的效果(及促进膜融合功能的效果)是基于下述机制而表现的:在酸性环境下,pH敏感性化合物导致pH敏感性载体的缔合状态发生变化,并且,此时,基于两亲性物质,导致与核内体等细胞膜重新排列。此处,即使在pH敏感性载体中并用具有活化固有免疫的刺激的物质,pH敏感性化合物的pH敏感性也不发生变动,因此,pH敏感性化合物可导致pH敏感性载体的缔合状态发生变化。另外,例如,无论是具有活化固有免疫的刺激的物质被整合到两亲性物质中,还是与pH敏感性载体独立存在,均不会影响因两亲性物质而导致的与细胞膜的重新排列。这样,即使将具有活化固有免疫的刺激的物质与pH敏感性载体并用,也不会损害pH敏感性载体的功能。而且,对于具有活化固有免疫的刺激的物质而言,无论是仅为例如通过疏水性的相互作用而被整合于pH敏感性载体的两亲性物质的状态,还是仅为与pH敏感性载体独立存在的状态,其功能均不会受到损害。结果,将本方式涉及的佐剂组合物与抗原一同施予时,通过pH敏感性载体的功能,可将抗原导入至细胞质基质,并且,通过具有活化固有免疫的刺激的物质发挥作用,可合适地诱导基于被导入至细胞质基质的抗原的交叉呈递,可有效地诱导CTL。
需要说明的是,上述原因是推断,即使是由于另外的原因而带来本发明的效果,这也被包含在本发明的技术范围之内。
另外,根据本发明的优选的一个实施方式,还可合适地诱导体液免疫。
如上所述,通常,外源性抗原在抗原呈递细胞内的核内体被分解至肽片段,与MHCII类分子形成复合体,被呈递至CD4阳性T细胞。
对于本方式涉及的佐剂组合物而言,在通过将共同施予的抗原交叉呈递,从而诱导CTL时,pH敏感性载体引起核内体的细胞膜的重新排列时,抗原、具有活化固有免疫的刺激的物质可被导入至细胞质基质。然而,在一个实施方式中,即使发生重新排列,也可能存在抗原及具有活化固有免疫的刺激的物质中的一部分或全部残留在核内体内的情况。另外,一个实施方式中,在抗原与佐剂组合物独立存在时,也可能存在在一部分的核内体中仅摄取抗原的情况。如果这样,则在核内体内抗原被分解至肽片段,与MHCII类分子形成复合体,被呈递至CD4阳性T细胞,诱发体液免疫。此时,合适地诱导交叉呈递的树突状细胞处于免疫被活化的状态,因此,合适地表现该体液免疫的诱导。或者,合适地诱导交叉呈递的树突状细胞活跃地产生活化免疫的细胞因子(例如,IFNγ),使周围的环境成为适于免疫诱导的环境。
因此,根据本发明的另一实施方式,可与交叉呈递同时,或代替交叉呈递,而诱导体液免疫。
<疫苗组合物>
疫苗组合物包含佐剂组合物及抗原。
[佐剂组合物]
作为佐剂组合物,由于可使用上文所述的组合物,所以此处省略说明。
[抗原]
作为抗原,只要使免疫应答产生即可,没有特别限制,优选为肽或蛋白质。
作为上述肽或蛋白质,可举出病毒抗原、细菌性抗原、真菌性抗原、原虫性或寄生虫性抗原、癌抗原、过敏相关抗原、疾病相关抗原、移植物排斥相关抗原等。
作为上述病毒抗原,没有特别限制,可举出gag、pol、及env基因的基因产物、Nef蛋白质、逆转录酶、以及其他的HIV成分(component)等人免疫缺陷病毒(HIV)抗原;B型肝炎病毒的S、M、及L蛋白质、B型肝炎病毒的pre-S抗原、C型肝炎病毒RNA、以及A、B、及C型肝炎的病毒成分等肝炎病毒抗原;红细胞凝集素及神经氨酸酶、以及其他流感病毒成分等流感病毒抗原;麻疹病毒抗原;风疹病毒抗原;轮状病毒抗原;巨细胞病毒抗原;呼吸道合胞病毒抗原;单纯疱疹病毒抗原;水痘带状疱疹病毒抗原;日本脑炎病毒抗原;狂犬病病毒抗原。此外,可举出来源于腺病毒、逆转录病毒、细小核糖核酸病毒、疱疹病毒、轮状病毒、汉坦病毒、冠状病毒、披膜病毒、黄病毒(flavirvirus)、杆状病毒、副粘病毒、正粘病毒、布尼亚病毒、沙粒病毒、呼肠孤病毒、乳头瘤病毒(papilomavirus)、细小病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒或海绵状病毒的肽。
作为上述细菌性抗原,没有特别限制,可举出百日咳毒素、纤维状红细胞凝集素、百日咳杆菌粘附素、FIM2、FIM3、腺苷酸环化酶、其他的百日咳细菌性抗原成分等细菌性抗原;白喉毒素或类毒素、其他的白喉细菌性抗原成分等白喉细菌性抗原;破伤风毒素或类毒素、其他的破伤风细菌性抗原成分等破伤风细菌性抗原链球菌细菌性抗原;脂多糖、其他的革兰氏阴性细菌性抗原成分等革兰氏阴性杆菌细菌性抗原;分枝菌酸、热休克蛋白65(HSP65)、30kDa主要分泌蛋白质、抗原85A、其他的分枝杆菌抗原成分等结核菌细菌性抗原;幽门螺杆菌细菌性抗原成分;肺炎球菌细菌性抗原;流感菌细菌性抗原;炭疽菌细菌性抗原;立克次氏体细菌性抗原等。
作为上述真菌性抗原,没有特别限制,可举出念珠菌属真菌性抗原成分;组织胞浆菌属真菌性抗原;隐球菌属真菌性抗原;球孢子菌属真菌性抗原;白癣真菌性抗原等。
作为上述原虫性或寄生虫性抗原,没有特别限制,可举出恶性疟原虫抗原;弓形虫抗原;血吸虫抗原;利什曼原虫抗原;克氏锥虫抗原等。
作为上述癌抗原,没有特别限制,可举出来源于肿瘤组织的细胞的细胞表面、细胞质、核、细胞器等的癌抗原。作为该癌,可举出白血病、淋巴瘤、神经性肿瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、头颈部癌、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、阴道癌、睾丸癌、前列腺癌、阴茎癌、骨肿瘤、血管肿瘤、唇癌、鼻咽癌、咽喉癌、食道癌、直肠癌、胆囊癌、胆管癌、喉癌、肺癌、膀胱癌、肾癌、脑肿瘤、甲状腺癌、霍奇金氏病、非霍奇金淋巴瘤等。需要说明的是,作为癌抗原的具体例,可举出HER2/neu(HumanEGFRrelated2)、CEA(CarcinogenicEmbryonicAntigen,癌胚抗原)、MAGE(Melanoma-associatedAntigen,黑色素瘤相关抗原)、XAGE(Xantigenfamilymember,X抗原家族成员)、NY-ESO-1、gp100、Melan/mart-1、酪氨酸酶(Tyrosinase)、PSA(ProstateSpecificAntigen,前列腺特异性抗原)、PAP(ProstateAcidPhosphatase,前列腺酸性磷酸酶)、p53、K-ras、N-ras、Bcr-Abl、MUC-1(Mucin-1)、PSMA(ProstateSpecificMembraneAntigen,前列腺特异膜抗原)、survivin、WT-1(Wilmstumorsuppressorgene1(Wilms肿瘤抑制基因1))、AFP(AlphaFetoprotein,甲胎蛋白)、GPC(Glypican,磷脂酰肌醇聚糖)、EGFR(EpidermalGrowthFactorReceptor,表皮生长因子受体)等。
作为上述过敏相关抗原,没有特别限制,可举出杉树花粉抗原、豚草花粉抗原;黑麦草花粉抗原等花粉抗原;屋尘螨抗原、猫抗原等来源于动物的抗原;组织相容性抗原、盘尼西林等治疗药等。
上述疾病相关抗原(自身免疫性疾病、过敏等)没有特别限制,可举出糖尿病、类风湿性关节炎、重症肌无力症、系统性红斑狼疮、特应性皮炎、干癣、干燥综合征、斑秃、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、结膜炎、角膜结膜炎、哮喘、过敏性哮喘、直肠炎、药疹、变应性脑脊髓炎、急性坏死性出血性脑病、再生障碍性贫血、成红细胞性贫血、特发性血小板减少症、韦格纳肉芽肿病、Stevens-Johnson综合征、间质性肺纤维化等。作为具体例,例如,作为参与自身免疫性疾病的抗原的例子,可举出谷氨酸脱羧酶65(GAD65)、天然DNA、髓鞘碱性蛋白、髓鞘蛋白脂质蛋白、乙酰胆碱受体成分、甲状腺球蛋白、促甲状腺激素(TSH)受体。
作为上述移植物排斥相关抗原,没有特别限制,可举出心脏、肺、肝脏、胰腺、肾脏、神经移植物成分等被抑制给移植受体的移植物的抗原性成分。
上述的抗原可单独使用,也可组合使用2种以上。
对于抗原的含量而言,相对于100nmol构成pH敏感性载体的两亲性物质,优选为3.2~400μg,更优选为16μg~80μg。
抗原的整合率没有特别限制,抗原与佐剂组合物可以独立存在,优选为3%以上,更优选为5~80%,更优选为10~60%。整合率为3%以上时,例如,疫苗组合物被细胞内吞时,抗原与佐剂组合物同样地被导入到核内体中的可能性增高,可合适地得到发明的效果,因而优选。需要说明的是,“抗原的整合率”主要是指抗原被佐剂组合物担载或包含的比例,其值采用通过实施例中记载的方法测得的值。
[添加剂]
疫苗组合物可包含其他医药品添加剂。
可使用的添加剂根据疫苗组合物的剂型的不同而不同。此时,疫苗组合物可以是片剂、粉末、胶囊等固形制剂的形态,也可以是注射制剂这样的液体制剂的形态,优选为液体制剂。需要说明的是,在液体制剂的情况下,也可以以干燥制品的形式提供,在使用时用水或其他适当的赋形剂将所述干燥制品制成液体制剂。
疫苗组合物为片剂及胶囊时,优选利用通常的方法实施肠溶包衣。作为肠溶包衣,可利用该领域中通常使用的物质。另外,胶囊也可含有粉末或液体中的任何。
另外,疫苗组合物为固形制剂时,可包含赋形剂(例如乳糖、蔗糖之类的糖类、玉米淀粉之类的淀粉类、结晶纤维素之类的纤维素类、阿拉伯胶、偏硅酸铝酸镁、磷酸钙等)、润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇等)、粘合剂(例如甘露糖醇、蔗糖之类的糖类、结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等)、崩解剂(例如马铃薯淀粉之类的淀粉类、羧甲基纤维素之类的纤维素类、交联聚乙烯吡咯烷酮等)、着色剂、矫味矫臭剂等。
另一方面,疫苗组合物为液体制剂时,可含有溶剂(例如生理盐水、无菌水、缓冲液等)、膜稳定剂(例如胆固醇等)、等渗剂(例如氯化钠、葡萄糖、甘油等)、抗氧化剂(例如生育酚、抗坏血酸、谷胱甘肽等)、防腐剂(例如氯丁醇、尼泊金酯等)等。需要说明的是,上述溶剂可以是制造疫苗组合物时使用的溶剂。
根据本发明的一个实施方式,疫苗组合物通过高效地将抗原交叉呈递,可诱导细胞免疫。由此,可诱导例如CTL。需要说明的是,本说明书中,所谓“诱导细胞免疫”,是指与未处置疫苗组合物的对照对比,可得到高CTL的诱导率。另外,所谓“CTL的诱导率”,是指全部CD8阳性细胞中所占的IFNγ产生细胞的比例。
需要说明的是,对于本方式涉及的佐剂组合物而言,即使施予中使用的抗原相同,与处置活化固有免疫的物质的对照相比,可显示更高的CTL诱导率,因此,可具有增强细胞免疫的效果。本说明书中,所谓“具有CTL诱导增强效果”,是指与单独使用刺激固有免疫的物质的情况相比,可得到高CTL的诱导率。因此,在显示CTL诱导增强效果时,也同时显示诱导细胞免疫的效果。
另外,根据本发明的另一实施方式,疫苗组合物可诱导体液免疫的免疫应答。由此,可产生IgG等抗体。此时,所谓“诱导体液免疫”,是指与未处置疫苗组合物的对照对比,显示高IgG抗体效价。
需要说明的是,对于本方式涉及的疫苗组合物而言,与处置活化固有免疫的物质的对照对比,可显示更高的IgG抗体效价,因此,可具有增强体液免疫的效果。
[用途]
对于本方式的疫苗组合物而言,向对象者施予、疫苗组合物的外部环境低于生理pH(例如,pH6.5)时,表现促进膜破坏功能的效果、或促进膜破坏功能的效果及促进膜融合功能的效果,可高效地将抗原向细胞质基质释出。而且,可合适地诱导细胞免疫,可赋予免疫。
因此,根据本方式涉及的疫苗组合物,可提供疾病的治疗或预防方法,所述方法包括向需要治疗或预防的对象者施予有效量的上述的疫苗组合物步骤。
作为疫苗组合物的施予方法,没有特别限制,可举出口服施予;静脉内注射、动脉内注射、皮下注射、皮内注射、肌内注射、髓腔内注射、经皮施予或经皮吸收等非口服的施予等。例如,当使用肽及蛋白质作为抗原时,优选非口服途径、尤其是基于皮下注射、皮内注射、肌内注射、静脉注射的施予。需要说明的是,关于抗原未被佐剂组合物担载或包含而独立地混合而成的疫苗组合物,优选以局部施予、具体为皮下施予、皮内施予、肌内施予的形态施予。
上述的对象者优选为哺乳动物,特别优选为人。
作为上述疾病,例如,可举出人免疫缺陷综合征(HIV)、肝炎、流感等病毒感染症;百日咳、白喉、破伤风、结核、因幽门螺杆菌、肺炎球菌等而导致的细菌感染症;念珠菌属等真菌感染症;疟疾等原虫性或寄生虫性感染症;白血病、淋巴瘤、神经性肿瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、头颈部癌、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、阴道癌、睾丸癌、前列腺癌、阴茎癌、骨肿瘤、血管肿瘤、唇癌、鼻咽癌、咽喉癌、食道癌、直肠癌、胆囊癌、胆管癌、喉癌、肺癌、膀胱癌、肾癌、脑肿瘤、甲状腺癌、霍奇金氏病、非霍奇金淋巴瘤等癌;因杉树花粉等导致的过敏;糖尿病、类风湿性关节炎、重症肌无力症、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病;移植物抗宿主疾病(GVHD)等因移植而导致的排斥反应。
根据本发明的优选的一个实施方式,可提供疾病的治疗或预防方法。这样的见识可适当参照申请时的技术常识。
另外,本发明的一个实施方式中,通过培养,疫苗组合物也可向细胞输送抗原。即,根据本发明的一个方式,可提供用于将抗原向细胞输送的培养方法。
上述培养方法包括在包含疫苗组合物的培养基中培养细胞的工序。
作为上述培养基,没有特别限制,可使用已知的培养基。具体而言,可举出MEM、DMEM、RPMI等。
作为在上述培养基中添加疫苗组合物的添加量,没有特别限制,两亲性物质的摩尔浓度优选为0.66μmol/L~1.0mmol/L,更优选为6.6μmol/L~0.88mmol/L,进一步优选为7.2μmol/L~0.56mmol/L。
另外,上述培养基的pH优选为7.0以上,更优选为7.2~7.8。培养基的pH为7.0以上时,可防止培养基中的构成pH敏感性载体的pH敏感性化合物的不稳定化,因而优选。
作为上述细胞,没有特别限制,可举出从对象者采集的细胞、已建立细胞系的培养细胞等。
此时,作为上述从对象者采集的细胞或已建立细胞系的培养细胞的具体例,可举出树突状细胞、NK(NaturalKiller)细胞、T淋巴细胞、B淋巴球细胞、淋巴球细胞等。
上述细胞中,优选使用从对象者采集的细胞,更优选使用从对象者采集的树突状细胞、NK细胞、T细胞、淋巴细胞等,进一步优选使用树突状细胞。
在使用从对象者采集的细胞的情况下,可通过针对对象者进行采血、活组织检查等,而采集该细胞。即,一个实施方式中,上述培养方法可包括从对象者采集细胞的工序。
需要说明的是,可向对象者施予培养的细胞。由此,可治疗或预防对象者的疾病。即,本发明的一个实施方式中,可提供疾病的治疗或预防方法。
优选的一个实施方式中,上述治疗或预防方法包括以下工序:从对象者采集细胞的工序;在包含疫苗组合物的培养基中培养上述采集的细胞的工序;和将上述培养的细胞向上述对象者施予的工序。
由此,可进行疾病的治疗或预防。需要说明的是,上述疾病如上文所述。
<佐剂组合物的制造方法>
本发明涉及的佐剂组合物没有特别限制,可利用各种方法制造。
例如,对于pH敏感性载体与具有活化固有免疫的刺激的物质独立存在的佐剂组合物而言,可通过将pH敏感性载体及具有活化固有免疫的刺激的物质混合而制造。另外,对于具有活化固有免疫的刺激的物质被pH敏感性载体担载或包含的佐剂组合物而言,可通过将pH敏感性载体、和具有活化固有免疫的刺激的物质缔合而制造。
以下,针对使用包含规定的pH敏感性化合物及规定的两亲性物质、且具有表现促进膜破坏功能的效果的pH敏感性载体作为pH敏感性载体的优选方式,以下详细进行说明。
本方式涉及的佐剂组合物的制造方法包括以下工序:将选自脱氧胆酸、胆酸、熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、高级胆汁酸、甘氨脱氧胆酸、甘草酸、甘草亭酸及它们的盐中的至少1种pH敏感性化合物,和选自碳原子数10~12的磷脂酰胆碱、碳原子数12~18的聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯、碳原子数16~18的山梨糖醇酐脂肪酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油及α-生育酚中的至少1种两亲性物质,和具有活化固有免疫的刺激的物质缔合的工序。
作为将pH敏感性化合物、两亲性物质、及具有活化固有免疫的刺激的物质缔合的方法,使pH敏感性化合物、两亲性物质、及具有活化固有免疫的刺激的物质在水性溶液中接触即可。因此,本方式涉及的佐剂组合物可通过使pH敏感性化合物、和两亲性物质、和具有活化固有免疫的刺激的物质在水性溶液中接触而制造。
作为使pH敏感性化合物、和两亲性物质、和具有活化固有免疫的刺激的物质在水性溶液中接触的方法,只要它们形成缔合体即可,没有特别限制。例如,可举出以下方法:方法(1),分别制备包含pH敏感性化合物的水性溶液、和包含两亲性物质的水性溶液、和包含具有活化固有免疫的刺激的物质的水性溶液,将这些水性溶液混合,使用乳化器、涡旋混合器、超声波等剧烈搅拌该溶液,使其分散,得到佐剂组合物;方法(2),利用作为脂质体的制造方法而已知的Bangham法进行制备;等等。需要说明的是,作为上述Bangham法的具体的方法,例如可利用以下的方法进行。即,在玻璃容器中,将佐剂组合物的构成成分溶解于有机溶剂(例如,甲醇、氯仿),利用旋转蒸发器等除去有机溶剂,在玻璃容器的壁上形成薄膜。接下来,将水性溶液添加到形成了薄膜的玻璃容器中,于5~35℃将薄膜溶胀,然后,于5~35℃振荡玻璃容器。此时,使用乳化器、涡旋混合器、超声波,剧烈搅拌,可将薄膜充分分散到水性溶液中。Bangham法的方法的详细内容可参考已知的脂质体的制造方法,在“リポソーム(脂质体)”(野岛庄七、砂本顺三、井上圭三编,南江堂)及“ライフサイエンスにおけるリポソーム(生命科学中的脂质体)”(寺田弘、吉村哲郎编,Springer-Verlag东京)中有记载。另外,上述的(1)的制造方法中,也可在包含两亲性物质的水性溶液中混合pH敏感性化合物、具有活化固有免疫的刺激的物质。需要说明的是,作为水性溶液的溶剂,可使用上文所述的水性溶液的溶剂。上述(1)的方法中,制备各水性溶液时的温度及混合水性溶液的温度没有特别限制,优选为5~35℃,更优选为常温15~25℃。
需要说明的是,包含水性溶剂作为成分的佐剂组合物中可含有的稳定剂等其他成分的添加方法没有特别限制。例如,可添加到包含pH敏感性化合物的水性溶液、包含两亲性物质的水性溶液、及/或包含具有活化固有免疫的刺激的物质的水性溶液中,在利用Bangham法制备薄膜时,可使其与佐剂组合物的构成成分一同溶解,使用包含这些成分的薄膜,得到包含佐剂组合物的水性溶液。
<疫苗组合物的制造方法>
本发明涉及的疫苗组合物没有特别限制,可利用各种方法制造。作为具体的制造疫苗组合物的方法,可举出分散制备法、混合制备法、及冷冻融化-冷冻干燥制备法等。
(分散制备法)
分散制备法包括将pH敏感性化合物、两亲性物质、具有活化固有免疫的刺激的物质、和抗原混合的工序。即,在玻璃容器的壁上形成包含佐剂组合物的构成成分的薄膜。接下来,将包含抗原的溶液添加到形成了薄膜的玻璃容器中,于5~35℃使薄膜溶胀,然后振荡玻璃容器。此时,使用乳化器、涡旋混合器、超声波,剧烈搅拌,使其分散,利用该方法,制备疫苗组合物。或者,在玻璃容器的壁上,形成包含pH敏感性化合物和两亲性物质的薄膜,接下来,将包含抗原和具有活化固有免疫的刺激的物质的溶液添加到形成了薄膜的玻璃容器中,于5~35℃使薄膜溶胀,然后振荡玻璃容器。此时,使用乳化器、涡旋混合器、超声波进行剧烈搅拌,利用该方法制备疫苗组合物。
上述包含抗原的溶液、及包含抗原和具有活化固有免疫的刺激的物质的溶液可使用利用与下述混合制备法同样的方法或参考下述混合制备法的方法而制造出的溶液。
(混合制备法)
混合制备法包括将包含pH敏感性化合物的溶液、包含两亲性物质的溶液、包含具有活化固有免疫的刺激的物质的溶液、和包含抗原的溶液混合的工序。即,混合制备法中,用上述(1)及(2)的方法制备佐剂组合物。例如,用(2)的方法制备佐剂组合物时,可通过将佐剂组合物的分散液、与抗原或包含抗原的溶液混合,得到的疫苗组合物。另外,用(1)的方法得到佐剂组合物时,优选准备下述的溶液。
包含pH敏感性化合物的溶液
上述包含pH敏感性化合物的溶液包含pH敏感性化合物及溶剂。另外,根据需要也可包含添加剂。
作为上述pH敏感性化合物,可使用在上文中说明过的pH敏感性化合物,因此此处省略说明。
作为上述溶剂,除了包含缓冲剂、NaCl、葡萄糖、蔗糖等糖类的水溶液之外,还可使用无菌水等。这些中,从适于向机体施予疫苗组合物的观点考虑,优选使用生理盐水、无菌水、缓冲液。
对于上述包含pH敏感性化合物的溶液中的pH敏感性载体的浓度而言,pH敏感性化合物的摩尔浓度优选为0.066μmol/L~6.4mmol/L,更优选为0.66μmol/L~5.6mmol/L,进一步优选为0.72μmol/L~3.6mmol/L。
包含两亲性物质的溶液
上述包含两亲性物质的溶液包含两亲性物质及溶剂。另外,根据需要也可包含添加剂。
作为上述两亲性物质及上述溶剂,可使用在上文中说明过的两亲性物质及溶剂,因此此处省略说明。
对于上述包含两亲性物质的溶液中的两亲性物质的浓度而言,两亲性物质的摩尔浓度优选为0.66μmol/L~1.0mmol/L,更优选为6.6μmol/L~0.88mmol/L,进一步优选为7.2μmol/L~0.56mmol/L。
包含具有活化固有免疫的刺激的物质的溶液
上述包含具有活化固有免疫的刺激的物质的溶液包含具有活化固有免疫的刺激的物质及溶剂。另外,根据需要也可包含添加剂。
作为上述具有活化固有免疫的刺激的物质及上述溶剂,可使用在上文中说明过的具有活化固有免疫的刺激的物质及溶剂,因此此处省略说明。
对于上述包含具有活化固有免疫的刺激的物质的溶液中的具有活化固有免疫的刺激的物质的浓度而言,具有活化固有免疫的刺激的物质的摩尔浓度优选为0.14nmol/L~0.227mmol/L,更优选为1.4nmol/L~0.19mmol/L,进一步优选为1.6nmol/L~0.12mmmol/L。
包含抗原的溶液
上述包含抗原的溶液包含抗原及溶剂。
作为上述抗原及上述溶剂,可使用在上文中说明过的抗原及溶剂,因此此处省略说明。
混合
上述的包含pH敏感性化合物的溶液、包含两亲性物质的溶液、包含具有活化固有免疫的刺激的物质的溶液、及包含抗原的溶液的混合方法没有特别限制。
优选将得到的混合液分散,所述分散例如可利用乳化器、涡旋混合器、超声波等进行。
需要说明的是,一个实施方式中,对于包含pH敏感性化合物的溶液、包含两亲性物质的溶液、包含具有活化固有免疫的刺激的物质的溶液、及包含抗原的溶液而言,也可不另外地形成溶液,而是使用2种以上的混合液。例如,可以制备包含pH敏感性化合物及具有活化固有免疫的刺激的物质的溶液,将其与包含两亲性物质的溶液、包含抗原的溶液混合。
(冷冻融化-冷冻干燥制备法)
冷冻融化-冷冻干燥制备法包括将通过分散制备法或混合制备法而得到的溶液冷冻融化而制备融化液的工序、将该融化液冷冻干燥的工序。
制备融化液的工序
融化液可通过将利用分散制备法或混合制备法得到的溶液冷冻融化而制备。
所谓冷冻融化,是指在将溶液冷冻干燥后,将得到的干燥物融化。
作为冷冻干燥的方法,没有特别限制,优选使用了液氮、冷却的甲醇等的使水分升华的方法。
另外,作为干燥物的融化方法,没有特别限制,优选将冷却而得到的干燥物升温的方法、添加溶剂的方法。
进行冷冻干燥的工序
本工序是将上述中得到的融化液冷冻干燥的工序。
冷冻干燥的方法与上述同样,没有特别限制,优选使用了液氮、冷却的甲醇等的使水分升华的方法。
上述的疫苗组合物的制造方法中,优选使用抗原的冷冻融化-冷冻干燥制备法。通过冷冻融化-冷冻干燥制备法,抗原容易被佐剂组合物担载或包含,可得到高的抗原的整合率。更详细而言,通过冷冻融化-冷冻干燥制备法,在冷冻融化的阶段中,将进行冷冻干燥而得到的干燥物融化时,进行融化需要耗费一定时间。结果,在融化初始阶段,抗原及佐剂组合物成为相靠近的状态。抗原及佐剂组合物一旦成为靠近的状态,则该状态将难以被解除。结果,即使在完成了融化的融化液中,抗原及佐剂组合物也可维持靠近的状态。而且,以这样的状态进行冷冻干燥时,抗原将容易被佐剂组合物担载或包含,可实现高的抗原的整合率。
根据本发明的优选的一个实施方式,pH敏感性载体包含规定的pH敏感性化合物及规定的两亲性物质。因此,优选的实施方式涉及的疫苗组合物的制造方法包括将选自脱氧胆酸、胆酸、熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、高级胆汁酸、甘氨脱氧胆酸、甘草酸、甘草亭酸及它们的盐中的至少1种pH敏感性化合物、和选自碳原子数10~12的磷脂酰胆碱、碳原子数12~18的聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯、碳原子数16~18的山梨糖醇酐脂肪酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油及α-生育酚中的至少1种两亲性物质、和具有活化固有免疫的刺激的物质缔合的工序;在通过上述缔合而得到的缔合体中混合抗原的工序;将通过上述混合而得到的混合物冷冻融化的工序;及将通过上述冷冻融化而得到的融化物冷冻干燥的工序。
实施例
以下,举出实施例进一步详细地说明本发明,但本发明不受这些实施例的任何限制。
<原料>
实施例中,使用了下述化合物。在试剂名与产品名相同的情况下,省略产品名。
(1)pH敏感性化合物
·脱氧胆酸钠(NACALAITESQUE,INC.制)
·胆酸钠(NACALAITESQUE,INC.制)
·熊脱氧胆酸钠(东京化成工业公司制)
·鹅脱氧胆酸(东京化成工业公司制)
·猪脱氧胆酸(东京化成工业公司制)
·甘氨脱氧胆酸钠(NACALAITESQUE,INC.制)
·甘草酸单铵(东京化成工业公司制)
(2)两亲性物质
·DDPC(1,2-二癸酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱:日油公司制,COATSOMEMC-1010)
·DLPC(1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱:日油公司制,COATSOMEMC-1212)
·聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯(Tween20,80:东京化成工业公司制)
·山梨糖醇酐脂肪酸酯(Span80:NACALAITESQUE,INC.制-山梨糖醇酐单油酸酯)
·聚氧乙烯蓖麻油(和光纯药工业公司制,聚氧乙烯10蓖麻油)
·α-生育酚(NACALAITESQUE,INC.制,DL-α-生育酚)
(3)具有活化固有免疫的刺激的物质等
·MPL(单磷酰脂质A(MonophoshorylLipidA))(Sigma公司制,脂质A,单磷酰沙门氏菌血清型/InVivogen公司制,MonophoshorylLipidA(合成品))
·IFA(Freund’sIncompleteAdjuvant:不完全弗氏佐剂)(SantaCruzBiotechnology公司制)
·CpG-DNA(CpG-ODN:InvivoGen公司制,ODN-2395)
·LPS(内毒素)(和光纯药工业公司制,来源于大肠杆菌O111的苯酚提取物)
(4)溶剂等
·注射用水:(大冢制药株式会社制)
·MES-Na(Merck公司制)
·氯化钠(关东化学公司制)
·PBS片(PBSTabltes)(磷酸盐缓冲盐水(Phosphatebufferedsaline):TakaraBio公司制)
·甲醇(NACALAITESQUE,INC.制)
·氯仿(和光纯药工业公司制)
·氢氧化钠水溶液(0.1mol/L:NACALAITESQUE,INC.制)
·盐酸(0.1mol/L,1mol/L:NACALAITESQUE,INC.制)
·OVA肽:SIINFEKL,(委托PHJapan合成)(以下,也简称为“肽”。)
·OVA蛋白质:OVA(EndoFitOvalbumin:InvivoGen公司制)(以下,也简称为“OVA”。)
(5)培养基等
·RPMI(NACALAITESQUE,INC.制,RPMI1640培养基(液体))
·青霉素-链霉素混合溶液(Penicillin-StreptamycinMixedSolution)(NACALAITESQUE,INC.制)
·FBS(胎牛血清(FetalBovineSerum),特级(Centified),热灭活(HeatInactivatied),美国源(USOrigin):Gibco公司制)
(6)试剂
·EYPC(未氢化蛋黄磷脂酰胆碱:日油公司制,COATSOMENC-50)
·磷脂C-TestWako(和光纯药工业株式会社制):磷脂测定试剂
·Pyranine(东京化成工业公司制):荧光物质
·DPX(对二甲苯双吡啶鎓溴化物(p-xylene-bis-pyridiniumbromide):Molecularprobes公司制):消光剂
·Triton-X100(和光纯药工业公司制):表面活性剂
·NBD-PE(1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)铵(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)ammonium):AvAntipolarlipids公司制)
·Rh-PE(1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(丽丝胺碱性蕊香红B磺酰氯)铵(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoehanolamine-N-(lissaminerhodamineBsulfonyl)ammonium):AvAntipolarlipids公司制):荧光标记脂质
·Rh-PE(1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(丽丝胺碱性蕊香红B磺酰氯)铵(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoehanolamine-N-(lissaminerhodamineBsulfonyl)ammonium):Avantipolarlipids公司制):荧光标记脂质
·Bio-RadDCProteinAssayReagentA、B(Bio-RadLaboratories公司制):蛋白质定量试剂盒
IsoFlow(BeckmanCoulter公司制):流式细胞术专用鞘液
·RBC裂解液(RBClysisbuffer)(SantaCruzBiotechnology公司制):红细胞溶血缓冲液
·细胞分散用胶原酶(和光纯药工业公司制):细胞分散试剂
·抗-CD11cFITC(Anti-CD11cFITC)(eBioscience公司制,抗小鼠CD11cFITC(Anti-MouseCD11cFITC)):异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体
·抗-CD80PE(Anti-CD80PE)(eBioscience公司制,抗小鼠CD80(B7-1)PE(Anti-MouseCD80(B7-1)PE)):R-藻红蛋白(PE)标记抗体(以下,也称为CD80PE。)
·抗-CD86PE(Anti-CD86PE)(eBioscience公司制,抗小鼠CD86(B7-2)PE(Anti-MouseCD86(B7-2)PE)):PE标记抗体(以下,也称为CD86PE。)
·抗-CD40PE(Anti-CD40PE)(eBioscience公司制,抗小鼠CD40PE(Anti-MouseCD40PE)):PE标记抗体(以下,也称为CD40PE。)
·抗小鼠CD16/32(Anti-mouseCD16/32)(BDBIOSCIENCES公司制)
·Cytofix/Cytoperm(BDBIOSCIENCES公司制):细胞固定·破膜试剂盒
·BD染色缓冲液(BDStainBuffer):染色用缓冲液
·BDGolgPlug:细胞刺激试剂盒
·抗-CD8αPE(Anti-CD8αPE)(eBioscience公司制):PE标记抗体
·MouseIFNγELISPOTSet(BDBIOSCIENCES公司制)
·AECSubstrateSet(BDBIOSCIENCES公司制)
·碳酸氢钠(和光纯药工业公司制)
·碳酸钠(和光纯药工业公司制)
·二抗(抗小鼠IgGHRP缀合物(anti-mouseIgGHRPconjugate),R&Dsystem公司制)
·白蛋白(来源于牛血清的白蛋白(Albuminfrombovineserum),Sigma公司制)
·过氧化物酶用显色试剂盒(SumitomoBakeliteCo.,Ltd.制)
(7)动物
雌性C57BL/6N小鼠(6-8周龄)从日本SLC购入。实验按照泰尔茂株式会社的关于动物实验的指南实施。
<试样的制备等>
·MES缓冲液(MESBuffer)
以MES:25mM、NaCl:125mM的配合量制备。对于MES缓冲液而言,只要没有特别说明,则pH为7.4。
·PBS
使用PBS片(TakaraBio公司制)制备。具体而言,将10片PBS片溶解于蒸馏水,使总量为1000mL而制备。需要说明的是,pH为7.35~7.65。
·MPL储备液的制作
对于MPL的储备液而言,使用氯仿、甲醇(7:3)的混合溶液,制备成100ng/μL。另外,根据需要,进一步进行稀释而使用。
·RPMI培养基(RPMImedium)
添加盘尼西林(100单位/mL)及链霉素(100mg/mL)作为抗生素,根据需要,追加添加FBS,制成含有10%血清的RPMI培养基。
<使用设备>
超声波照射机:USC-J
分光光度计:FP-6500
流式细胞仪:(FC500,软件:CXPSoftwarever2)
UV-vis分光光度计:UV-3600
冷冻干燥机:EYELAFREEZEDRYERFDU506
真空泵:GCD135XA
CO2培养箱:MCO20AIC
分离用滤器:AmiconUltra30K
<细胞的培养>
使用被设定为5%CO2、37℃的培养箱(MCO20AIC)实施细胞的培养。
(佐剂组合物及疫苗组合物的制备)
基于分散制备法的制造
在10mL茄形瓶中,将溶解于甲醇(或氯仿)中的1000nmol的两亲性物质、溶解于甲醇(或氯仿)中的pH敏感性化合物、和MPL的储备液混合,使用旋转蒸发器制成薄膜。
在制作的薄膜中添加1.0mL的MES缓冲液(溶出性试验及膜融合试验的情况)或1.0mL的PBS(整合率的测定、活化固有免疫的刺激的评价、针对小鼠的免疫的情况),使用超声波照射装置,使其分散,制备佐剂组合物的分散液。疫苗组合物的情况下,使用溶解有规定量的抗原的MES缓冲液或PBS。
需要说明的是,将两亲性物质与pH敏感性化合物的比率调整为所期望的比率。另外,在使用多种两亲性物质的情况下,以两亲性物质的总量成为所期望的摩尔数(1000nmol)的方式进行调整。另外,实施例、附图的说明中的pH敏感性化合物的使用量是相对于100nmol的两亲性物质的使用量。
基于混合制备法的制造
在10mL茄形瓶中,将溶解于甲醇(或氯仿)中的1000nmol的两亲性物质、和溶解于甲醇(或氯仿)中的pH敏感性化合物、和MPL的储备液混合,使用旋转蒸发器制成薄膜。在得到的薄膜中添加0.5mL的MES缓冲液(溶出性试验及膜融合试验的情况)或0.5mL的PBS(整合率的测定、活化固有免疫的刺激的评价、针对小鼠的免疫的情况),于5~35℃,使用超声波照射装置进行分散,制备佐剂组合物的分散液。
在得到的佐剂组合物的分散液中等量添加各种浓度的抗原溶液并进行混合,由此制备疫苗组合物的分散液。
基于冷冻融化-冷冻干燥制备法的制造
利用与混合制备法同样的方法,制备佐剂组合物的分散液。在得到的佐剂组合物的分散液中等量添加各种浓度的抗原溶液,依序进行冷冻融化及冷冻干燥。于5~35℃用1.0mL的注射用水将得到的冷冻干燥物进行再分散,由此制备疫苗组合物的分散液。
需要说明的是,冷冻融化通过以下方式进行:将10mL茄形瓶浸渍在冷却的甲醇中,使分散液冷冻,然后进一步将该茄形瓶浸渍到5~35℃的蒸馏水中。
另外,对于冷冻干燥而言,使用冷冻干燥机(EYELAFREEZEDRYERFDU506)和真空泵(GCD135XA),将分散液冷冻干燥。
在使用CpG-DNA(CpG-ODN)的情况下,制作包含1000nmol的两亲性物质、和规定量的pH敏感性化合物的混合薄膜,利用0.5mL的PBS和超声波照射装置制成分散液。此外,添加溶解有规定量的CpG-DNA、和规定量的抗原的0.5mL的PBS,将其用于实验。
(比较试样的制备)
作为比较试样,分别制备MPL单独的分散液(MPL分散液)、两亲性物质单独的分散液、pH敏感性载体单独的分散液。需要说明的是,在实施针对小鼠的免疫的情况下,进一步包含规定量的抗原。
即,将规定量的MPL储备液或者溶解于甲醇(或氯仿)中的两亲性物质或pH敏感性载体添加到10mL茄形瓶中,利用旋转蒸发器制成薄膜。在得到的薄膜中添加1.0mL的MES缓冲液(溶出性试验及膜融合试验的情况)或1.0mL的PBS(整合率的测定、活化固有免疫的刺激的评价、针对小鼠的免疫的情况),使用超声波照射装置进行分散,由此,制备MPL单独的分散液、两亲性物质单独的分散系、或pH敏感性载体单独的分散液。在评价CTL诱导率的情况下,使用溶解有规定量的抗原的PBS。
<测定方法>
(溶出性试验:Leakage(溶出率)的测定)
对于Leakage而言,按照K.Kono等BioconjugateChem.2008191040-1048中记载的方法,使用包封作为荧光物质的Pyranine和作为消光剂的DPX的EYPC脂质体进行评价。
称量溶解在氯仿中的3000nmol的EYPC并放入到10mL茄形瓶中,使用旋转蒸发器制成薄膜。添加Pyranine溶液(Pyranine:35mM、DPX:50mM、MES:25mM、pH7.4)500μL,使用超声波照射装置(USC-J)进行分散,然后使用挤出机,通过孔径100nm的聚碳酸酯膜,使粒径一致。使用MES缓冲液和G100柱,置换外水层,得到包封荧光物质的EYPC脂质体分散液。使用磷脂C-TestWako求出磷脂的浓度,使用MES缓冲液调节浓度,使得磷脂成为1.0mmol/L。
将浓度经调整的EYPC脂质体分散液20μL和评价样品分散液20μL注入到已调整了pH的2960μL的MES缓冲液中,于37℃进行90或30分钟孵育(实施例中,只要没有特别说明,则为90分钟的结果),然后,使用分光光度计FP-6500,观察Ex416、Em512nm的荧光,由此,监测Leakage。
需要说明的是,将仅EYPC脂质体分散液的情况作为0%,将添加了30μL的已进行了10倍稀释的Triton-X100的情况下的值作为100%,算出溶出率。具体而言,溶出率按照下式计算。需要说明的是,下式中,将测得的荧光强度表示为L,将仅使用包封有荧光物质的EYPC脂质体分散液时的荧光强度表示为L0,将添加了Triton-X100的情况下的荧光强度表示为L100。
(膜融合试验:Fusion(膜融合)的测定)
对于Fusion而言,按照K.Kono等Biomaterials2008294029-4036中记载的方法,利用FRET(FluorescenceResonanceEnergyTransfer,荧光共振能量转移)进行评价。荧光标记使用了NBD-PE、Rh-PE。
制作相对于EYPC包含0.6mol%的NBD-PE、及Rh-PE的EYPC(EYPC1000nmol)的薄膜,添加1.0mL的MES缓冲液,使用超声波照射装置(USC-J)进行分散,然后,使用挤出机,通过孔径100nm的聚碳酸酯膜,得到经双重荧光标记的EYPC脂质体分散液。
将经双重荧光标记的EYPC脂质体分散液20μL、和评价样品分散液20μL注入到已调节了pH的2960μL的MES缓冲液中,于37℃进行60分钟孵育,然后使用分光光度计(FP-6500),测定基于450nm的激发光的500nm~620nm的荧光光谱,求出520nm与580nm的荧光强度比。
融合率如下计算:将孵育了上述中得到的经双重荧光标记的EYPC脂质体分散液和两亲性物质的情况的荧光强度比作为0%,将对经双重荧光标记的EYPC脂质体分散液和评价样品分散液进行了甲醇处理的情况的荧光强度比作为100%而计算。需要说明的是,甲醇处理通过以下方式实施:将经双重荧光标记的EYPC脂质体分散液和评价样品分散液两者溶解于甲醇,然后使用旋转蒸发器制成薄膜,使用3.0mL的MES缓冲液和超声波照射装置进行分散。
具体而言,融合率按照下式计算。需要说明的是,下式中,将进行测定而得到的荧光强度比表示为R,将孵育了经双重荧光标记的EYPC脂质体分散液和两亲性物质的情况的荧光强度比表示为R0,将对经双重荧光标记的EYPC脂质体分散液和评价样品分散液进行了甲醇处理的情况的荧光强度比表示为R100。
(整合率的测定)
抗原单独存在时,通过滤器,抗原被佐剂组合物担载或包含时,不通过滤器,利用上述差别,按照下述方式实施整合率的评价。
在室温、7000rpm、10分钟的条件下,使包含佐剂组合物及抗原的分散液通过AmiconUltra30K的滤器。
通过测定过滤前后的抗原,从而算出整合率。在过滤前后,通过Lowry法进行抗原的显色,利用UV-vis分光光度计测定750nm处的吸光度,按照下式算出整合率。需要说明的是,显色中,使用200μL实施。另外,下式中,将过滤前的分散液的基于抗原的显色的吸光度记为A前,将过滤后的分散液的基于抗原的显色的吸光度记为A后,将使用了PBS时的吸光度记为A缓冲液。也就是说,分子表示未通过滤器的抗原,即被整合于佐剂组合物中的(被担载或包含的)抗原。
(活化固有免疫的刺激的评价)
活化固有免疫的刺激的评价按照下述方式实施。
即,摘出C57BL/6N小鼠的脾脏,向摘出的脾脏中注射2mg/mL的胶原酶溶液500μL(使用RPMI培养基制备),于37℃孵育30分钟。使用BDFalcon细胞滤网处理脾脏,制成细胞悬浮液。使用RBC裂解液进行溶血操作,然后使用RPMI培养基洗涤细胞。将细胞在RPMI培养基中分散,然后计数细胞数,将其用于后续操作。
在96孔板(96welldish)中,以1.0×106个细胞/100μL的量接种细胞,然后进一步添加包含各种分散液的RPMI培养基100μL,孵育一个晚上。上述操作使用不含血清的RPMI培养基进行。
回收细胞,使用BD染色缓冲液进行洗涤,然后,与0.25μg/100μL的抗-CD11cFITC进行孵育(4℃、30分钟),将细胞染色。将洗涤细胞后,进一步与0.25μg/100μL的抗-CD80PE、抗-CD86PE、或抗-CD40PE孵育(4℃、30分钟),进行染色。洗涤细胞至少3次以上,然后使用流式细胞仪(CytomicsFC500,软件:CXPsoftwarever2)进行细胞的评价。
(针对小鼠的免疫)
关于施予,在麻醉下实施,以100μL/只在背部1个位置进行皮下注射。使两亲性物质为100nmol/只,使pH敏感性化合物为10~640nmol/只,使MPL含有率为0.0227~22.7nmol/只。使抗原量为3.2~400μg/只。在对细胞免疫进行评价时,施予1次,在施予7天后实施分析。在对体液免疫进行评价时,施予2次。在从初次施予起14天后,实施第2次施予,从第2次施予起7天后,实施分析。
(从小鼠脾脏制备细胞分散液)
在最后一次施予后第7天,使小鼠安乐死,摘出脾脏。添加3.0mL的含有10%血清的RPMI培养基,然后使用BDFalcon细胞滤网处理脾脏,制成细胞悬浮液。使用RBC裂解液进行溶血操作,然后使用含有10%血清的RPMI培养基洗涤细胞。将细胞分散到含有10%血清的RPMI培养基中,然后计数细胞数,得到脾脏的细胞分散液。
(CTL诱导率的评价-ICS法)
将脾脏的细胞分散液接种于含有10%血清的培养基中,使其成为1.0×106个细胞/100μL。作为抗原的再刺激,添加包含40μg/mL的OVA肽的含有10%血清的RPMI培养基100μL,孵育3小时。然后,添加BDGolgiPlug,使其成为0.2μL/100μL,培养一个晚上。在不施加再刺激的情况下,使用不含OVA肽的含有10%血清的RPMI培养基。
回收细胞,使用BD染色缓冲液进行洗涤,然后添加抗小鼠CD16/32,于4℃孵育10分钟。洗涤细胞后,用抗-CD8αPE将细胞染色(4℃、30分钟),再次洗涤细胞。然后,使用Cytofix/Cytoperm,对细胞进行破膜处理,进行洗涤后,用抗-IFNγFITC将细胞染色(4℃、30分钟)。洗涤细胞至少3次以上,然后使用流式细胞仪(CytomicsFC500,软件:CXPsoftwarever2)进行细胞的评价。以IFNγ产生细胞在全部CD8阳性细胞中所占的比例的方式算出CTL诱导率。
(ELIspot法)
ELIspot法使用MouseIFNγELISPOTSet实施。在接种细胞的前一天,使试剂盒所附带的检测抗体(detectionantibody)吸附于96孔ELIspot培养板,制作培养板。用含有10%血清的RPMI培养基洗涤所制作的培养板后,添加200μL的含有10%血清的RPMI培养基,于37℃静置2小时,进行封闭(blocking)。在用含有10%血清的RPMI培养基洗涤培养板后,施加抗原的再刺激时,将包含40μg/mL的OVA肽的含有10%血清的RPMI培养基100μL添加到培养板中;在不施加抗原的再刺激的情况下,将含有10%血清的RPMI培养基100μL添加到培养板中。以规定的细胞数在上述培养板上接种脾脏的细胞分散液,最后,使用含有10%血清的RPMI培养基进行调整,使得每孔的总量成为200μL。然后,培养两个晚上,并进行培养板的显色。
培养板的显色按照MouseIFNγELISPOTSet、及AECSubstrateSet中记载的规程(protocol)实施。
(抗体效价的测定)
在从第2次施予起7天后实施采血,得到血清。在500mL的PBS中溶解5g的白蛋白,制成封闭缓冲液(Blockbuffer)。将1.47g的碳酸氢钠和0.80g的碳酸钠溶解于500mL的水,制成包被缓冲液(CoatingBuffer)。使用在500mL的PBS中添加2.5mL的Tween20而得到的溶液进行培养板的洗涤。
将OVA蛋白质溶解于包被缓冲液中,以成为0.1μg/孔(100μL)的量添加到96孔培养板中。于37℃静置2小时,然后,置换300μL的封闭缓冲液,于4℃静置一个晚上。洗涤培养板,然后向各孔中添加100μL已稀释成规定的倍率的血清,于37℃静置2小时。洗涤培养板后,向各孔中添加100μL用封闭缓冲液进行了1000倍稀释的二抗溶液,于37℃静置2小时。洗涤培养板后,使用过氧化物酶用显色试剂盒进行显色,求出抗体效价。
[评价]
使用按照上文记载的方法制备的分散液进行各种评价。
(1)免疫应答的诱导
针对细胞免疫的诱导进行了研究。使佐剂组合物中的两亲性物质为DLPC,使pH敏感性化合物为160nmol的脱氧胆酸。使MPL含有率为0.227,作为模型抗原,选择OVA肽(以下,也称为“肽”)。该情况下,MPL含有率是指相对于100nmol的两亲性物质的MPL的量(nmol),pH敏感性化合物的量为相对于100nmol的两亲性物质的量。
制备法为分散制备法。
另外,作为比较试样,使用了单独的肽的溶液、pH敏感性载体(DLPC-脱氧胆酸)和肽的分散液、不完全弗氏佐剂(IFA)和肽的溶液。将上述的溶液或分散液分别向C57BL/6N小鼠的背部皮下施予1次,测定脾脏中的IFNγ产生细胞数,对CTL的诱导进行评价。
具体的评价利用ELIspot法进行。将得到的结果示于图2。评价条件为2×106个细胞/孔。图2的(A)为评价IFNγ的斑点形成数的图表,(B)为单独使用了肽时的斑点形成情况,(C)为使用了肽和含有MPL的DLPC-脱氧胆酸复合体(佐剂组合物)时的斑点形成情况。单独使用肽时,与无处置时为同等程度的斑点数,CTL未被诱导(图2(A))。另外,不含MPL的DLPC-脱氧胆酸复合体也与无处置时为同等程度的斑点数,未达成CTL的诱导(图2(A))。这是很有意义的结果,表明CTL的诱导需要活化固有免疫的刺激。
另一方面,在使用了作为佐剂组合物的含有MPL的DLPC-脱氧胆酸复合体时,与无处置、单独使用肽的情况相比,形成了大量的斑点(图2(A)~(C))。斑点数与阳性对照的IFA为同等程度,因此,认为与IFA同等程度地较强地诱导了CTL。IFA作为诱导CTL的佐剂而在临床试验中广泛使用,可期待具有同等活性的本发明在临床中的有效性。
(2)与MPL的比较
已知MPL活化固有免疫,即使单独使用也作为佐剂发挥功能。另外,已知MPL诱导细胞免疫。因此,作为与抗原一同施予的物质,对单独使用MPL的情况、和使用了pH敏感性载体和MPL的情况(佐剂组合物)下的细胞免疫的诱导进行比较。需要说明的是,抗原使用80μg的肽,MPL使用MPL含有率0.227或与上述相当的量。对于佐剂组合物而言,与上述(1)同样,制成含有MPL的DLPC-脱氧胆酸复合体的分散液。将上述的溶液或分散液分别在C57BL/6N小鼠的背部皮下施予1次,利用ICS法求出CTL诱导率。该情况下,CTL诱导率为,不易受到死细胞影响的规定的区域内的、IFNγ产生细胞相对于全部CD8阳性细胞的比例(IFNγ产生细胞/全部CD8阳性细胞)。
将得到的结果示于图3。图3的(A)为使用了肽的溶液(肽单独)时的结果,(B)为使用了肽和MPL分散液(MPL单独)时的结果,(C)为使用了肽和含有MPL的DLPC-脱氧胆酸复合体(佐剂组合物)时的结果。
使用了肽和MPL分散液时的CTL诱导率为0.27%,与单独使用了肽的情况(0.14%)相比,为稍微更高的值(图3(A)、(B))。另外,使用了肽和含有MPL的DLPC-脱氧胆酸复合体时的CTL诱导率为0.53%,与MPL分散液的情况相比,成为更高的值(图3(B)、(C))。虽然使用了同样的抗原,但包含MPL的pH敏感性载体(佐剂组合物)显示出比使用了MPL分散液的情况更高的CTL诱导率。该结果显示了佐剂组合物的CTL诱导增强效果。
以上的结果表明,MPL的CTL诱导效果通过pH敏感性载体而被增强。认为pH敏感性载体的促进膜破坏功能的效果使得抗原向细胞质基质的递送成为可能,通过促进交叉呈递,增强了CTL诱导效果。
(3)制备方法的研究
疫苗组合物包含抗原和佐剂组合物。认为通过对疫苗组合物的制备方法进行研究,可进一步提高佐剂组合物的CTL诱导增强效果,因此进行了研究。
使用分散制备法、混合制备法、及冷冻融化-冷冻干燥制备法,制备疫苗组合物的分散液,利用与上述(2)同样的方法,求出CTL诱导率。使两亲性物质为DLPC,使pH敏感性化合物为160nmol的脱氧胆酸。使MPL含有率为0.227,使抗原为80μg的肽。
将得到的结果示于图4。图4的(A)为使用了含有MPL的DLPC-脱氧胆酸复合体(分散制备法)时的结果,(B)为使用了含有MPL的DLPC-脱氧胆酸复合体(混合制备法)时的结果,(C)为使用了含有MPL的DLPC-脱氧胆酸复合体(冷冻融化-冷冻干燥制备法)时的结果。
通过分散制备法、混合制备法、及冷冻融化-冷冻干燥制备法制备的疫苗组合物均显示出比MPL单独时更高的CTL诱导率(0.53%、0.54%、1.47%、图4(A)~(C))。因此,确认了对于疫苗组合物中的佐剂组合物而言,无论是哪种制备方法,均具有CTL诱导增强效果。尤其是,通过冷冻融化-冷冻干燥制备法制备的疫苗组合物显示出非常高的CTL诱导率,表明冷冻融化-冷冻干燥制备法向疫苗组合物中的佐剂组合物赋予高CTL诱导增强效果(图4(C))。
(4)整合率的评价
在(3)中,通过冷冻融化-冷冻干燥制备法制备的疫苗组合物显示出非常高的CTL诱导率。
认为抗原向佐剂组合物中的整合,会提高向细胞质基质递送的效率,带来高的CTL诱导增强效果。因此,对抗原向佐剂组合物中的整合率进行了评价。首先,进行了评价体系的确认。在肽单独的溶液中,在过滤前后,Lowry法的吸光度不发生变化,肽未被滤器捕获(图5(A))。另一方面,对于基于TestWako的吸光度而言,通过滤器后,几乎完全消失(图5(B)),表明佐剂组合物被滤器捕获。由此认为,通过本评价体系可评价抗原向佐剂组合物中的整合率。
图5的(C)为利用分散制备法、混合制备法、及冷冻融化-冷冻干燥制备法制备疫苗组合物、并进行整合率评价的结果。对于分散制备法而言,整合率低,为5%左右,在混合制备法中,整合率也低。另一方面,对于冷冻融化-冷冻干燥制备法而言,得到了最大约60%的整合率(图5(C))。表明对于通过冷冻融化-冷冻干燥制备法制备的疫苗组合物而言,佐剂组合物与抗原以高比例成为一体。需要说明的是,使两亲性物质为DLPC,使pH敏感性化合物为160nmol的脱氧胆酸。MPL含有率为0.227。
认为冷冻融化-冷冻干燥制备法实现了抗原的高整合率,提高了佐剂组合物与抗原被同一核内体摄取的概率。结果,认为可高效地实现基于促进膜破坏功能的效果的细胞质基质递送,由此获得了也已在上述(3)的结果中显示的高CTL诱导增强效果。
(5)关于MPL的量
上述的(1)的结果中,确认了在使用了不含MPL的DLPC-脱氧胆酸复合体的情况下未达成CTL的诱导。这表明,为了将pH敏感性载体作为佐剂组合物利用,需要活化固有免疫的物质。因此,参考naturematerials2011vol:10(3)243-251、CancerRes.2011712858-2870的报道,进行使用了小鼠脾细胞的体外(exvivo)实验,由此考察活化固有免疫的刺激的强度。由此,求出必要的MPL的量。
首先,进行评价体系的确认。
图6示出了进行评价体系确认的结果。图6的(A)为在不进行染色的情况下对经培养的小鼠脾细胞进行评价的流式细胞术的结果,考察了死细胞的区域。图6的(B)及(C)为向经培养的小鼠脾细胞中添加单独的PBS、浓度为400ng/mL的LPS,并对CD80的表达增强进行确认的结果。图6的(D)为汇总了以各种浓度添加了LPS时的、流式细胞术的结果的图表。图6的(E)及(F)为对作为其他辅助刺激分子的CD86、及CD40的表达增强进行确认的结果。
在监视的区域中,CD80PE的荧光强度依赖于LPS量而增大(图6(B)~(D))。另外,作为其他辅助刺激分子的CD86、CD40也同样被增强(图6(E)、(F))。根据以上结果,确认了通过本评价体系可评价活化固有免疫的刺激的强度。
接下来,适当变更MPL的含量,进行基于佐剂组合物的、活化固有免疫的刺激的评价。将得到的结果示于图7。使佐剂组合物的两亲性物质为DLPC,使pH敏感性化合物为160nmol的脱氧胆酸。另外,作为比较试样,使用了PBS、pH敏感性载体(DLPC-脱氧胆酸)的分散液、脂多糖(LPS)的溶液。
图7的(A)为评价CD80的产生增强的结果,(B)及(C)为评价作为其他指标的CD86、CD40的表达增强的结果。对于不含MPL的DLPC-脱氧胆酸复合体而言,在0.1μL和10μL的任一添加量中,均显示与PBS单独时为同等程度的荧光强度,未确认到活化固有免疫的刺激(图7(A))。另一方面,确认到在增大MPL含有率的情况下,得到的荧光强度增大,活化固有免疫的刺激也为增大的倾向(图7(A))。该情况下,MPL含有率为0.00227时,MFI(荧光强度)的值为41.6,成为比PBS单独时的MFI(39.1)及MPL含有率为0时(pH敏感性载体)的MFI(38.8)更大的值。另外,对比MPL含有率为2.27时和为22.7时的MFI的值,分别为69.1及70.9,在活化固有免疫的刺激中,可观察到某种程度的饱和(图7(A)值是添加量为10μL的值)。
需要说明的是,也确认了作为其他的共刺激分子的CD40、CD86的产生增强,因此确认了这些佐剂组合物确实具有活化固有免疫的刺激(图7(B)、(C))。
(6)关于细胞免疫的增强与固有免疫的活化
此处,关于细胞免疫的增强与固有免疫的活化,对相关情况进行了验证。
首先,在(1)中未达成CTL的诱导的、不含MPL的DLPC-脱氧胆酸复合体,在(5)中未确认到活化固有免疫的刺激。图8(A)为更详细的研究结果。即使在以0.5μL~50μL的量添加不含MPL的DLPC-脱氧胆酸复合体的情况下,CD80PE的荧光强度也均未较PBS的情况有所增加,表明不含MPL的DLPC-脱氧胆酸复合体不具有活化固有免疫的刺激(图8(A))。
另一方面,在(2)中显示出CTL诱导增强效果的佐剂组合物的MPL含有率为0.227,在(5)中确实确认了活化固有免疫的刺激。根据以上结果,认为细胞免疫的增强与固有免疫的活化相关。
需要说明的是,图8(B)为针对各种样品,向经培养的小鼠脾细胞中添加5μL的溶液,并考察CD80的产生增强(固有免疫的活化)的结果。为使用了下述溶液的结果:肽和OVA溶液为800μg/mL,单独使用DLPC时为1000nmol/mL,单独使用脱氧胆酸时为1600nmol/mL的溶液。
添加了单独的肽、单独的OVA、单独的DLPC、及单独的脱氧胆酸情况下,与添加了PBS的情况相比,CD80PE的荧光强度没有改变,未确认到活化固有免疫的刺激(图8(B))。
(7)对促进膜破坏功能的效果产生的影响
(7-1)MPL的影响
考察了含有MPL对佐剂组合物的促进膜破坏功能的效果的影响。将结果示于图9。图9的(A)为向溶出性试验的评价体系施予相当于MPL含有率为0.227的量的MPL的情况下的溶出率,(B)为含有MPL的DLPC-脱氧胆酸复合体在各pH条件下的溶出率,(C)为改变MPL含有率时的DLPC-脱氧胆酸复合体在pH7.4和pH5.0下的溶出率。
使MPL分散到PBS或DMSO中后,添加到细胞中,考察了低pH条件下的溶出率的增大,结果,在所有的情况下,均与PBS单独时为同等程度。(图9(A))。表明MPL不具有引起溶出的性质。
接下来,使pH敏感性载体中以各种比例含有MPL,制成佐剂组合物,考察了各种pH条件下的溶出率。即使在MPL含有率为0.227、2.27的情况下,各pH条件下的溶出率也显示了与通常的pH敏感性载体(DLPC-脱氧胆酸复合体)一致的值(图9(B))。因此表明,对于表现促进膜破坏功能的效果的pH而言,含有MPL的影响小。另外,监视pH5.0的溶出率,考察了宽范围的MPL含有率的影响,结果,即使MPL含有率为22.7,溶出率较之通常的pH敏感性载体(MPL含有比例=0)也未发生变化(图9(C))。再次确认了含有MPL对促进膜破坏功能的效果的影响小。认为由于含有的MPL相对于pH敏感性载体的两亲性物质而言为少量,所以由MPL对促进膜破坏功能的效果产生的影响小。
(7-2)制备方法的影响
对于包含抗原和佐剂组合物的疫苗组合物,考察了制备方法对促进膜破坏功能的效果的影响。图10为通过分散制备法、混合制备法、冻结熔融-冷冻干燥法制备的疫苗组合物的pH7.4和pH5.0的溶出率。需要说明的是,作为疫苗组合物的两亲性物质,使用DLPC,作为pH敏感性化合物,使用脱氧胆酸。MPL含有率为0.227,复合化量为160nmol。使用了15μg的肽。
无论是利用何种制备方法制备的疫苗组合物,pH7.4和pH5.0下的溶出率均显示出同样的值,因此确认了疫苗组合物制备方法的不同不会影响促进膜破坏功能的效果(图10)。
(7-3)pH敏感性化合物的复合化量的影响
图11为在各种脱氧胆酸复合化量下、考察含有MPL对佐剂组合物的促进膜破坏功能的效果的影响的结果。使佐剂组合物的两亲性物质为DLPC,脱氧胆酸的复合化量为(A)10、(B)20、(C)640nmol。MPL含有率为0.0227及22.7。作为比较试样,使用了单独的DLPC、单独的脱氧胆酸、pH敏感性载体(不含MPL)。在pH7.4和pH5.0的条件下测定了溶出率。
首先,不含MPL的佐剂组合物(pH敏感性载体,图中:不含MPL)在所有的复合化量下均表现促进膜破坏功能的效果(图11(A)~(C))。接下来,对于MPL含有率为0.0227及22.7的佐剂组合物的溶出率而言,在pH7.4及pH5.0这两种条件下,均显示出与不含MPL的佐剂组合物的溶出率同样的值,具有同等程度的促进膜破坏功能的效果(图11(A))。另外,在复合化量为20及640的佐剂组合物中也确认了同样的结果(图11(B)、(C))。上述结果表明,在所有的复合化量的佐剂组合物中,含有MPL均不影响促进膜破坏功能的效果。
确认了pH敏感性化合物的复合化量的不同不会导致含有MPL对促进膜破坏功能的效果的影响(图11)。
(7-4)由两亲性物质或pH敏感性化合物的种类产生的影响
考察了两亲性物质及pH敏感性化合物的种类对佐剂组合物的促进膜破坏功能的效果的影响。
表1及表2分别示出对使用各种两亲性物质制备的佐剂组合物的促进膜破坏功能的效果、和使用各种pH敏感性化合物制备的佐剂组合物的促进膜破坏功能的效果进行评价的结果。
[表1]
表1:使用各种两亲性物质制备的佐剂组合物的促进膜破坏功能的效果
数值为溶出率(%),±为SD
[表2]
表2.使用各种pH敏感性化合物制备的佐剂组合物的促进膜破坏功能的效果
数值为溶出率(%),±为SD
首先,对于所有的两亲性物质、pH敏感性化合物而言,制备的pH敏感性载体(表中,MPL:0)均表现促进膜破坏功能的效果(表1、表2)。接下来,对于包含MPL的佐剂组合物(表中,MPL:0.227)而言,在使用任意的两亲性物质、pH敏感性化合物制备得到的情况下,在pH7.4和pH5.0这两种条件下,均成为与不含MPL的佐剂组合物、即pH敏感性载体同样的溶出率,同样地具有促进膜破坏功能的效果(表1、表2)。上述结果表明,对于使用任意的两亲性物质、任意的pH敏感性化合物制备的佐剂组合物而言,含有MPL均不影响促进膜破坏功能的效果。
确认了两亲性物质或pH敏感性化合物的种类不同,与含有MPL对促进膜破坏功能的效果的影响没有关系。
根据以上的(7-1)~(7-4)的结果,可以认为在制备方法、复合化量、两亲性物质、pH敏感性化合物这些重要因素中,无论进行何种设定,佐剂组合物均具有促进膜破坏功能的效果。
(8)对促进膜融合的效果产生的影响
图12为考察含有MPL对佐剂组合物的促进膜融合的效果的影响的结果。使两亲性物质为DLPC,使pH敏感性化合物为160nmol的脱氧胆酸。另外,使MPL含有率为0~0.227,利用分散制备法制备佐剂组合物。由图12的结果表明,含有MPL不会影响促进膜融合的功能。
(9)对活化固有免疫的刺激的影响
(9-1)抗原量的影响
对于包含抗原和佐剂组合物的疫苗组合物,考察了抗原量对活化固有免疫的刺激的强度的影响。需要说明的是,使两亲性物质为DLPC,作为pH敏感性化合物,使用160nmol的脱氧胆酸。使用MPL含有率为0.0227(以下,有时简称为“低MPL”)及22.7(以下,有时简称为“高MPL”)的2种佐剂组合物,利用分散制备法制备疫苗组合物。
将结果示于图13。图13的(A)为将包含各种量的肽的疫苗组合物添加到经培养的小鼠脾细胞中的情况下的CD80PE的荧光强度,(B)为添加了包含各种量的OVA蛋白质(以下,简称为“OVA”)的疫苗组合物的情况下的CD80PE的荧光强度。
在低MPL及高MPL这两方中,CD80PE的荧光强度不依赖于肽量、及OVA量,成为恒定的值(图13(A)、(B))。即,表明抗原量不影响活化固有免疫的刺激的强度。
(9-2)由两亲性物质的种类产生的影响
考察了两亲性物质对佐剂组合物的活化固有免疫的刺激的影响。表3、图14中示出了使用各种两亲性物质制备的佐剂组合物的结果。使pH敏感性化合物为160nmol的脱氧胆酸,使MPL含有率为0.0227~22.7。制备方法为分散制备法。
[表3]
表3.两亲性物质对活化固有免疫的刺激的影响
与两亲性物质单独时相比,无论使用何种两亲性物质,佐剂组合物均成为高的CD80PE的荧光强度,附加了活化固有免疫的刺激(表3、图14)。该结果表明,无论使用何种两亲性物质,均作为佐剂组合物发挥功能。
(9-3)由pH敏感性化合物的复合化量产生的影响
图15为考察了pH敏感性化合物的复合化对佐剂组合物及疫苗组合物的活化固有免疫的刺激的强度的影响的结果。使两亲性物质为DLPC,使pH敏感性化合物为脱氧胆酸。使MPL含有率为0.0227和227,使抗原为0μg(佐剂组合物)和400μg(疫苗组合物)。制备方法均为分散制备法。需要说明的是,使用5μL的分散液实施评价。
图15的(A)为在MPL含有率为0.0227的情况下,使各种量的脱氧胆酸与DLPC复合化时的CD80PE的荧光强度,(B)为在MPL含有率为22.7的情况下,使各种量的脱氧胆酸与DLPC复合化时的CD80PE的荧光强度。
在MPL含有率为0.0227及22.7这两种情况下,CD80PE的荧光强度与脱氧胆酸的复合化及复合化量无关,成为一定的值。即,表明脱氧胆酸的复合化不影响佐剂组合物及疫苗组合物的活化固有免疫的刺激的强度(图15(A)、(B))。
(9-4)由pH敏感性化合物的种类产生的影响
图16为考察了pH敏感性化合物的种类对疫苗组合物的活化固有免疫的刺激的强度的影响的结果。图16的(A)及(B)为将使用各种pH敏感性化合物制备的疫苗组合物添加到经培养的小鼠脾细胞中的情况下的CD80的荧光强度。使两亲性物质为DLPC,使pH敏感性化合物的复合化量为160nmol。使MPL含有率为0.0227~22.7,使抗原为400μg的肽。制备法为混合制备法。
对于所有的pH敏感性化合物而言,CD80PE的荧光强度均大于抗原和PBS(图中为PBS单独),附加了活化固有免疫的刺激。即,表明pH敏感性化合物的种类不影响活化固有免疫的刺激的强度(图16(A)、(B))。
根据以上的(9-1)~(9-4)的结果,可以认为在抗原量、两亲性物质、复合化量、pH敏感性化合物这些重要因素中,无论是何种设定,均作为佐剂组合物发挥功能。
(10)免疫应答诱导的验证
(10-1)MPL量的影响
在MPL含有率为0.0227(低MPL)、及22.7(高MPL)的情况下,验证了佐剂组合物的CTL诱导增强效果。使两亲性物质为DLPC,使pH敏感性化合物为160nmol的脱氧胆酸。使抗原为每1只3.2μg~400μg的OVA肽,向C57BL/6N小鼠的背部皮下施予1次。制备法为分散制备法,使各组n=3。将结果示于下表4。需要说明的是,MPL单独是使用了抗原和MPL分散液的情况下的结果。
[表4]
表4.低MPL和高MPL的CTL诱导增强效果的验证
两亲性物质:DLPC
pH敏感性化合物:160nmol的脱氧胆酸
MPL含有率:低MPL(0.0227),高MPL(22.7)
抗原:3.2~400μg的肽
制备法:分散制备法
各组:n=3(3只合并进行评价)
对相同抗原量的结果进行比较时,在两种MPL含有率下,与单独使用了MPL的情况相比,使用了佐剂组合物的情况下成为更高的CTL诱导率(表4)。在上述的条件下,显示出佐剂组合物的CTL诱导增强效果。另外,图17中示出使用了疫苗组合物的情况下的、ELIspot法的评价结果。使用的抗原为80μg的OVA,图17的(A)为在高MPL的条件下、使用了肽和MPL分散液(MPL单独)时的斑点形成情况,(B)为在高MPL的条件下、使用了肽和佐剂组合物时(疫苗组合物)的斑点形成情况。需要说明的是,评价条件为1×106个细胞/孔。
在ELIspot法的评价中,使用了佐剂组合物时,与MPL单独时相比诱导了大量的IFNγ的斑点,支持了上述结果(图17(A)、(B))。
(10-2)关于pH敏感性化合物的复合化量的影响
考察了pH敏感性化合物的复合化量对佐剂组合物的CTL诱导增强效果的影响。具体而言,使DLPC与各种量的脱氧胆酸复合化,制备佐剂组合物,对CTL诱导增强效果进行验证。使MPL含有率为0.227,将80μg的肽、或80μg的OVA作为抗原施予给C57BL/6N小鼠。利用分散制备法进行制备,使各组n=1。将结果示于表5。
[表5]
表5.各种复合化量下的CTL诱导增强效果
两亲性物质:DLPC
pH敏感性化合物:10~640nmol的脱氧胆酸
MPL含有率:0.227
抗原:80μg的肽、或80μg的OVA
制备法:分散制备法
各组:n=1
在肽、及OVA这两方中,无论是何种复合化量,与MPL单独(抗原和MPL分散液)的情况相比,使用了佐剂组合物时的CTL诱导率均显示出更高的值(表5)。表明相对于100nmol的两亲性物质,以10~640nmol的pH敏感性化合物,可得到CTL诱导增强效果。
(10-3)由两亲性物质或pH敏感性化合物的种类产生的影响
接下来,考察了两亲性物质及pH敏感性化合物的种类对佐剂组合物的CTL诱导增强效果的影响。具体而言,使用各种两亲性物质或pH敏感性化合物制备佐剂组合物,验证有无CTL诱导增强效果。
此时,使MPL含有率为0.227,使用80μg的OVA作为抗原。使pH敏感性化合物的复合化量为160nmol,利用分散制备法进行制备。各组n=1。
表6中示出了使用各种两亲性物质进行制备时的结果,表7中示出了使用各种pH敏感性化合物制备的佐剂的结果。
[表6]
表6.使用了各种两亲性物质时的佐剂组合物的CTL诱导增强效果
两亲性物质:各100nmol
pH敏感性化合物:160nmol的脱氧胆酸
MPL含有率:0.227
抗原:80μg的OVA
制备法:分散制备法
各组:n=1
两亲性物质-MPL:将两亲性物质与MPL形成的混合薄膜分散到抗原溶液中而得到的产物
[表7]
表7.使用了各种pH敏感性化合物时的佐剂组合物的CTL诱导增强效果、和抗原特异性
两亲性物质:DLPC
pH敏感性化合物:各160nmol
MPL含有率:0.227
抗原:80μg的OVA
制备法:分散制备法
各组:n=1
无论在使用何种两亲性物质、及何种pH敏感性化合物进行制备的情况下,与MPL单独的情况相比,使用了佐剂组合物时的CTL诱导率均显示出更高的值,确认了佐剂组合物的CTL诱导增强效果(表6、表7)。
另外,图18中示出了使用各种pH敏感性化合物制备的疫苗组合物的、ELIspot法的评价结果。评价条件为2×106个细胞/孔,使用的抗原为80μg的OVA。MPL含有率为0.227,作为刺激固有免疫的物质、或佐剂组合物,图18的(A)为使用了MPL分散液时的斑点形成情况,(B)为使用了含有MPL的DLPC-脱氧胆酸时的斑点形成情况,(C)为使用了含有MPL的DLPC-胆酸时的斑点形成情况,(D)为使用了含有MPL的DLPC-熊脱氧胆酸时的斑点形成情况,(E)为使用了含有MPL的DLPC-猪脱氧胆酸时的斑点形成情况。
无论是使用了何种pH敏感性化合物制备的佐剂组合物,与MPL单独的情况相比,均诱导了大量的IFNγ的斑点,表明对于佐剂组合物而言,无论在使用哪种pH敏感性化合物制备的情况下,均具有CTL诱导增强效果(图18(A)~(E))。上述结果与ICS法中的结果一致。
(11)关于制备方法
对使用了蛋白质的情况下的、疫苗组合物的制备方法的不同所带来的影响进行了考察。图19为表示利用各制备方法制备的疫苗组合物的CTL诱导率的图表。疫苗组合物利用分散制备法、混合制备法、冷冻融化-冷冻干燥制备法进行制备,使两亲性物质为DLPC,使pH敏感性化合物为160nmol的脱氧胆酸。使MPL含有率为0.0227~22.7,作为抗原施予80μg的OVA。各组为n=1。
由图19也表明,无论是何种制备方法,与MPL单独时相比,疫苗组合物均显示出更高的CTL诱导率。另外,冷冻融化-冷冻干燥制备法显示出很高的CTL诱导率。上述结果表明,无论是哪种制备疫苗组合物的方法,佐剂组合物均具有CTL诱导增强效果(图19)。即使在使用蛋白质作为抗原的情况下,与其他制备方法相比,利用冷冻融化-冷冻干燥制备法制备的疫苗组合物也显示高的CTL诱导率(图19)。
(12)关于抗原特异性
对通过疫苗组合物诱导的CTL是否具有抗原特异性进行了确认。具体而言,对向从小鼠摘出的脾细胞的悬浮液中添加作为抗原的OVA肽的情况(有再刺激),与不添加OVA肽而仅利用培养基进行培养的情况(无再刺激)下的CTL诱导率进行了比较。使疫苗组合物的两亲性物质为DLPC,使pH敏感性化合物为160nmol的脱氧胆酸。MPL含有率为22.7,向C57BL/6N小鼠施予80μg的OVA。疫苗组合物的分散液通过混合制备法进行制备。各组n=1。
将得到的结果示于图20。图20的(A)为存在再刺激的情况下的CTL诱导率,(B)为无再刺激的情况下的CTL诱导率。有再刺激的情况下的CTL诱导率为1.08%,确认了CTL的诱导。另一方面,无再刺激的情况下的CTL诱导率为0.31%,与添加了抗原的再刺激的情况相比为小的值(图20)。在使用了各种pH敏感性化合物的情况下均确认到了同样的结果(表7)。上述结果表明,通过疫苗组合物诱导的CTL具有抗原特异性。
此外,在ELIspot法中也进行了抗原特异性的确认。使疫苗组合物的两亲性物质为DLPC,使pH敏感性化合物为160nmol及640nmol的脱氧胆酸。MPL含有率为0.227,向C57BL/6N小鼠施予80μg的OVA或80μg的肽。疫苗组合物的分散液通过分散制备法进行制备。评价条件为2×106个细胞/孔。
将得到的结果示于图21。图21的(A)~(F)为添加作为抗原的OVA肽并进行培养时(有再刺激)的斑点形成情况,(G)~(L)为仅利用培养基进行培养时(无再刺激)的斑点形成情况。与施加了再刺激的情况相比,在未施加再刺激的情况下,使用了疫苗组合物时的斑点形成显著减少,通过疫苗组合物诱导的CTL具有抗原特异性(图21)。在ELIspot法中,得到了给出与ICS法同样的结论的结果。
(13)关于体液免疫的增强
验证了基于疫苗组合物的体液免疫的诱导、及佐剂组合物的体液免疫诱导增强效果。具体而言,将按照各种制备法制备的疫苗组合物向C57BL/6N小鼠的背部皮下施予2次,测定血中的IgG抗体效价。使两亲性物质为DLPC,使pH敏感性化合物为160nmol的脱氧胆酸。MPL含有率为0.227,使抗原为80μg的OVA。作为比较,设置未施予抗原的无处置组、和包含抗原的MPL单独的组。各组n=3。
将得到的结果示于图22。无论是分散制备法、混合制备法、及冷冻融化-冷冻干燥制备法中的哪种制备法,与无处置组相比,疫苗组合物均显示高IgG抗体效价,因此表明,通过疫苗组合物,可诱导体液免疫(图22)。
另外,无论是哪种制备方法的疫苗组合物(抗原和佐剂组合物),抗体效价的值均显示出比MPL单独组(抗原和MPL分散液)更高的值(图22)。与单独使用MPL的情况相比,在使用了佐剂组合物的情况下显示更高的抗体效价,因此表明,佐剂组合物具有体液免疫诱导增强效果(图22)。
(14)关于包含CpG-DNA的佐剂组合物
验证了使用CpG-DNA(CpG-ODN)作为MPL以外的活化固有免疫的物质的情况下的、佐剂组合物的CTL诱导增强效果。具体而言,将每一只5μg的CpG-ODN、和DLPC-脱氧胆酸复合体混合,形成佐剂组合物,进一步混合80μg的OVA,由此制成疫苗组合物。使脱氧胆酸为160nmol,使疫苗组合物的总量为100μL。使各组为1只,向C57BL/6N小鼠施予。ELIspot法中的评价条件为2×106个细胞/孔。
表8为施加抗原的再刺激的情况和未施加再刺激的情况下的CTL诱导率,为将抗原和CpG-ODN(CpG-ODN单独)、或抗原和包含CpG-ODN的佐剂组合物(疫苗组合物)用于施予时的结果。与CpG-ODN单独的情况相比,使用了包含CpG-ODN的佐剂组合物时的CTL诱导率显示更高的值(表8)。表明即使在使用了MPL以外的活化固有免疫的物质的情况下,佐剂组合物也具有CTL诱导增强效果。另外,与施加再刺激的情况相比,未施加再刺激的情况下的CTL诱导率成为较小的值,因此表明,与MPL的情况同样,通过包含CpG-ODN的疫苗组合物诱导的CTL具有抗原特异性(表8)。在ELIspot法的评价中也得到了与上述同样的结果(图23)。
需要说明的是,图23中,(A)为向小鼠施予80μg的OVA和单独的CpG-ODN时的斑点形成情况,(B)为使用了80μg的OVA和包含CpG-ODN的佐剂组合物时的斑点形成情况,(C)为未施加抗原的再刺激时的、向小鼠施予80μg的OVA和单独的CpG-ODN时的斑点形成情况,(D)为未施加抗原的再刺激时的、使用了80μg的OVA和包含CpG-ODN的佐剂组合物时的斑点形成情况。
[表8]
表8.包含CpG-DNA的佐剂组合物的CTL诱导增强效果、和抗原特异性
两亲性物质:DLPC
pH敏感性化合物:160nmol的脱氧胆酸
CpG-ODN:5μg
抗原:80μg的OVA
各组:n=1
本申请以于2013年11月29日提出申请的日本专利申请号2013-248543号为基础,将其公开内容整体并入本文作为参照。
Claims (9)
1.佐剂组合物,包含pH敏感性载体、和具有活化固有免疫的刺激的物质。
2.如权利要求1所述的佐剂组合物,其中,所述pH敏感性载体表现促进膜破坏功能的效果,且包含下述物质:
选自脱氧胆酸、胆酸、熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、高级胆汁酸、甘氨脱氧胆酸、甘草酸、甘草亭酸及它们的盐中的至少1种pH敏感性化合物,和
选自碳原子数10~12的磷脂酰胆碱、碳原子数12~18的聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯、碳原子数16~18的山梨糖醇酐脂肪酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油及α-生育酚中的至少1种两亲性物质。
3.如权利要求1或2所述的佐剂组合物,其中,所述具有活化固有免疫的刺激的物质为单磷酰脂质A。
4.如权利要求2或3所述的佐剂组合物,其中,相对于100mol所述两亲性物质,所述具有活化固有免疫的刺激的物质的含量为0.0227~22.7mol。
5.疫苗组合物,包含抗原及权利要求1~4中任一项所述的佐剂组合物。
6.如权利要求5所述的疫苗组合物,其中,所述抗原为肽或蛋白质。
7.如权利要求5或6所述的疫苗组合物,其中,相对于100nmol所述两亲性物质,所述抗原的含量为3.2~400μg。
8.佐剂组合物的制造方法,包括使pH敏感性化合物和两亲性物质和具有活化固有免疫的刺激的物质缔合的工序,
所述pH敏感性化合物为选自脱氧胆酸、胆酸、熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、高级胆汁酸、甘氨脱氧胆酸、甘草酸、甘草亭酸及它们的盐中的至少1种,
所述两亲性物质为选自碳原子数10~12的磷脂酰胆碱、碳原子数12~18的聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯、碳原子数16~18的山梨糖醇酐脂肪酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油及α-生育酚中的至少1种。
9.疫苗组合物的制造方法,包括以下工序:
使pH敏感性化合物和两亲性物质和具有活化固有免疫的刺激的物质缔合的工序;
在通过所述缔合而得到的缔合体中混合抗原的工序;
将通过所述混合而得到的混合物冷冻融化的工序;以及
将通过所述冷冻融化而得到的融化物冷冻干燥的工序,
所述pH敏感性化合物为选自脱氧胆酸、胆酸、熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、猪脱氧胆酸、高级胆汁酸、甘氨脱氧胆酸、甘草酸、甘草亭酸及它们的盐中的至少1种,
所述两亲性物质为选自碳原子数10~12的磷脂酰胆碱、碳原子数12~18的聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯、碳原子数16~18的山梨糖醇酐脂肪酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油及α-生育酚中的至少1种。
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