CN105784856A - 超临界流体-液相色谱仪及其分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种超临界流体-液相色谱仪及其分析方法，其课题在于实现能以一台分析装置执行超临界流体色谱分析法和液相色谱分析法。使用以在加压状态与朝向大气开放的开放状态之间切换的方式构成的阀门作为超临界流体色谱仪中的背压阀，通过使供给超临界流体的泵停止、并使供给用作改性剂的溶剂的泵继续工作，从而从超临界流体色谱分析法的分析状态向液相色谱分析法实施切换。

Description

超临界流体-液相色谱仪及其分析方法

技术领域

本发明为涉及一种使用超临界流体作为流动相的超临界流体色谱分析法(SFC)的发明。

背景技术

近年来，随着以质谱分析仪为首的检测器的高灵敏度化、以及检测时的分子的选择性的提高等技术革新，通过联结各种色谱分析法与检测器，可对低分子化合物(分子量约为1000以下)进行全面的定量分析。例如，在作为基于生物体内的总代谢物的Omics科学的代谢组学研究中，由于能高解析度且定量地解析微生物、植物、动物或食品试样中的复杂表型，因此不仅对基础科学研究作出贡献，在药物开发或毒性试验、食品功能解析等产业上的实用性研究中也开始作为强大的解析工具而加以使用。此外，在农药残留试验或药物残留试验领域内，也已成为必需的技术。

一般来说，由于低分子化合物的理化性质多种多样，因此需要各种分离技术以对这些理化性质进行总括性地测定。

SFC将超临界流体用于流动相(参考专利文献1)。超临界流体是超过临界温度、临界压力的状态的物质，并具有低黏性、高扩散性这种对于色谱分析法而言较为优选的性质。SFC即便在高流速分析中也保持较高的分离能力，并具有可通过极性溶剂(改性剂)的添加或者使温度、背压发生变化来选择较宽范围的分离模式的可能性。SFC中通常所使用的二氧化碳由于临界压力为7.38MPa，临界温度为比较接近常温的31.1℃，无引火性或化学反应性，并且可以以低廉的价格获得高纯度的CO2等原因，最常被用于SFC中。超临界二氧化碳(SCCO2)具有接近己烷的低极性物性，通过添加甲醇之类的极性有机溶剂作为改性剂，可较大程度地改变流动相的极性。因此，到目前为止，SFC一直被用作对于作为疏水性代谢物的代表的类脂体类的高速分离分析较为有用的分离分析方法。

另一方面，虽然液相色谱分析(LC)在代谢物分析中通用，可以说是最广为使用的色谱分析方法，但测定条件却根据测定对象而不同，无法以1台LC同时分离有着较宽范围的代谢物。

[以往技术文献]

[专利文献]

[专利文献1]

日本专利特开2006-52968号公报

发明内容

发明要解决的问题

由于超临界流体色谱分析法和液相色谱分析法中存在分别适于两种分析方法的分析对象化合物，因此只要能组合两种分析方法，就能囊括较宽范围的化合物。

因此，如果能以1台分析装置执行超临界流体色谱分析法和液相色谱分析法，则较为方便。例如，尝试考虑以1台分析装置从超临界流体色谱分析法切换至液相色谱分析法。在利用超临界流体色谱分析法的分析中，施加有背压以将流动相保持在超临界状态。如果在分析中持续增加作为改性剂的有机溶剂的添加量而将流动相仅设为该有机溶剂，则虽然切换成了利用该有机溶剂进行的液相色谱分析法，但由于流动相的黏性会随着改性剂的添加量增加而增加，因此施加至送液泵或管柱、检测器的单元部的压力会增加。随着压力增加，有可能因超过送液泵或管柱、检测器单元部的耐压极限而引起送液泵的密封泄露、管柱或检测器单元的耐久性降低。也就是说，可知，关于从超临界流体色谱分析法向仅有改性剂的液相色谱分析法的分析模式的切换，虽然考虑过使用现有的超临界流体色谱仪作为超临界流体色谱分析的延长，但不容易实现。

本发明的目的在于实现如下装置及其方法，即，该装置为，即便存在所述问题也能以1台分析装置执行超临界流体色谱分析法和液相色谱分析法的装置。

解决问题的技术手段

本发明的超临界流体-液相色谱仪具有：第一溶剂输送部，其利用第一泵输送作为超临界流体的溶剂；第二溶剂输送部，其利用第二泵输送相对于所述溶剂具有相容性且具有极性的有机溶剂；分离柱，其被配置于所述第一溶剂输送部与所述第二溶剂输送部之间的合流部的下游的分析流道上；试样注入部，其被配置在所述分析流道中的所述合流部与所述分离柱之间，并将试样注入到所述分析流道中；背压阀，其相对于所述分析流道的流动相的流动而被配置于所述分离柱的下游，并能够设为加压状态，所述加压状态保持在将所述分析流道内的流动相维持在超临界流体状态的压力；检测器，其被配置于所述分析流道上的所述分离柱与所述背压阀之间、以及所述背压阀的朝向大气的开放口的外侧这两个位置中的至少一个位置，并对从所述分离柱洗提出来的试样成分进行检测；以及，控制部，其对所述第一泵、所述第二泵及所述背压阀的动作进行控制。

并且，所述背压阀是以在所述加压状态与朝大气开放的开放状态之间切换的方式构成的阀，所述控制部是以从超临界流体色谱分析法向液相色谱分析法实施切换的方式构成的控制部，所述超临界流体色谱分析法将所述第一泵及所述第二泵设为运作状态并将所述背压阀维持于所述加压状态，所述液相色谱分析法使所述第一泵停止、使所述第二泵继续工作，并将所述背压阀设为开放状态。

本发明的分析方法使用包括如下构件的分析装置：分析流道，其具有分离柱；流动相输送部，其对所述分析流道供给流动相；试样注入部，其在所述分析流道上对所述分离柱与所述流动相输送部之间注入试样；背压阀，其相对于所述分析流道的流动相的流动而被配置于所述分离柱的下游，并能够设为加压状态，且所述加压状态保持在将所述分析流道内的流动相维持在超临界流体状态的压力的加压状态；以及，检测器，其被配置于所述分析流道上的所述分离柱与所述背压阀之间、以及所述背压阀的朝大气的开放口的外侧这两个位置中的至少一个位置，并对从所述分离柱洗提出来的试样成分进行检测；且本发明的分析方法包括以下步骤(A)至步骤(C)。

步骤(A)从所述流动相输送部供给作为流动相而能够变为超临界状态的流动相，并在利用所述背压阀将所述分析流道内的流动相维持在超临界流体状态的同时从所述试样注入部注入试样，从而开始超临界流体色谱分析法的分析；

步骤(B)在所述流动相变为超临界流体的溶剂与相对于该溶剂具有相容性且具有极性的有机溶剂所形成的混合溶液的超临界流体色谱分析法的分析之后，将从所述流动相输送部供给的流动相仅切换为所述有机溶剂，并将所述背压阀朝大气压开放，由此从超临界流体色谱分析法的状态切换至液相色谱分析法的状态；以及

步骤(C)其后，进行利用包含所述有机溶剂的流动相的液相色谱分析法的分析。

发明的效果

由于本发明是以如下方式构成，即，使用以在加压状态与朝大气开放的开放状态之间进行切换的方式构成的阀门作为超临界流体色谱仪中的背压阀，通过使供给超临界流体的泵停止、并使供给用作改性剂的溶剂的泵继续工作而从超临界流体色谱法的分析状态向液相色谱分析法实施切换，因此能以1台分析装置执行超临界流体色谱分析法和液相色谱分析法。

附图说明

图1是表示一例实施例的超临界流体色谱-液相色谱分析法的分析装置的简要构成图。

图2是表示在该实施例中用作背压阀的压力控制阀的一个示例之图，图2(A)为剖视图，图2(B)是对阀机构部分进行放大表示的剖视图，图2(C)是以卸下阀体构件及挤压构件后的状态表示该压力控制阀的凹部的形状的剖视图，图2(D)是从上方观察该压力控制阀的凹部内之图。

表示该实施例中的色谱图之图。

图3是表示该实施例的动作的一个示例的时序图。

图4是表示该动作的流程图。

图5是表示另一实施例中的流动相输送部的流道图。

图6是表示该实施例的动作的一个示例的时序图。

具体实施方式

在一例实施方式中，控制部具有分析程序存储部，该分析程序存储部存储有相对于时间而设定了所述第一泵、第二泵及背压阀的运作条件的分析程序。并且，控制部是以根据其分析程序而执行从超临界流体色谱分析法向液相色谱分析法的切换的方式。

在另一例实施方式中，利用第三泵将第三溶剂输送至第三溶剂输送部，该第三溶剂输送部与所述合流部连接，该第三溶剂能够与作为改性剂的有机溶剂一起构成液相色谱分析法的流动相。并且，控制部的分析程序存储部还存有用于液相色谱分析中的梯度分析的分析程序，控制部是以在液相色谱分析中控制第二泵和第三泵而进行高压梯度分析的方式构成。

在又一例实施方式中，第二溶剂输送部是以如下方式构成：利用第二泵，除了可供给作为改性剂的有机溶剂以外，还可供给能与该有机溶剂一起构成液相色谱分析法的流动相的第三溶剂。并且，控制部的分析程序存储部还存有用于液相色谱分析法中的梯度分析的分析程序，控制部是以如下方式构成：在超临界流体色谱分析法中，以从第二溶剂输送部仅供给作为改性剂的有机溶剂的方式控制第二溶剂输送部的动作，并在液相色谱分析法中，从第二溶剂输送部供给该有机溶剂和第三溶剂而进行低压梯度分析。

在分析方法的一例实施方式中，步骤(C)为向有机溶剂中混合其他溶剂作为流动相的梯度分析。

将超临界流体-液相色谱仪的一实施例示于图1。为了供给流动相，设置有利用第一泵(SFC泵)4输送液化气瓶2中所收容的超临界流体的第一溶剂输送部，和利用第二泵(改性剂泵)10输送改性剂溶液8的第二溶剂输送部。第一溶剂输送部的送液流道6和第二溶剂输送部的送液流道12与配置于合流部上的混合器14连接。

从混合器14输送流动相的流道为分析流道16。在分析流道16中，从相对于流动相的流向的上游侧起，配置有向该分析流道16中注入试样的试样注入部18、分离柱20、第一检测器22、背压阀24及第二检测器26。分离柱20被收容在管柱加热炉(图示省略)内并保持于固定温度。

作为超临界流体，可以使用例如液态的二氧化碳，作为改性剂，可以使用例如甲醇或甲醇溶液。试样注入部18可以使用例如自动采样器。

背压阀24为如下阀门，即，为了在流动相为可变为超临界流体状态的流动相时将分析流道16内的流动相维持于超临界流体状态而能够将分析流道16内保持于固定压力(加压状态)的阀门；且背压阀24是以在其加压状态与朝大气开放的开放状态之间切换的方式构成。

作为配置于分离柱20与背压阀24之间的第一检测器22，可以使用例如紫外可视吸光计。从试样注入部18导入至分析流道16的试样由分离柱20分离，从而由检测器22转换为电信号。

作为配置于背压阀24的下游侧的第二检测器26，可以使用例如质谱分析仪或ELSD(蒸发光散射检测器：EvaporatedLightScatteringDetector)等必须去除流动相的检测器。虽然在背压阀24的上游侧的分析流道16内，流动相为超临界状态或液体状态，但是由于在背压阀24的下游侧流动相在大气压下被释出，因此由分离柱20分离并洗提出来的试样成分在背压阀24的下游侧与流动相一起变为雾状而释出。

在使用质谱分析仪作为检测器26的情况下，通过对背压阀24的下游的流动相的释出口与质谱分析仪的离子化室之间施加电压(电喷射电压)而将洗提出来的试样成分离子化，并利用质谱分析仪进行分析。

虽然可以同时设置检测器22和26，但也可视用途而仅设置其中一个。例如，在仅实施分析时，可仅设置任意一个。此外，例如在实施分取时，仅设置检测器22。

为了控制第一泵4、第二泵10及背压阀24的动作，设置有控制部60。控制部60是以实施从超临界流体色谱分析法向液相色谱分析法切换的方式构成，该超临界流体色谱分析是将第一泵4及第二泵10设为工作状态并将背压阀24维持于加压状态，该液相色谱分析是使第一泵4停止、使第二泵10继续工作并将背压阀24设为开放状态。

控制部60上连接有数据处理部62。数据处理部62获取由检测器22、26得到的检测信号，与控制部60一起制作色谱图或质谱图。控制部60上还连接有输入分析条件等的键盘等的操作部64、和对分析结果的色谱图或质谱图进行显示的液晶显示器等的显示部66。

控制部60的一个示例为以如下方式构成的控制部，即，具有存储有相对于时间而对第一泵4、第二泵10及背压阀24的工作条件进行设定了的分析程序的分析程序存储部68，并一个示例根据该分析程序而执行从超临界流体色谱分析法向液相色谱分析法的切换的方式。

控制部60和数据处理部62为电脑，可为该超临界流体-液相色谱仪的专用电脑，也可为通用的个人电脑。控制部60和数据处理部62可通过共用的电脑来实现，也可通过不同电脑来实现。

将背压阀24的一个示例示于图2(A)至图2(D)。但是，背压阀24并不限定于图2所示的阀门，只要能将分析流道16内保持在固定压力，且能在分析流道16内的加压状态与开放状态之间切换，则也可以为其他结构。

在图2所示的背压阀24中，在压力控制块30的彼此相对的侧面设置有用以连接管线的管线连接部31及32。两管线连接部31和32通过设置于压力控制块30内的一条内部流道40而相互连接。压力控制块30的材质为耐化学品性及耐压力性优异的材料，例如不锈钢(SUS316)。内部流道40的内径为例如0.1～0.3mm左右。

管线连接部31中插入有由公螺母34固定的构成分析流道16的一部分的管线33，管线连接部32中插入有由公螺母38固定的管线36。管线33为通向构成压力控制室的内部流道40的入口流道，管线36为出口流道。流动相从管线33进入至内部流道40，并从管线36向外部排出。

在压力控制块30中，在内部流道40上方的位置设置有沿与内部流道40延伸的方向垂直的方向刨挖而成的刨挖孔46。刨挖孔46的底面到达至内部流道40附近。在刨挖孔46的底面47(凹部形成面)形成有凹部42。凹部42形成为从其开口48向底部收敛的圆锥状。凹部42横穿内部流道40并将内部流道40分割为两条流道，如图2(D)所示，当从开口部48上方观察凹部42内时，可在凹部42的内侧观察到被凹部42侵占的流道40的两个端部40a。再者，凹部42的形状并不限定于圆锥状，只要为朝向底部收敛的形状即可。

在刨挖孔46的底部配置有阀体构件44。阀体构件44具有：密封部44a，其平面形状为与刨挖孔46的平面形状呈大致相同大小的圆形；突起部44b，其呈从该密封部44a的一个平面的中央部突起并与凹部42配合的形状。此处，以阀体构件44的突起部44b侧之面为前表面，以与突起部44b侧相反侧之面为背面。阀体构件44的前表面朝向凹部42侧，突起部44b嵌入至凹部42。密封部44a的突起部44a的周围之面与刨挖孔46的底面47贴紧，从而密封开口部48。

在压力控制块30中，通过螺丝52安装有将阀体构件44挤压到刨挖孔46的底面47上的挤压构件50。挤压构件50具有平面形状大于刨挖孔46的圆形的凸缘部50a、和从凸缘部50a的一个平面的中央部突起并与刨挖孔46配合的圆柱状的顶端部50b。顶端部50b插入至刨挖孔46内，凸缘部50a的周缘部由螺丝52固定于压力控制块30上。顶端部50b的顶端面与阀体构件44的背面接触，根据螺丝52的紧固状态对将阀体构件44朝向刨挖孔46的底面47侧挤压之力进行调节。

在挤压构件50的中央部设置有贯通凸缘部50a及顶端部50b的贯通孔51。圆柱形状的挤压棒54贯通在贯通孔51的内侧，挤压棒54的顶端与阀体构件44的背面中央部接触。挤压棒54由例如压电致动器等致动器56向一个方向(图中为上下方向)驱动。通过利用致动器56驱动挤压棒54，使挤压棒54的顶端面挤压阀体构件44从而使阀体构件44变形，由此使得突起部44b在凹部42内位移。通过突起部44b在凹部42内位移，从而调节凹部42与突起部44b之间的间隙的大小，并由此调节从内部流道40的从一端通往另一端的开口面积的大小。

图2所示的背压阀24在执行超临界流体色谱分析法的分析时，利用致动器56推压挤压棒54而以施加指定压力的方式调节凹部42与突起部44b之间的间隙的大小来将流动相设为超临界流体状态，在从超临界流体色谱分析法切换为液相色谱分析法时，通过解除利用致动器56进行的挤压棒54的挤压而扩大从内部流道40的一端通往另一端的开口面积，从而将背压阀24开放至大气压。

其次，参考图3和图4，对使用该实施例的装置的超临界流体色谱-液相色谱分析法的分析的一实施例进行说明。

(1)从超临界流体色谱分析法开始分析。因此，在使第二溶剂输送部的泵10停止的状态下使第一溶剂输送部的泵4工作，并且仅供给液体二氧化碳作为流动相，并从试样注入部18注入试样。以对背压阀24施加例如15MPa的方式设定好背压阀24。

(2)分析开始之后，就开始第二溶剂输送部的泵10的工作，并供给例如甲醇作为改性剂。关于液体二氧化碳与甲醇的比率，是以如下方式对泵4和10的动作进行控制：一面将液体二氧化碳与甲醇的合计流量保持于指定的固定流量，并如图3所示那样使甲醇的比率逐渐增加。与甲醇的比率是以从分析开始经过设定时间(例如10分钟)后变为例如50％的方式进行控制。此时，由于流动相的黏性随着液体二氧化碳中的甲醇的比率增加而增加，因此分离柱20中的压力开始上升。

(3)经过该设定时间之后，使第一溶剂输送部的泵4停止并利用第二溶剂输送部的泵10将甲醇的流量设为指定的固定流量，并且解除背压阀24的压力设定而开放至大气压。

其后，使以甲醇为流动相的液相色谱分析法的分析持续至指定时间(例如20分钟)为止。

以上动作由控制部60根据存储于控制部60的分析程序存储部68中的分析程序来执行。

虽然在以上的实施例中，实施了在超临界流体色谱分析法中使作为改性剂的甲醇的比率相对于时间而逐渐增加的梯度分析，但也能以改性剂的比率呈阶梯状增加的方式进行设定，或者以始终为固定比率的方式进行设定。

此外，虽然在以上的实施例中，是利用均匀组成的流动相实施液相色谱分析法的分析，但也可以将液相色谱分析法设为梯度分析。将这种示例示于图5。在图5中，(A)表示高压梯度的情形，(B)表示低压梯度的情形。

图5(A)为高压梯度的情形。准备例如甲醇8A和水8B作为构成液相色谱分析的流动相的溶剂。甲醇8A为在超临界流体色谱分析法中作为改性剂而被使用的成分，并由泵10A供给，水8B由泵10B供给，甲醇8A和水8B在混合器14中混合而成为流动相。甲醇8A与水8B的比率通过各自的泵10A与泵10B的流量进行调节。

图5(B)为低压梯度的情形。作为一个示例，在该情形时也准备甲醇8A和水8B作为构成液相色谱分析法的流动相的溶剂。甲醇8A与水8B的比率通过配置于甲醇8A与泵10之间的以及水8B与泵10之间的各自的开闭阀的开闭动作进行调节。

该实施例中的超临界流体色谱-液相色谱分析法的分析的一实施例为如图6所示的示例。超临界流体色谱分析法的分析的动作与图3、图4所示的动作相同。

在继超临界流体色谱分析法的分析之后的液相色谱分析法中，流动相最初为100％的甲醇，而逐渐随着水的比率增加而变为梯度。

在该实施例中，动作也是由控制部60根据存储于控制部60的分析程序存储部68中的分析程序来执行。

实施例中所示的流动相的比率、通过背压阀24所设定的设定压力、从超临界流体色谱分析法切换为液相色谱分析法的时间等仅为一个示例，本发明并不限定于这些示例。

使用液相色谱分析用的流动相的溶剂时最好在由泵抽吸之前经过脱气装置而去除溶剂中的气体。

符号说明

4、10、10A、10B泵

14混合器

16分析流道

18试样注入部

20分离柱

24背压阀

22、26检测器

60控制部

68分析程序存储部。

Claims (6)

1.一种超临界流体-液相色谱仪，具有：

第一溶剂输送部，其利用第一泵输送成为超临界流体的溶剂；

第二溶剂输送部，其利用第二泵输送相对于所述溶剂具有相容性且具有极性的有机溶剂；

分离柱，其配置于所述第一溶剂输送部与所述第二溶剂输送部之间的合流部的下游的分析流道上；

试样注入部，其在所述分析流道中被配置于所述合流部与所述分离柱之间，向所述分析流道中注入试样；

背压阀，其被配置于相对于所述分析流道的流动相的流向而靠所述分离柱的下游，并能够设为保持在将所述分析流道内的流动相维持于超临界流体状态的压力的加压状态；

检测器，其被配置于所述分析流道中的所述分离柱与所述背压阀之间、以及所述背压阀的朝向大气的开放口的外侧这两个位置中的至少一个位置，并对从所述分离柱洗提出来的试样成分进行检测；以及，

控制部，其对所述第一泵、所述第二泵及所述背压阀的动作进行控制；且

所述背压阀是以在所述加压状态与朝向大气开放的开放状态之间切换的方式构成，

所述控制部所是以从超临界流体色谱分析法向液相色谱分析法进行切换的方式构成，所述超临界流体色谱分析法将所述第一泵及所述第二泵设为工作状态并将所述背压阀维持在了所述加压状态，所述液相色谱分析法使所述第一泵停止而使所述第二泵继续工作并将所述背压阀设为开放状态。

2.根据权利要求1所述的超临界流体-液相色谱仪，其中，

所述控制部具有分析程序存储部，所述分析程序存储部存储有相对于时间而设定了所述第一泵、所述第二泵及所述背压阀的工作条件的分析程序，且所述控制部根据所述分析程序执行从所述超临界流体色谱分析法向液相色谱分析法的切换。

3.根据权利要求1或2所述的超临界流体-液相色谱仪，其将利用第三泵来对能够与所述有机溶剂一起构成液相色谱分析法的流动相的第三溶剂进行供给的第3溶剂输送部连接至所述合流部，且

所述分析程序存储部还存储有用于所述液相色谱分析法中的梯度分析的分析程序，

所述控制部是以在所述液相色谱分析法中控制所述第二泵和第三泵并实施高压梯度分析的方式构成。

4.根据权利要求1或2所述的超临界流体-液相色谱仪，其中，

所述第二溶剂输送部是以如下方式构成：能够利用所述第二泵除了供给所述有机溶剂以外，还供给能够与所述有机溶剂一起构成液相色谱分析法的流动相的第三溶剂；且

所述分析程序存储部还存储有用于所述液相色谱分析法中的梯度分析的分析程序，

所述控制部是以如下方式构成：在所述超临界流体色谱分析法中以从所述第二溶剂输送部仅供给所述有机溶剂的方式控制所述第二溶剂输送部的动作，而在所述液相色谱分析法中从所述第二溶剂输送部供给所述有机溶剂和所述第三溶剂从而实施低压梯度分析。

5.一种分析方法，其使用了具有如下构件的分析装置：分析流道，其具有分离柱；流动相输送部，其向所述分析流道中供给流动相；试样注入部，其在所述分析流道中向所述分离柱与所述流动相输送部之间注入试样；背压阀，其被配置于相对于所述分析流道的流动相的流向而靠所述分离柱的下游，并能够设为保持在将所述分析流道内的流动相维持于超临界流体状态的压力的加压状态；以及，检测器，其被配置于所述分析流道中的所述分离柱与所述背压阀之间、以及所述背压阀的朝大气的开放口的外侧这两个位置中的至少一个位置，并对从所述分离柱洗提出来的试样成分进行检测；且所述分析方法包括以下步骤(A)至步骤(C)：

步骤(A)从所述流动相输送部供给能够成为超临界状态的流动相作为流动相，一面利用所述背压阀将所述分析流道内的流动相维持在超临界流体状态，一面从所述试样注入部注入试样，并开始超临界流体色谱分析法的分析；

步骤(B)在所述流动相成为超临界流体的溶剂与相对于该溶剂具有相容性且具有极性的有机溶剂所形成的混合溶液的超临界流体色谱分析法的分析之后，将从所述流动相输送部供给的流动相仅切换为所述有机溶剂，并将所述背压阀朝向大气压开放，由此从超临界流体色谱分析法的状态切换至液相色谱分析法的状态；以及

步骤(C)其后，实施利用包含所述有机溶剂的流动相而进行的液相色谱分析法的分析。

6.根据权利要求5所述的分析方法，其中，所述步骤(C)为在所述有机溶剂中混合其他溶剂作为流动相的梯度分析。