CN105771890A - 一种石墨烯基复合材料的制备及其在化学发光检测dna含量中的应用 - Google Patents

一种石墨烯基复合材料的制备及其在化学发光检测dna含量中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种石墨烯基复合材料的制备及其在化学发光检测DNA含量中的应用。主要技术特征是：该方法在氧化石墨烯表面修饰上磁性，合成物对单链DNA分子有共轭吸附能力的磁性石墨烯基复合材料，制备过程简单，条件易于控制，生产成本低；本发明提供了一种检测DNA的新方法，合成的Fe3O4@SiO2/GO复合材料可实现对单链DNA进行快速吸附，吸附能力强、效率高，单链DNA吸附达到平衡时间仅为10~15 min，最大吸附容量为饱和吸附量达数量级10‑7~10‑6mol/g，该检测DNA的方法检测线低，可达到10‑9 mol/L，具有灵敏度高、选择性高、重现性好、对环境无污染等优点。

Description

一种石墨烯基复合材料的制备及其在化学发光检测DNA含量中的应用
技术领域
本发明涉及的是一种石墨烯基复合材料的制备及其在化学发光检测DNA含量中的应用技术，属于光化学传感器技术领域，具体涉及一种磁性氧化石墨烯复合吸附材料的制备及在化学发光体系中进行DNA含量检测的技术。
背景技术
石墨烯是一种具有二维晶体结构的纳米材料，其独特的结构、突出的导电导热性能及力学性能，在分析化学中应用广泛，但石墨烯片层间存在强烈的π-π作用，使其在溶液中的分散性受到严重的影响，容易发生聚沉，故需要对石墨烯进行改性和修饰；氧化石墨烯(GO)就是对石墨烯进行改性得到的，GO具有两亲性，具有聚合物、胶体、薄膜和两性分子的特性；GO是一种性能优异、新型的碳材料，有一定的吸附能力且表面含有大量的环氧基，容易和其他物质复合得到GO复合材料；GO复合材料中的聚合物类复合材料、无机物类复合材料都有广泛的应用领域，因此GO的表面改性成为另一个研究重点；磁性氧化石墨烯（MGO）因具有氧化石墨烯的高吸附特性，同时具有磁性材料的易分离特性，成为了研究的一个热点。
生物遗传因子-脱氧核糖核苷酸（DNA）自提出，其分子的识别和检测一直为人们所关注，携带有遗传信息的DNA或RNA序列（即基因是具有遗传效应的DNA或RNA片段），称为遗传因子，是控制性状的基本遗传单位；遗传因子通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现；“人类基因组计划”的制定，在国际上掀起了DNA检测技术的研究热潮，DNA作为遗传信息的承担者，在诊断和识别各种疾病、研究转基因食品的基因方面广泛应用。
随着生物、化学、物理、电子、计算机等不同学科的发展和交叉渗透，建立了多种DNA的检测方法，有传统的PCR聚合酶链式反应，它的定位、选择性、多重检测性较差；比色法，靠终点颜色来判断DNA的含量，存在较大的误差；质谱分析法，因寡核苷酸的电离效率低且容易破碎；荧光检测法，淬灭效率较低，灵敏度不高；电化学法，耗时较多且重现性较差：建立简单有效、快速方便、灵敏度高、选择性好的分析方法显得尤为重要；光化学方法由于其非破坏性和高灵敏度而成为具有较大发展空间的DNA检测技术。
光化学方法中的流动注射化学发光法具有操作方便、灵敏度高、仪器简单、分析速度快、无污染等优点，在分析领域应用广泛，但化学发光体系对大部分的物质都有发光效应，使其测定的选择性较差。本专利中，首先对磁性四氧化三铁粒子进行了硅烷化的修饰，得到二氧化硅包覆下的四氧化三铁复合粒子；接着利用氧化石墨烯的优异性能，对其进行健合，磁性修饰得到最终的易于分离、吸附性能好的磁性氧化石墨烯复合材料；利用复合材料对单链DNA的共轭吸附性能及互补DNA链之间的氢键作用力，将该复合材料应用到流动注射化学发光传感器中，有效提高了DNA测定的选择性，发明了一种简单、灵敏度高、选择性高和重现性好的检测DNA的新方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种磁性氧化石墨烯(Fe3O4SiO2/GO)复合吸附材料的制备方法，主要是在氧化石墨烯表面修饰上四氧化三铁，合成对单链DNA(ssDNA)有共轭吸附能力的材料；
本发明的目的通过以下技术方案实现：
（1）Fe3O4SiO2的制备：向150mL圆底烧瓶中，加入乙醇36mL，超纯水4mL，纯化后的Fe3O4纳米颗粒0.3000g；超声振荡15~20min，机械搅拌下，加入氨水5mL和正硅酸乙酯2mL；在10?C恒温条件下机械搅拌反应12h；产物用外磁场收集；放入50?C真空干燥箱进行干燥；干燥后，研磨；
（2）Fe3O4SiO2/GO复合材料的合成：取0.2g氧化石墨烯，溶于100mL超纯水中，加入3mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和28mg羟基琥珀酰亚胺；磁力搅拌30min，超声30min，成均匀分散液；加入200mg硅烷化修饰的产物Fe3O4SiO2-NH2，超声30min，80?C下搅拌2h，进行磁性分离（分别用超纯水、乙醇洗涤）；放入50?C真空干燥箱进行干燥；干燥后，研磨。
本发明的另一个目的是将Fe3O4SiO2/GO复合材料应用在流动注射化学发光法检测DNA技术中，将制备好的Fe3O4SiO2/GO复合材料用于吸附ssDNA-A链，由于ssDNA-A被此复合材料吸附，未显现出ssDNA化学发光信号，接着加入与ssDNA-A互补配对的ssDNA-B链，使ssDNA-A链得以从复合材料上得到脱附，显现出DNA的化学发光信号，制备的该光化学传感器特征为：灵敏度高、选择性高、操作方便、仪器简单、分析速度快、无污染；在鲁米诺-过氧化氢-氢氧化钠化学发光体系中，确定最优化学发光条件，进行吸附性能检测，绘制工作曲线，用于实际样品DNA的检测：
本发明的优点及效果是：
（1）本发明获得对DNA有较高吸附能力的Fe3O4SiO2/GO吸附复合材料，以修正的Hummers法合成氧化石墨烯为母体，在其上面修饰上硅烷化的磁性纳米粒子，制备Fe3O4SiO2/GO吸附复合材料，其吸附位点在吸附剂的表面，有利于对ssDNA进行快速吸附，吸附能力强、效率高，其对实验中用的ssDNA吸附达到平衡时间仅为10~15min，最大吸附容量为饱和吸附量达数量级10-7~10-6mol/g；
（2）本发明Fe3O4SiO2/GO吸附复合材料应用于化学发光检测ssDNA中，材料制备过程简单，条件易于控制；检测ssDNA的方法灵敏度高，选择性好，简单方便，易于操作；
（3）本发明制备Fe3O4SiO2/GO氧化石墨烯吸附复合材料应用于化学发光检测ssDNA中，可以对不同的ssDNA序列绘制工作曲线，进行ssDNA含量的检测，进而对控制遗传疾病的DNA进行检测，检测其是否符合指标，在疾病检测和人类健康方面具有重要的生物学意义。
具体实施方式
实施例1
（1）Fe3O4SiO2的制备：向150mL圆底烧瓶中，加入乙醇36mL，超纯水4mL，纯化后的Fe3O4纳米颗粒0.3000g；超声振荡15~20min，机械搅拌下，加入氨水5mL和正硅酸乙酯2mL；在10?C恒温条件下机械搅拌反应12h；产物用外磁场收集；放入50?C真空干燥箱进行干燥；干燥后，研磨；
（2）Fe3O4SiO2/GO复合材料的合成：取0.2g氧化石墨烯，溶于100mL超纯水中，加入3mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和28mg羟基琥珀酰亚胺；磁力搅拌30min，超声30min，成均匀分散液；加入200mg硅烷化修饰的产物Fe3O4SiO2-NH2，超声30min，80?C下搅拌2h，进行磁性分离（分别用超纯水、乙醇洗涤）；放入50?C真空干燥箱进行干燥；干燥后，研磨；
（3）DNA预处理：包含15个碱基对的短链DNA序列，A链：5'-CTAAGGACCAAGCTG-3'，B链：5'-GATTCCTGGTTCGAC-3'，两条链互补配对，由于单链DNA呈很轻的干膜状附着在管壁上，直接打开容易散失，所以打开盖子前要进行高速离心处理；
（4）Fe3O4SiO2/GO复合材料吸附性能的测定：准确移取等量的Fe3O4SiO2/GO复合材料，放入50mL比色管中，加入适量已知浓度的ssDNA-A溶液，用流动注射化学发光法测定发光强度，根据发光强度突增时转折点的ssDNA-A溶液的浓度，可计算出Fe3O4SiO2/GO复合材料对ssDNA-A的饱和吸附量Q，测得饱和吸附量Q为2.4×10-7mol/g；
（5）ssDNA工作曲线的绘制：配制一系列标准浓度的ssDNA-A溶液，均加入相同量的ssDNA-B溶液，在实验得出的最佳实验条件下（最优的主/副泵泵速，NaOH/鲁米诺/过氧化氢），测定体系的化学发光强度，绘制工作曲线，得到工作曲线ΔI=1.02×102+9.13×109 c(mol/L)，R 2=0.9998，线性范围8.0×10-9-5.0×10-8mol/L，检出限为2.7×10-9mol/L；
（6）实际样品的检测：实验需要4只100mL的比色管，加标之前未知ssDNA-A浓度的1、2号，加标后的3、4号，用流动式化学发光仪分别测定4只比色管的化学发光强度ΔI，通过绘制好的工作曲线，分别得到ssDNA-A的浓度，继而得到加标回收率，为101%~104%。
实施例2
（1）Fe3O4SiO2的制备：向150mL圆底烧瓶中，加入乙醇36mL，超纯水4mL，纯化后的Fe3O4纳米颗粒0.3000g；超声振荡15~20min，机械搅拌下，加入氨水5mL和正硅酸乙酯2mL；在10?C恒温条件下机械搅拌反应12h；产物用外磁场收集；放入50?C真空干燥箱进行干燥；干燥后，研磨；
（2）Fe3O4SiO2/GO复合材料的合成：取0.2g氧化石墨烯，溶于100mL超纯水中，加入3mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和28mg羟基琥珀酰亚胺；磁力搅拌30min，超声30min，成均匀分散液；加入200mg硅烷化修饰的产物Fe3O4SiO2-NH2，超声30min，80?C下搅拌2h，进行磁性分离（分别用超纯水、乙醇洗涤）；放入50?C真空干燥箱进行干燥；干燥后，研磨；
（3）DNA预处理：包含17个碱基对的短链DNA序列，A链：5'-GGGTAGGGCGGGTTGGG-3'，B链：5'-CCCATCCCGCCCAACCC-3'，两条链互补配对，由于单链DNA呈很轻的干膜状附着在管壁上，直接打开容易散失，所以打开盖子前要进行高速离心处理；
（4）Fe3O4SiO2/GO复合材料吸附性能的测定：准确移取等量的Fe3O4SiO2/GO复合材料，放入50mL比色管中，加入适量已知浓度的ssDNA-A溶液，用流动注射化学发光法测定发光强度，根据发光强度突增时转折点的ssDNA-A溶液的浓度，可计算出Fe3O4SiO2/GO复合材料对ssDNA-A的饱和吸附量Q，测得饱和吸附量Q为3.2×10-6mol/g；
（5）ssDNA工作曲线的绘制：配制一系列标准浓度的DNA-A溶液，均加入相同量的DNA-B溶液，在实验得出的最佳实验条件下（最优的主/副泵泵速，NaOH/鲁米诺/过氧化氢溶液浓度），测定体系的化学发光强度，绘制工作曲线，得到工作曲线ΔI=-5.12+2.54×1010 c(mol/L)，R 2=0.9970，线性范围5.0×10-9-2.5×10-8mol/L，检出限为1.7×10-9mol/L；
（6）实际样品的检测：实验需要4只100mL的比色管，加标之前未知ssDNA-A浓度的1、2号，加标后的3、4号，用流动式化学发光仪分别测定4只比色管的化学发光强度ΔI，通过绘制好的工作曲线，分别得到ssDNA-A的浓度，继而得到加标回收率，为99%~103%。
实施例3
（1）Fe3O4SiO2的制备：向150mL圆底烧瓶中，加入乙醇36mL，超纯水4mL，纯化后的Fe3O4纳米颗粒0.3000g；超声振荡15~20min，机械搅拌下，加入氨水5mL和正硅酸乙酯2mL；在10?C恒温条件下机械搅拌反应12h；产物用外磁场收集；放入50?C真空干燥箱进行干燥；干燥后，研磨；
（2）Fe3O4SiO2/GO复合材料的合成：取0.2g氧化石墨烯，溶于100mL超纯水中，加入3mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和28mg羟基琥珀酰亚胺；磁力搅拌30min，超声30min，成均匀分散液；加入200mg硅烷化修饰的产物Fe3O4SiO2-NH2，超声30min，80?C下搅拌2h，进行磁性分离（分别用超纯水、乙醇洗涤）；放入50?C真空干燥箱进行干燥；干燥后，研磨；
（3）DNA预处理：包含33个碱基对的DNA序列，A链：5'-GAGGTCATGGTGGCGGCAGCGCCTCACAACCTC-3'，B链：5'-CTCCAGTACCACCGC
CGTCGCGGAGTGTTGGAG-3'，两条链互补配对，由于单链DNA呈很轻的干膜状附着在管壁上，直接打开容易散失，所以打开盖子前要进行高速离心处理；
（4）Fe3O4SiO2/GO复合材料吸附性能的测定：准确移取等量的Fe3O4SiO2/GO复合材料，放入50mL比色管中，加入适量已知浓度的ssDNA-A溶液，用流动注射化学发光法测定发光强度，根据发光强度突增时转折点的ssDNA-A溶液的浓度，可计算出Fe3O4SiO2/GO复合材料对ssDNA-A的饱和吸附量Q，测得饱和吸附量Q为7.8×10-6mol/g；
（5）ssDNA工作曲线的绘制：配制一系列标准浓度的ssDNA-A溶液，均加入相同量的ssDNA-B溶液，在实验得出的最佳实验条件下（最优的主/副泵泵速，NaOH/鲁米诺/过氧化氢溶液浓度），测定体系的化学发光强度，绘制工作曲线，得到工作曲线ΔI=9.72+9.68×109 c(mol/L)，R 2=0.9876，线性范围1.1×10-8-9.6×10-8mol/L，检出限为3.7×10-9mol/L；
（6）实际样品的检测：实验需要4只100mL的比色管，加标之前未知ssDNA-A浓度的1、2号，加标后的3、4号，用流动式化学发光仪分别测定4只比色管的化学发光强度ΔI，通过绘制好的工作曲线，分别得到ssDNA-A的浓度，继而得到加标回收率，为94%~103%。

Claims (3)

1.一种石墨烯基复合材料的制备及其在化学发光检测DNA含量中的应用，其特征是，在于该方法具有一下工艺步骤：
（1）Fe3O4SiO2的制备：向150mL圆底烧瓶中，加入乙醇36mL，超纯水4mL，纯化后的Fe3O4纳米颗粒0.3000g；超声振荡15~20min，机械搅拌下，加入氨水5mL和正硅酸乙酯2mL；在10?C恒温条件下机械搅拌反应12h；产物用外磁场收集；放入50?C真空干燥箱进行干燥；干燥后，研磨；
（2）Fe3O4SiO2/GO复合材料的合成：取0.2g氧化石墨烯，溶于100mL超纯水中，加入3mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和28mg羟基琥珀酰亚胺；磁力搅拌30min，超声30min，成均匀分散液；加入200mg硅烷化修饰的产物Fe3O4SiO2-NH2，超声30min，80?C下搅拌2h，进行磁性分离（分别用超纯水、乙醇洗涤）；放入50?C真空干燥箱进行干燥；干燥后，研磨；
（3）DNA预处理：DNA序列的A链和B链，两条链互补配对，由于单链DNA(ssDNA)呈很轻的干膜状附着在管壁上，直接打开容易散失，所以打开盖子前要进行高速离心处理；
（4）Fe3O4SiO2/GO复合材料吸附性能的测定：准确移取等量的Fe3O4SiO2/GO复合材料，放入50mL比色管中，加入适量已知浓度的ssDNA溶液，用流动注射化学发光法测定发光强度，根据发光强度突增时转折点的ssDNA溶液的浓度，可计算出Fe3O4SiO2/GO复合材料对ssDNA的饱和吸附量Q；
（5）ssDNA工作曲线的绘制：配制一系列标准浓度的ssDNA-A溶液，均加入相同量的ssDNA-B溶液，在实验得出的最佳实验条件下（最优的主/副泵泵速，NaOH/鲁米诺/过氧化氢溶液浓度），测定体系的化学发光强度，绘制工作曲线；
（6）实际样品的检测：实验需要4只100mL的比色管，加标之前未知ssDNA-A浓度的1、2号，加标后的3、4号，用流动式化学发光仪分别测定4只比色管的化学发光强度，测得其加标回收率ΔI，通过绘制好的工作曲线，分别得到ssDNA-A的浓度，继而得到加标回收率。
2.根据权利要求1所述的Fe3O4SiO2/GO复合材料的制备方法，其特征是：氮气保护、磁性分离、简单高效。
3.根据权利要求1所述的Fe3O4SiO2/GO复合材料应用于化学发光检测DNA方法，其特征是采用流动注射化学发光法，提供了一种更优的高灵敏度、高选择性、高重现性的检测DNA的新方法，其具体方法的步骤如下：
（1）空白检测：启动主泵和副泵，进样阀处于进样位置，过氧化氢、氢氧化钠以及PBS参比溶液与鲁米诺溶液合并流动50s，产生化学发光强度I 0；
（2）分离富集ssDNA-A：用适量Fe3O4SiO2/GO复合材料充分吸附ssDNA-A，并用磁铁将其吸附在烧杯底部；
（3）ssDNA-A检测：启动主泵和副泵，进样阀处于进样位置，过氧化氢、氢氧化钠以及被Fe3O4SiO2/GO复合材料吸附完全的ssDNA-A试样与鲁米诺溶液合并流动50s，发生反应，产生化学发光强度I 1，实际发光强度为ΔI 1=I 1-I 0；相同条件下，加入一定量的与ssDNA-A互不配对的ssDNA-B，使得ssDNA-A从Fe3O4SiO2/GO复合材料上脱落到溶液中，此时产生化学发光强度I 2，实际发光强度为ΔI 2=I 2-I 0；由此可得实际ssDNA-A产生的化学发光强度ΔI=ΔI 1-ΔI 2；
（4）Fe3O4SiO2/GO复合材料清洗：加入ssDNA-B与复合材料上残余的ssDNA-A反应，使其脱附，重复使用Fe3O4SiO2/GO复合材料。
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