CN105766381A - 一种月夜菌的人工培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种月夜菌的人工培育方法，属于真菌人工培育技术领域，包括斜面培养、液体深层发酵种子培养、菌丝体培养和子实体培养四大步骤。本发明公开的人工培育方法，设计的工艺路线合理，长出的子实体的时间比按常规的人工培养方法缩短1个月以上。

Description

一种月夜菌的人工培育方法

技术领域

本发明属于真菌人工培育领域技术领域，特别是涉及到一种月夜菌的人工培育方法。

背景技术

月夜菌Lampteresjaponicus(kawaw)sing,是吉林省长白山区的一种剧毒的大型真菌，秋季散生或叠生于槭属(Acer)、栎等树种的倒木上。其有毒成分为月夜菌醇(Lampterol),中毒类型为胃肠毒型、溶血型。月夜菌菌种属于担子菌纲、伞菌目、侧耳属、毒侧耳种，是由野生月夜菌子实体分离得到的一种新菌株，应用本菌株经过栽培实验长出月夜菌子实体，经过鉴定验证，确认分离得到的该菌株确实属于侧耳属，月夜菌种。

目前，月夜菌均为野生繁殖，数量少，分布不均，不利于大量采集。

因此现有技术当中亟需要一种新型的技术方案来解决这一问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种月夜菌的人工培育方法，用来解决目前月夜菌均为野生繁殖，数量少，分布不均，不利于大量采集的技术问题。

一种月夜菌的人工培育方法，其特征是：包括以下步骤

步骤一、斜面培养

将从野生月夜菌中分离出的月夜菌菌株，以10％的接种量接种入PH值为6～6.5的马铃薯葡萄糖琼脂培养基中进行斜面培养，培养温度为20℃～24℃，培养时间为10天～12天；

步骤二、液体深层发酵种子培养

将所述步骤一中培养后的月夜菌菌株，按照斜面与摇瓶之比为1：6的接种量，接种至摇瓶，摇瓶内置液体培养基，进行液体深层发酵种子培养，培养温度为20℃～24℃，培养时间30天～45天；

步骤三、菌丝体培养

取发酵袋备用，向发酵袋内装入16㎝～17㎝高的培养基，培养基含水量为60％，按照1kg/㎝²～1.5kg/㎝²的高压灭菌0.5小时～2小时或按照常压100℃灭菌10小时～12小时，冷却至室温后，无菌操作接入所述步骤二中培养后的菌种，完全避光，在温度20℃～24℃、空气相对湿度50％～60％的条件下培养30天～45天，菌丝长满全袋；

步骤四、子实体培养

将步骤三中培养的菌丝体继续培养7天～10天，打开袋口出菇或将发酵袋划口出菇，保持温度在13℃～27℃，增加空气相对湿度至85％～90％，每天通风3小时～4小时，每天散射光照射5小时～6小时，5天～7天形成子实体。

所述步骤二中摇瓶内所用的液体培养基PH值为6～6.5，液体培养基成分为1000份的水、15份的蛋白胨、1份的酵母膏、10份的麦芽糖、10份的葡萄糖、50份的麦麸、1.5份的Kh₂PO₄、0.7份的MgSO₄·7H₂O、0.01份的维生素B₁。

所述步骤二液体深层发酵种子培养之后直接进行步骤三菌丝体培养，或者进行种子罐培养之后再进行步骤三菌丝体培养，其中种子罐培养所用的培养基与步骤二中所用的培养基相同，接种量为种子罐装量的10％～15％，培养温度为24℃～26℃，培养时间为7天～10天。

所述步骤三中发酵袋内装入的培养基PH值为6～6.5，培养基成分的重量百分比为硬杂木屑50％、农作物秸秆粉20％、玉米面20％、麦麸7％、白糖1％、石膏1％、白灰1％。

所述步骤三中的发酵袋为17㎝×33㎝的聚丙烯或低压聚乙烯袋。

通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：本发明公开的人工培育方法，设计的工艺路线合理，长出的子实体的时间比按常规的人工培养方法缩短1个月以上，具有生长快，产量高，代谢产物稳定的特点。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明：

图1为本发明一种月夜菌的人工培育方法的流程示意图。

具体实施方式

如图所示，一种月夜菌的人工培育方法，其特征是：包括以下步骤

步骤一、斜面培养

将从野生月夜菌中分离出的月夜菌菌株，以10％的接种量接种入PH值为6～6.5的马铃薯葡萄糖琼脂培养基中进行斜面培养，培养温度为20℃～24℃，培养时间为10天～12天；

步骤二、液体深层发酵种子培养

将所述步骤一中培养后的月夜菌菌株，按照斜面与摇瓶之比为1：6的接种量，接种至摇瓶，摇瓶内置液体培养基，进行液体深层发酵种子培养，培养温度为20℃～24℃，培养时间30天～45天；

步骤三、菌丝体培养

取发酵袋备用，向发酵袋内装入16㎝～17㎝高的培养基，培养基含水量为60％，按照1kg/㎝²～1.5kg/㎝²的高压灭菌0.5小时～2小时或按照常压100℃灭菌10小时～12小时，冷却至室温后，无菌操作接入所述步骤二中培养后的菌种，完全避光，在温度20℃～24℃、空气相对湿度50％～60％的条件下培养30天～45天，菌丝长满全袋；

步骤四、子实体培养

将步骤三中培养的菌丝体继续培养7天～10天，打开袋口出菇或将发酵袋划口出菇，保持温度在13℃～27℃，增加空气相对湿度至85％～90％，每天通风3小时～4小时，每天散射光照射5小时～6小时，5天～7天形成子实体。

所述步骤二中摇瓶内所用的液体培养基PH值为6～6.5，液体培养基成分为1000份的水、15份的蛋白胨、1份的酵母膏、10份的麦芽糖、10份的葡萄糖、50份的麦麸、1.5份的Kh₂PO₄、0.7份的MgSO₄·7H₂O、0.01份的维生素B₁。

所述步骤二液体深层发酵种子培养之后直接进行步骤三菌丝体培养，或者进行种子罐培养之后再进行步骤三菌丝体培养，从而扩大产量，增加菌种数量，其中种子罐培养所用的培养基与步骤二中所用的培养基相同，接种量为种子罐装量的10％～15％，培养温度为24℃～26℃，培养时间为7天～10天。

所述步骤三中发酵袋内装入的培养基PH值为6～6.5，培养基成分的重量百分比为硬杂木屑50％、农作物秸秆粉20％、玉米面20％、麦麸7％、白糖1％、石膏1％、白灰1％。

所述步骤三中的发酵袋为17㎝×33㎝的聚丙烯或低压聚乙烯袋。

一种月夜菌的应用，其特征是：应用于灭鼠剂的制备。

月夜菌菌株具有以下性质：

1、菌落外观：菌丝棉绒状、较短、气生菌丝不发达、白色。

2、镜检：(1)菌丝粗壮，分枝多。

(2)美蓝单染色着色深，均匀。

(3)可见大量生长点，无空泡。

(4)有锁状联合，且较发达。

(5)无杂菌污染。

3、生理生化特征：

(1)菌丝生长最佳温度20℃～24℃。

(2)生长最佳PH值6～6.5。

(3)对氧的需求：属好气性真菌。

(4)培养基生长最佳水分60％。

(5)生长最佳湿度80％～90％。

4、培养基成分：PDA综合培养基。

根据实验结果表明，该月夜菌属于侧耳属、毒侧耳种。本发明的月夜菌菌种传代18次以上不退化，属于抗老化能力、稳定性及代谢能力都很强的菌株。

利用分离后的月夜菌菌株进行人工栽培月夜菌子实体采用固态-液态-固态的工艺路线，包括如下步骤：斜面培养、液体深层发酵种子培养、菌丝体培养和子实体培养。

所述的斜面培养，所选用的培养基为PDA综合培养基即马铃薯葡萄糖琼脂培养基，PH值6～6.5，培养温度20℃～24℃，培养时间10天～12天。

所述的液体深层发酵种子培养，摇瓶内所用的液体培养基成分重量百分比为1000g水内包括蛋白胨1.5％、酵母膏0.1％、麦芽糖1％、葡萄糖1％、麦麸5％、Kh₂PO₄0.15％、MgSO₄·7H₂O0.07％、维生素B₁0.001％，液体培养基PH值6～6.5，接种量为斜面与摇瓶之比为1：6，培养温度20℃～24℃，培养时间30天～45天。

所述的子实体培养即出菇管理：包括适时脱袋处理，温度13℃～27℃，湿度85％～90％，温差刺激，加大通风，给予光照，直至长出月夜菌子实体。

在人工培养过程中为扩大产量，增加菌种数量，还可以在摇瓶种子培养即液体深层发酵种子培养之后，增加种子罐培养，种子罐培养所用的培养基与摇瓶种子培养所用的培养基相同，PH值6～6.5，接种量为种子罐的10％，温度20℃～24℃，空气流量0.5V/V，罐压0.5㎏/㎝²，培养时间为3天～4天。

实施例1

斜面菌种培养：采用PDA综合培养基，PH6.3，培养温度20℃～24℃。该菌萌发快，菌种接后2.5天内形成以基点的明显菌落，11天菌落长满管。菌丝初期白色，棉绒状，分枝多。通过镜检明显观察到菌丝粗壮，分枝多，锁状联合发达，美蓝单染色着色深，可见大量生长点，无空泡，无杂菌污染。

液体深层发酵种子培养：所用的培养基成分重量百分比为1000g水内包括蛋白胨1.5％、酵母膏0.1％、麦芽糖1％、葡萄糖1％、麦麸5％、Kh₂PO₄0.15％、MgSO₄·7H₂O0.07％、维生素B₁0.001％，PH值6.3，高压压力1kg/㎝²灭菌30min，冷却后接种，接种量为斜面与摇瓶之比1：6，即一个斜面接6个250ml的摇瓶(装量100ml)，培养温度20℃～24℃，旋转式摇床200转/分钟，培养8天，菌球湿重达20％以上，(湿重测定方法：取100ml培养液置于量筒中，静置15min，观察菌球沉降的刻度的百分数)味为水果香味，稍酸，镜检观察到菌丝着色深，粗壮，分枝多，生长点明显可见，有锁壮联合，未见杂菌污染，即可作为摇瓶种子备用。

种子罐培养：培养基与摇瓶种子培养基相同，PH值6.3，温度20℃～24℃，空气流量0.5V/V，罐压0.5kg/㎝²，接种量为种子罐的13％，培养3.5天，当外观形态检查到菌球湿重达30％以上，味感呈水果味，镜检检查到菌球湿重达30％以上，味感呈水果味，镜检观察到菌丝着色深，粗壮，分枝多，生长点明显可见有锁状联合，未见杂菌污染即可进行菌丝体培养。

菌丝体培养所用培养基配方为：硬杂木屑50％，农作物秸秆粉20％，玉米面20％，麦麸7％，白糖1％，石膏1％，白灰1％，含水量60％，选用17×33㎝聚丙烯或低压聚乙烯袋，装料高16㎝～17㎝，套颈圈，塞棉花，上包牛皮纸，高压灭菌1.5kg/㎝²2小时，冷却后无菌操作接入菌种，温度20℃～24℃，保持黑环境，空气相对湿度50％～60％，培养40天。

外观检查，菌丝浓白，呈绒毛状，粗短，密齐，发酵袋内无黄色积水，没有干涸收缩现象，无杂菌污染，生长后期有部分菇蕾出现，镜检菌丝着色深，粗壮，分枝多，有锁状联合，生长点明显可见。

出菇管理：菌袋培养40天，菌丝长满全袋，继续培养8天，打开袋口或袋划口出菇，拉大温差刺激，温度保持在13℃～27℃，同时增加空气相对湿度至85％～90％，加强通风，增加散射光，6天形成子实体。子实体一般群生至叠生，菌盖半圆形至肾形，扩展为扁平扇形，长成后边缘内卷或稍上反卷，菌盖颜色多变化，幼时橙黄色至肉桂色，基部有舌状细鳞片，四周有纤维状鳞片，长成时盖面呈暗紫色至紫褐色，有油紫状光泽，基部有明显紫色棉絮状鳞片，潮湿时有粘性。菌肉近白色，带黄色，有臭气，基部厚，边缘薄，近柄处更厚(厚1.3㎝～2㎝)，稍脆，易随菌褶裂开，柄肉暗紫色，菌柄侧生，近黄色，粗而短，圆柱形，长0.5㎝～2㎝，粗1㎝～2㎝，幼时菌柄上部有狭而厚的膜状菌环，以后消失，菌柄残迹形成轮状突棱，特别是复面明显。菌褶延生，终于轮状突棱。初期白色，后变淡黄色，疏而宽，宽1㎝～2㎝，老时菌褶常断裂，夜间或在暗处发磷光。上述形态与野生月夜菌完全相同。

本发明培育的月夜菌菌种，安全性高，在规范实施过程中，不危及人类健康、不携带动植物病原、不污染环境。经考核本发明培育的月夜菌菌种传代18代以上不退化，属于抗老化能力、稳定性和代谢能力均较强，产量和得率较高的菌株。

Claims (5)

1.一种月夜菌的人工培育方法，其特征是：包括以下步骤

步骤一、斜面培养

将从野生月夜菌中分离出的月夜菌菌株，以10％的接种量接种入PH值为6～6.5的马铃薯葡萄糖琼脂培养基中进行斜面培养，培养温度为20℃～24℃，培养时间为10天～12天；

步骤二、液体深层发酵种子培养

将所述步骤一中培养后的月夜菌菌株，按照斜面与摇瓶之比为1：6的接种量，接种至摇瓶，摇瓶内置液体培养基，进行液体深层发酵种子培养，培养温度为20℃～24℃，培养时间30天～45天；

步骤三、菌丝体培养

取发酵袋备用，向发酵袋内装入16㎝～17㎝高的培养基，培养基含水量为60％，按照1kg/㎝²～1.5kg/㎝²的高压灭菌0.5小时～2小时或按照常压100℃灭菌10小时～12小时，冷却至室温后，无菌操作接入所述步骤二中培养后的菌种，完全避光，在温度20℃～24℃、空气相对湿度50％～60％的条件下培养30天～45天，菌丝长满全袋；

步骤四、子实体培养

将步骤三中培养的菌丝体继续培养7天～10天，打开袋口出菇或将发酵袋划口出菇，保持温度在13℃～27℃，增加空气相对湿度至85％～90％，每天通风3小时～4小时，每天散射光照射5小时～6小时，5天～7天形成子实体。

2.根据权利要求1所述的一种月夜菌的人工培育方法，其特征是：所述步骤二中摇瓶内所用的液体培养基PH值为6～6.5，液体培养基成分为1000份的水、15份的蛋白胨、1份的酵母膏、10份的麦芽糖、10份的葡萄糖、50份的麦麸、1.5份的Kh₂PO₄、0.7份的MgSO₄·7H₂O、0.01份的维生素B₁。

3.根据权利要求1所述的一种月夜菌的人工培育方法，其特征是：所述步骤二液体深层发酵种子培养之后直接进行步骤三菌丝体培养，或者进行种子罐培养之后再进行步骤三菌丝体培养，其中种子罐培养所用的培养基与步骤二中所用的培养基相同，接种量为种子罐装量的10％～15％，培养温度为24℃～26℃，培养时间为7天～10天。

4.根据权利要求1所述的一种月夜菌的人工培育方法，其特征是：所述步骤三中发酵袋内装入的培养基PH值为6～6.5，培养基成分的重量百分比为硬杂木屑50％、农作物秸秆粉20％、玉米面20％、麦麸7％、白糖1％、石膏1％、白灰1％。

5.根据权利要求1所述的一种月夜菌的人工培育方法，其特征是：所述步骤三中的发酵袋为17㎝×33㎝的聚丙烯或低压聚乙烯袋。