CN105754979A - 一种mbp融合肝素酶ⅱ及其编码基因与制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种MBP融合肝素酶Ⅱ，该MBP融合肝素酶Ⅱ是如下a）或b）的蛋白：a）序列表中序列1的氨基酸序列组成的蛋白；b）序列表中序列1氨基酸序列经过对构成MBP融合肝素酶Ⅱ蛋白中肝素酶Ⅱ二聚体结合面的33个氨基酸位点中的一个或多个定点突变的蛋白。上述蛋白的编码基因及制备方法也属于本发明的保护范围。本发明通过基因工程手段对MBP融合肝素酶Ⅱ进行定点突变，最终获得催化活性及热稳定性都明显提高的MBP融合肝素酶Ⅱ。

Description

一种MBP融合肝素酶Ⅱ及其编码基因与制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程和发酵工程领域，特别涉及一种MBP融合肝素酶Ⅱ及其编码基因与制备方法。

背景技术

肝素酶（heparinase）是一类作用于肝素（heparin）或者硫酸乙酰肝素（heparansulfate）的多糖裂解酶，来自肝素黄杆菌的肝素酶主要有肝素酶Ⅰ(EC4.2.2.7)，肝素酶Ⅱ（NoECcode）与肝素酶Ⅲ（EC4.2.2.8）。

相比于肝素酶Ⅰ和Ⅲ，肝素酶Ⅱ具有范围更广的底物与作用位点，产物的种类和组成也更加多样，这一特性使其具备更高的多糖降解效率，在低分子量肝素的制备以及肝素精确结构分析中具有重要的作用。

由于肝素酶Ⅱ的重要应用价值，研究人员一直致力于通过分子改造来改善肝素酶Ⅱ的催化性能。2009年，Lien-IHor等（Lien-IHor,HowardA.Shuman，GeneticanalysisofperiplasmicbindingproteindependenttransportinEscherichiacoli.JMolBiol,1993,233:659-670）对不同来源的肝素酶Ⅱ的一级序列及高级结构进行分析，发现改变肝素酶Ⅱ中几处较保守的氨基酸残基Glu207和His411的电荷性质，可以有效提高肝素酶Ⅱ对硫酸乙酰肝素的亲和能力，但没有对催化性能产生明显的作用。2010年，DavidShaya等（DavidShaya,WenjingZhao,Marie-LineGarron,ZhongpingXiao,QizhiCui,ZhenqingZhang,TraianSulea,RobertJLinhardt,MiroslawCygler.CatalyticmechanismofheparinaseIIinvestigatedbysite-directedmutagenesisandthecrystalstructurewithitssubstrate.JBiolChem.2010，285(26):20051-61.）根据晶体结构信息，对催化中心区域的氨基酸残基Tyr257，His202，和His406进行了定点突变，研究发现：在众多氨基酸替换策略中，Y257F表现的酶活性最高，而H406A表现的酶活性最低；该趋势在对底物降解程度上也是相同的：Y257F能够彻底降解底物，而H406A几乎完全失去降解活性。由此可见，目前肝素酶Ⅱ酶催化能力及热稳定性没有显著提高，并且缺乏通过基因工程手段大幅度提高肝素酶Ⅱ催化活性及热稳定性的有效方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种MBP融合肝素酶Ⅱ。

本发明所提供的MBP融合肝素酶Ⅱ是如下a）或b）的蛋白：

a）序列表中序列1的氨基酸序列组成的蛋白；

b）序列表中序列1氨基酸序列经过对构成MBP融合肝素酶Ⅱ蛋白中肝素酶Ⅱ二聚体结合面的33个氨基酸位点中的一个或多个定点突变的蛋白，其中可选的33个氨基酸位点为PRO615、HIS617、PHE649、ASN650、PRO651、GLY652、GLN654、PHE655、TYR658、TYR701、ARG731、ASP735、LEU736、PRO737、ARG740、TYR741、PHE882、ASN886、ARG1081、PRO1082、LEU1101、THR1104、GLN1106、ILE1113、PRO1116、ALA1117、LEU1118、SER1119、LYS1121、GLY1122、ASP1123、LEU1139、ARG1140。

上述MBP融合蛋白的编码基因，是如下a）或b）核苷酸序列：

a）基因序列是序列表中序列2所示的核苷酸序列；

b）基因序列是编码序列表中序列1氨基酸序列的核苷酸序列，或是编码序列表中序列1氨基酸序列经过对构成MBP融合肝素酶Ⅱ蛋白中肝素酶Ⅱ二聚体结合面的33个氨基酸位点中的一个或多个定点突变的蛋白的核苷酸序列。

本发明的另一个目的在于提供一种MBP融合肝素酶Ⅱ的制备方法：稀有密码子优化法和/或定点突变改造法。

所述的稀有密码子优化法：将来自肝素黄杆菌的肝素酶Ⅱ的编码区序列，按照“大肠杆菌密码子使用偏好”进行优化，得到优化后肝素酶Ⅱ序列；将序列优化后的肝素酶Ⅱ序列与MBP标签构建融合蛋白表达载体，再进行MBP融合肝素酶Ⅱ的表达，得到MBP融合肝素酶Ⅱ蛋白。

所述的来自肝素黄杆菌的肝素酶Ⅱ编码区序列为序列表中序列3。

所述的优化后肝素酶Ⅱ序列为序列表中序列4。

上述的定点突变改造法是将MBP融合肝素酶Ⅱ中的肝素酶Ⅱ氨基酸序列758位即MBP融合肝素酶Ⅱ氨基酸序列（序列表中序列1）中的1126位，定点突变为Ile（CTG），Val（GTG），Ser（AGC），Thr（ACC），Glu（GAA），Gly（GGC），Phe（GCC），Tyr（TTA）之一。

所述的定点突变改造法还可以是对构成MBP融合肝素酶Ⅱ蛋白中的肝素酶Ⅱ二聚体结合面的33个氨基酸位点中的一个或多个定点进行定点突变的方法。

来自肝素黄杆菌中的肝素酶Ⅱ基因不适合在大肠杆菌系统中单独表达，本发明采用稀有密码子优化法，按照“大肠杆菌密码子使用偏好”进行优化，序列优化后肝素酶Ⅱ与MBP标签融合，MBP融合肝素酶Ⅱ在大肠杆菌的表达效率得到了明显的提高，优化前MBP融合肝素酶Ⅱ在总蛋白中所占比例为23.9%，优化后MBP融合肝素酶Ⅱ在总蛋白中所占比例为36.9%。在此基础上进行定点突变改造，尤其对MBP融合肝素酶Ⅱ氨基酸1126位进行突变改造，实验表明该突变位点距离底物结合、催化位点较远，不影响该酶的底物降解机制，通过突变得到了催化活性及热稳定性都明显提高的MBP融合肝素酶Ⅱ，尤其是得到催化活性及热稳定性较佳HepB（1126L）和HepB（1126T）。HepB（1126L）在大肠杆菌中表达的MBP融合肝素酶Ⅱ酶活可达9000IU/L，表达量可达1.83g/L，比酶活可达4.78IU/mg，在最适反应温度30℃的酶活半衰期达到200小时左右；HepB（1126T）在大肠杆菌中表达的MBP融合肝素酶Ⅱ酶活可达5921IU/L，表达量可达0.8g/L，比酶活可达7.4IU/mg，在最适反应温度30度下的酶活半衰期达到40小时左右。

本发明可以实现MBP融合肝素酶Ⅱ催化活性及热稳定性的大幅度提升，并且该突变并不影响该酶的底物降解机制（距离底物结合、催化位点较远），是一种快速、稳定、高效、安全的分子改造策略。

附图说明

图1肝素酶Ⅱ稀有密码子图。

图2肝素酶Ⅱ编码区序列密码子优化前后的使用频率图。

图3序列优化后的肝素酶Ⅱ的MBP融合表达载体构建图。

图4SDS-PAGE电泳图；

其中，泳道1、8：Marker；泳道2：阴性对照；泳道3：总蛋白；泳道4：可溶蛋白；泳道5：不可溶蛋白；泳道6：纯化后肝素酶II；泳道7：纯化过程流过液。

图5HepB（1126P）和HepB（1126A）热稳定性差异比较。

图6HepB（1126P）和HepB（1126A）降解肝素后的产物分析比对（6A、6B、6C）：

其中，6A：1：Marker（各种已知分子量的肝素寡糖混合物）；2：精品肝素对照；3：肝素钠经MBP-HepB（1126P）彻底降解产物；4：肝素钠经MBP-HepB（1126A）彻底降解产物；

6B：C、control对照：精品肝素；1.肝素钠经MBP-HepB（1126P）彻底降解产物；2：肝素钠经MBP-HepB（1126A）彻底降解产物。

图7肝素酶Ⅱ高级结构图：

其中，7A：肝素酶Ⅱ蛋白二聚体构象示意图；

7B：肝素酶Ⅱ晶体结构。

图8肝素酶Ⅱ中758位点空间构象分析：

其中，8A：（1）为758位点在肝素酶II蛋白二聚体中的空间位置，（2）为已经报道的肝素酶Ⅱ的催化域的3个关键氨基酸位置；

8B：758位点氨基酸替换后空间构象；

8C：将758位点附近的构象进行放大比较；

8D：PDB数据库中查到的758位点附件氨基酸侧链的分布情况。

图9肝素酶Ⅱ二聚体构成氨基酸及相互作用力分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。

实施例1肝素酶Ⅱ稀有密码子优化及MBP融合肝素酶Ⅱ载体构建与表达

1.肝素酶Ⅱ稀有密码子优化

来自肝素黄杆菌的肝素酶Ⅱ编码区序列中含有大量的稀有密码子，在以大肠杆菌为宿主菌表达时会严重影响蛋白翻译效率，其原始序列（序列表中序列3）稀有密码子分布见图1。

根据大肠杆菌密码子使用偏好，用目前主流的密码子优化软件DNA2.0（从https://www.dna20.com/官方网站中下载）对肝素酶Ⅱ的编码区序列进行优化，在保证肝素酶Ⅱ的蛋白质序列不变，只利用密码子的简并性的前提下，将在大肠杆菌中使用频率较低、会影响翻译过程中核糖体通过效率的密码子用使用频率较高的密码子进行替换，得到优化后肝素酶Ⅱ序列（序列表中序列4）。肝素酶Ⅱ编码区序列密码子优化前后的使用频率见图2。

2.MBP融合肝素酶Ⅱ载体构建与表达

将序列优化后肝素酶Ⅱ（序列表中序列4，命名为coHepB）与MBP标签构建融合表达载体（过程见图3）。

MBP融合肝素酶Ⅱ载体构建步骤为：（1）序列优化后肝素酶Ⅱ在5’添加BamHI酶切位点，在3’端添加PstI酶切位点，连接在克隆载体PJ201上；（2）质粒与pMAL-c2x空载体质粒用BamHI和PstI双酶切，用T4连接酶将coHepB片段定向插入重组表达质粒pMAL-c2x的多克隆位点中，得到质粒pMHB-c2x，该重组质粒在coHepB的5’端具有MBP蛋白标签。

MBP融合肝素酶Ⅱ载体表达：将构建好的质粒转化大肠杆菌，转化有重组质粒的菌株在含有100ug/mL氨苄青霉素的LB培养基中震摇培养过夜（37℃，180rpm，14-16h）后，按照1:100的比例接种到LB/M9YE发酵培养基中，37℃，180rpm摇至对数生长期，加入IPTG后转至200rpm，15℃低温诱导培养20-22h。

将阳性转化菌，通过超声破碎菌体细胞，提取总蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结果见图4。3、4、6泳道中表达量最大的条带，分子量介于95KD与130KD之间的条带为肝素酶II蛋白。将SDS-PAGE胶图扫描后，用Bandscan5.0胶密度扫描软件进行分析，其目的是测定在相同上样量前提下（泳道内加入蛋白总质量一致），测定目标蛋白在总蛋白中所占的比例，由此来判断密码子优化对于蛋白表达效果的影响。结果表明，优化前MBP融合肝素酶Ⅱ在总蛋白中所占比例为23.9%，优化后MBP融合肝素酶Ⅱ在总蛋白中所占比例为36.9%。

通过比较发现，密码子优化后的MBP融合肝素酶Ⅱ目标蛋白占总蛋白的比例明显提高，这是其发酵酶活提高的主要原因。

实施例2MBP融合肝素酶Ⅱ1126位点氨基酸定点突变及分析

1.MBP融合肝素酶Ⅱ1126位点改造依据

分析来自两株肝素黄杆菌菌株的肝素酶Ⅱ编码区序列，两者蛋白氨基酸序列仅在758位点存在一个氨基酸位点的差异：P758A。按照上述稀有密码子优化法及MBP融合肝素酶Ⅱ载体构建法，构建仅存在位点存在一个氨基酸位点的差异（P1126A）的MBP融合肝素酶Ⅱ表达载体。将上述两个载体进行转化与表达分别得到MBP-HepB融合蛋白HepB(1126P)和HepB(1126A)。

蛋白提取与纯化过程：将100ml目的大肠杆菌发酵菌液集菌后用20ml蛋白提取缓冲液重悬，超声破碎菌体，破碎产物4℃，10000rpm离心30分钟，收集上清，经0.22μm膜过滤，缓慢（1mL/min）通过GEHealthcare的MBPTrapHP（1ml，5ml）亲和柱，分管收集洗脱液，检测各管蛋白浓度，SDS-PAGE电泳检测纯化效果。蛋白纯化在AKTAplus蛋白纯化系统上进行，全程在4℃低温层析柜中操作得到纯化的MBP-HepB融合蛋白HepB(1126P)和HepB(1126A)。

酶活性分析：底物为硫酸乙酰肝素(sigma公司)；扫描波长为232nm，时间为1min。反应缓冲液（20mMTris，200mMNaCl，pH=7.4）与酶溶液共1000μL（比例根据酶液活力大小进行调节），500μL底物溶液（17mMTris，44mMNaCl，3.5mMCaCl2，25g/L硫酸乙酰肝素，pH=7.4）于石英比色皿，混匀后放入分光光度计进行扫描（反应缓冲液与底物溶液在水浴中预热至30℃），计算曲线的斜率k（min-1），MBP融合肝素酶Ⅱ的酶活（IU/L）计算公式如下（V为反应体系中加入酶溶液体积）：

酶活（IU/L）=

酶活测定分析结果见表1，该结果表明HepB（1126A）具有更高的催化活性。

表1比酶活测定

热稳定性分析：将纯化后的HepB(1126P)和HepB(1126A)分别置于冰上，立即检测酶活，以此时的时间记为0，酶活值作为100%。随后将该酶置于30℃温浴，在不同的时间点进行取样测定酶活，记录此时酶活相对于0时刻的酶活值的比例。监测时间根据不同的酶的稳定性不同有所差异，但均需跟踪监测到酶活基本丧失为止。比较不同的酶的稳定性时，则根据该酶在相同浓度、相同溶液条件以及相同温浴条件下的失活速率来进行判断（酶活测定时均平行测3次，取平均值后作为该酶在该时刻的酶活）。热稳定性分析结果表明（见图5），相比于HepB（1126P），HepB（1126A）具有更高热稳定：HepB（1126A）在30℃的酶活半衰期从10小时左右提高到80小时左右。

底物降解分析：对MBP融合肝素酶Ⅱ1126位点HepB（1126P）和HepB（1126A）对肝素底物彻底降解后的组分做了分析。

底物降解分析方法：将经过MBPTrapHP柱亲和纯化后的MBP融合肝素酶Ⅱ加入到底物肝素钠中，在最适反应温度30℃进行彻底降解，其间连续向反应体系中补充酶液，检测产物在232nm下的吸光度值变化，以连续添加2-3次酶液后其吸光度值不再变化为反应终点。将反应液13000rpm/min条件下离心30min，去除变性失活的MBP融合肝素酶Ⅱ，上清液为彻底降解的肝素寡糖产物，经低温冷冻干燥后获得肝素寡糖的固体粉末。在比较1126位点为不同氨基酸的MBP融合肝素酶Ⅱ的降解产物组分时，取相同质量的降解寡糖产物配置浓度相同的检测溶液，通过多糖PAGE电泳、HPLC检测产物主要组分含量、二糖组分含量进行峰图比较，得到降解机制是否有差异的结论。

结果见图6：图6A表明降解产物主要组分集中在2糖和4糖大小附近，而高分子量的多糖含量已经非常低了，说明MBP融合肝素酶Ⅱ已经将肝素底物进行了充分降解，而比较3、4泳道，降解图谱基本一致，对于相同量的底物，MBP融合肝素酶Ⅱ进行彻底降解后的产物组成基本相同，说明1126位置上氨基酸的替换没有影响MBP融合肝素酶Ⅱ的底物降解机制；图6B表明，从HPLC对MBP-HepB充分降解肝素钠主要产物的组分分析来看，无论是紫外检测器还是视差检测器，MBP-HepB（1126P）和MBP-HepB（1126A）降解产物曲线都完全重合，表明两者在底物降解机制方面没有明显差异；图6C表明，与前面结果一致，比较MBP-HepB（1126P）和MBP-HepB（1126A）底物降解组分中的二糖种类以及含量表明，其产物无论是出峰时间还是峰值大小均基本保持一致，说明1126位点氨基酸的替换并没有影响MBP融合肝素酶Ⅱ对底物肝素的降解机制。

上述结果表明：1126位点对于MBP融合肝素酶Ⅱ的理化性质来说非常关键。

2.MBP融合肝素酶Ⅱ1126位点氨基酸替换

基于上述MBP融合肝素酶Ⅱ1126位点改造依据，将实施例1中MBP融合肝素酶Ⅱ载体中的MBP融合肝素酶Ⅱ1126位点通过基因工程手段进行一系列的氨基酸替换：Ile（CTG），Val（GTG），Ser（AGC），Thr（ACC），Glu（GAA），Gly（GGC），Phe（GCC），Tyr（TTA）。

对这些氨基酸替换的MBP融合肝素酶Ⅱ进行催化活性的测定，结果见表2，结果显示突变后催化活性得到了明显的提高。其中，HepB（1126L）在大肠杆菌中表达的MBP融合肝素酶Ⅱ酶活可达9000IU/L，表达量可达1.83g/L，比酶活可达4.78IU/mg；HepB（1126T）在大肠杆菌中表达的MBP融合肝素酶Ⅱ酶活可达5921IU/L，表达量可达0.8g/L，比酶活可达7.4IU/mg。

表21126位氨基酸替换的MBP融合肝素酶Ⅱ比酶活测定汇总

对30℃的酶失活曲线进行测定：

Leu（200h）>Gly（167h）>Ala（140h）≈Ala（140h）>Thr（104h）>Ser（86h）>Glu(14h)>Tyr（13h）>Phe（17h）>Pro（40min）。

实施例3MBP融合肝素酶Ⅱ中与实施例2中MBP融合肝素酶Ⅱ载体中的肝素酶Ⅱ1126位点相似作用位点

目前，PDB数据库中没有MBP融合肝素酶Ⅱ的结构信息，只有肝素酶Ⅱ的结构信息。通过采用DiscoverStudio2.5对肝素酶Ⅱ的758位点进行分析，现该位点处在肝素酶Ⅱ蛋白二聚体结合面上（见图7）。由图7和图8比较分析，758位点氨基酸替换后，空间构象基本没有差异。

运用该方法对二聚体结合面的构成氨基酸进行了相互作用力的分析，结果表明在已经发现的33个构成二聚体结合面的氨基酸残基中，存在部分氨基酸残基之间的强相互作用，部分存在稍弱的相互作用力（见图9）。因此，对于该结合面上其他氨基酸位点的研究有可能进一步提高肝素酶Ⅱ的理化性质。

肝素酶Ⅱ二聚体结合面的氨基酸33个位点为肝素酶Ⅱ的PRO247、HIS249、PHE281、ASN282、PRO283、GLY284、GLN286、PHE287、TYR290、TYR333、ARG363、ASP367、LEU368、PRO369、ARG372、TYR373、PHE514、ASN518、ARG713、PRO714、LEU733、THR736、GLN738、ILE745、PRO748、ALA749、LEU750、SER751、LYS753、GLY754、ASP755、LEU771、ARG772。该位点在MBP融合肝素酶Ⅱ中相对应的位点为PRO615、HIS617、PHE649、ASN650、PRO651、GLY652、GLN654、PHE655、TYR658、TYR701、ARG731、ASP735、LEU736、PRO737、ARG740、TYR741、PHE882、ASN886、ARG1081、PRO1082、LEU1101、THR1104、GLN1106、ILE1113、PRO1116、ALA1117、LEU1118、SER1119、LYS1121、GLY1122、ASP1123、LEU1139、ARG1140。

Claims (7)

1.一种MBP融合肝素酶Ⅱ，是如下a）或b）的蛋白：

a）序列表中序列1的氨基酸序列组成的蛋白；

b）序列表中序列1氨基酸序列经过对构成MBP融合肝素酶Ⅱ蛋白中肝素酶Ⅱ二聚体结合面的33个氨基酸位点中的一个或多个定点突变的蛋白，其中可选的33个氨基酸位点为序列表中序列1中的PRO615、HIS617、PHE649、ASN650、PRO651、GLY652、GLN654、PHE655、TYR658、TYR701、ARG731、ASP735、LEU736、PRO737、ARG740、TYR741、PHE882、ASN886、ARG1081、PRO1082、LEU1101、THR1104、GLN1106、ILE1113、PRO1116、ALA1117、LEU1118、SER1119、LYS1121、GLY1122、ASP1123、LEU1139、ARG1140。

2.一种MBP融合肝素酶Ⅱ的编码基因，是如下a）或b）核苷酸序列：

a）基因序列是序列表中序列2所示的核苷酸序列；

b）基因序列是编码序列表中序列1氨基酸序列的核苷酸序列，或是编码序列表中序列1氨基酸序列经过对构成MBP融合肝素酶Ⅱ蛋白中肝素酶Ⅱ二聚体结合面的33个氨基酸位点中的一个或多个定点突变的蛋白的核苷酸序列。

3.一种MBP融合肝素酶Ⅱ的制备方法，是稀有密码子优化法和/或定点突变改造法。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，稀有密码子优化法：将来自肝素黄杆菌的肝素酶Ⅱ编码区序列，按照“大肠杆菌密码子使用偏好”进行优化，得到优化后肝素酶Ⅱ序列；将序列优化后的肝素酶Ⅱ系列与MBP标签构建融合蛋白表达载体，再进行MBP融合肝素酶Ⅱ的表达，得到MBP融合肝素酶Ⅱ蛋白。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，优化后肝素酶Ⅱ序列为序列表中序列4。

6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，定点突变改造法：将MBP融合肝素酶Ⅱ蛋白中的氨基酸序列1126位点定点突变为Ile（CTG），Val（GTG），Ser（AGC），Thr（ACC），Glu（GAA），Gly（GGC），Phe（GCC），Tyr（TTA）之一。

7.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，定点突变改造法还可以将权利要求1中对构成MBP融合肝素酶Ⅱ蛋白中的肝素酶Ⅱ二聚体结合面的33个氨基酸位点中的一个或多个定点进行定点突变。