CN105754960A - 一种重组流感病毒及其在抑制肿瘤细胞增殖和诱导干扰素的产生中应用 - Google Patents

一种重组流感病毒及其在抑制肿瘤细胞增殖和诱导干扰素的产生中应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组流感病毒及其在抑制肿瘤细胞增殖和诱导干扰素的产生中应用。本发明所提供的重组流感病毒是出发B型流感病毒的基因组进行如下改造得到的：增加了含有caspase3?1的编码基因和caspase3?2的编码基因的DNA分子；所述caspase3?1的氨基酸序列为序列表中序列10自N末端起第285至431位所示的亚基；所述caspase3?2的氨基酸序列为序列表中序列10自N末端起第447至542位所示的亚基。实验证明，本发明所提供的重组流感病毒对A549细胞、Hela细胞和HepG2细胞均具有抑制作用和杀伤作用，重组流感病毒对肿瘤的治疗具有重要价值。

Description

一种重组流感病毒及其在抑制肿瘤细胞增殖和诱导干扰素的产生中应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组流感病毒及其在抑制肿瘤细胞增殖和诱导干扰素的产生中应用。
背景技术
全世界肿瘤的发病率以每年3％的速度递增，每年因肿瘤而死亡人数达600多万人，我国肿瘤的发病率与死亡人数也呈上升趋势。统计资料表明我国一些大中城市居民肿瘤死亡已占据全部死因的首位，因此，加强肿瘤治疗的研究，寻找新型且更敏感的治疗肿瘤方法有着极其重要的意义。
流行性感冒病毒(influenza virus)，是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)流行性感冒病毒(Influenza virus)属的代表种，简称流感病毒，根据核蛋白(Nucleoprotein，NP)和基质蛋白(Matrix protein，MP)抗原性的不同分为甲(A)、乙(B)和丙(C)三型，是流行性感冒(流感)的病原体，其中溯源较早且普遍存在宿主中的为B型。B型流感病毒变异较少，可感染人类，主要症状为咽疼、发烧等，引起暴发或小流行。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何治疗肿瘤。
为解决上述问题，本发明首先提供了一种重组流感病毒。
本发明所提供的重组流感病毒具体为重组B型流感病毒，所述重组B型流感病毒是将出发B型流感病毒的基因组进行如下改造得到的：增加了含有caspase3-1的编码基因和caspase3-2的编码基因的DNA分子；
所述caspase3-1可为如下a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列为序列表中序列10自N末端起第285至431位所示的亚基；
a2)将a1)的N端或/和C端连接标签得到的亚基；
a3)将a1)或a2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的亚基；
所述caspase3-2可为如下b1)或b2)或b3)：
b1)氨基酸序列为序列表中序列10自N末端起第447至542位所示的亚基；
b2)将b1)的N端或/和C端连接标签得到的亚基；
b3)将b1)或b2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的亚基。
上述重组B型流感病毒中，所述caspase3-1的编码基因可为如下c1)或c2)或c3)：
c1)序列表的序列1自5’末端起第853至1293位所示的DNA分子；
c2)与c1)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述caspase3-1的DNA分子；
c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的DNA分子杂交且编码所述caspase3-1的DNA分子或cDNA分子。
上述重组B型流感病毒中，所述caspase3-2的编码基因可为如下d1)或d2)或d3)：
d1)序列表的序列1自5’末端起第1339至1629位所示的DNA分子；
d2)与d1)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述caspase3-2的DNA分子；
d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的DNA分子杂交且编码所述caspase3-2的DNA分子或cDNA分子。
上述重组B型流感病毒中，所述改造的实现方式可为：用特异DNA分子取代所述出发B型流感病毒的基因组中的非结构蛋白的编码基因。
所述特异DNA分子中可含有NS1区段、所述caspase3-1的编码基因、所述caspase3-2的编码基因和NEP区段；
所述NS1区段可编码如下e1)或e2)或e3)：
e1)氨基酸序列为序列表中序列10自N末端起第1至281位所示的蛋白质；
e2)将e1)的N端或/和C端连接标签得到的蛋白质；
e3)将e1)或e2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
所述NEP区段可编码如下f1)或f2)或f3)：
f1)氨基酸序列为序列表中序列11自N末端起第23至144位所示的蛋白质；
f2)将f1)的N端或/和C端连接标签得到的蛋白质；
f3)将f1)或f2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
上述重组B型流感病毒中，所述NS1区段可为如下g1)或g2)或g3)：
g1)序列表的序列1自5’末端起第1至843位所示的DNA分子；
g2)与g1)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述NS1区段的DNA分子；
g3)在严格条件下与g1)或g2)限定的DNA分子杂交且编码所述NS1区段的DNA分子或cDNA分子。
上述重组B型流感病毒中，所述NEP区段可为如下h1)或h2)或h3)：
h1)序列表的序列1自5’末端起第1696至2064位所示的DNA分子；
h2)与h1)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述NEP区段的DNA分子；
h3)在严格条件下与h1)或h2)限定的DNA分子杂交且编码所述NEP区段的DNA分子或cDNA分子。
上述重组B型流感病毒中，所述出发B型流感病毒的基因组中的非结构蛋白的编码基因可为序列表的序列9所示的DNA分子。
上述重组B型流感病毒中，所述特异DNA分子中自上游至下游依次可含有如下元件：所述NS1区段、所述caspase3-1的编码基因、所述caspase3-2的编码基因、猪捷申病毒核糖体stop/start 2A的结合位点的编码基因和所述NEP区段。
所述“猪捷申病毒核糖体stop/start 2A的结合位点”可如序列表中序列11自N末端起第4至22位所示。
所述“猪捷申病毒核糖体stop/start 2A的结合位点”的编码基因可如序列1自5’末端起第1639至1695位所示。
所述NS1区段的编码基因和所述caspase3-1的编码基因之间可通过linker-1基因连接。
所述linker-1基因可为序列表中序列1自5’末端起第844至852位所示的DNA分子，其编码如序列10自N末端起第282至284位所示的linker-1。
所述caspase3-1的编码基因和所述caspase3-2的编码基因之间可通过linker-2基因连接。
所述linker-2基因可为序列表中序列1自5’末端起第1294至1338位所示的DNA分子，其编码如序列10自N末端起第432至446位所示的linker-2。
所述caspase3-2的编码基因和所述“猪捷申病毒核糖体stop/start 2A的结合位点”的编码基因之间可通过linker-3基因连接。
所述linker-3基因可为序列表中序列1自5’末端起第1630至1638位所示的DNA分子，其编码如序列11自N末端起第1至3位所示的linker-3。
所述特异DNA分子具体可为序列表的序列1所示的DNA分子。
上述任一所述重组B型流感病毒的制备方法也属于本发明的保护范围。
上述任一所述重组B型流感病毒的制备方法可包括如下步骤：将质粒pHH21-M、质粒pHH21-PA、质粒pHH21-PB1、质粒pHH21-PB2、质粒pHH21-HA、质粒pHH21-NP、质粒pHH21-NA和质粒pHW2000-NS-caspase3共转染离体的哺乳动物细胞后培养哺乳动物细胞，得到重组病毒；
所述质粒pHH21-M可含有B型流感病毒的基因组中基质蛋白的编码基因。
所述质粒pHH21-PA可含有B型流感病毒的基因组中酸性聚合酶的编码基因。
所述质粒pHH21-PB1可含有B型流感病毒的基因组中的聚合酶Ⅰ的编码基因。
所述质粒pHH21-PB2可含有B型流感病毒的基因组中的聚合酶Ⅱ的编码基因。
所述质粒pHH21-HA可含有B型流感病毒的基因组中的血凝素的编码基因。
所述质粒pHH21-NP可含有B型流感病毒的基因组中的核蛋白的编码基因。
所述质粒pHH21-NA可含有B型流感病毒的基因组中的神经氨酸酶的编码基因。
所述质粒pHW2000-NS-caspase3可含有所述特异DNA分子。
所述质粒pHH21-M具体可为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列2所示的双链DNA分子，得到的重组质粒。
所述质粒pHH21-PA具体可为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列3所示的双链DNA分子，得到的重组质粒。
所述质粒pHH21-PB1具体可为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列4所示的双链DNA分子，得到的重组质粒。
所述质粒pHH21-PB2具体可为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列5所示的双链DNA分子，得到的重组质粒。
所述质粒pHH21-HA具体可为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列6所示的双链DNA分子，得到的重组质粒。
所述质粒pHH21-NP具体可为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列7所示的双链DNA分子，得到的重组质粒。
所述质粒pHH21-NA具体可为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列8所示的双链DNA分子，得到的重组质粒。
所述质粒pHW2000-NS-caspase3具体可为在载体pHW2000的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列1所示的DNA分子，得到的重组质粒。
上述制备方法中，所述哺乳动物细胞具体可为HEK 293T/17细胞。
为解决上述问题，本发明还提供了一种特异DNA分子。
本发明所提供的特异DNA分子含有所述NS1区段、所述caspase3-1的编码基因、所述caspase3-2的编码基因和所述NEP区段。
所述特异DNA分子中自上游至下游依次可含有如下元件：所述NS1区段、所述caspase3-1的编码基因、所述caspase3-2的编码基因、所述猪捷申病毒核糖体stop/start 2A的结合位点的编码基因和所述NEP区段。
所述“猪捷申病毒核糖体stop/start 2A的结合位点”可如序列表中序列11自N末端起第4至22位所示。
所述“猪捷申病毒核糖体stop/start 2A的结合位点”的编码基因可如序列1自5’末端起第1639至1695位所示。
所述NS1区段的编码基因和所述caspase3-1的编码基因之间可通过linker-1基因连接。
所述linker-1基因可为序列表中序列1自5’末端起第844至852位所示的DNA分子，其编码如序列10自N末端起第282至284位所示的linker-1。
所述caspase3-1的编码基因和所述caspase3-2的编码基因之间可通过linker-2基因连接。
所述linker-2基因可为序列表中序列1自5’末端起第1294至1338位所示的DNA分子，其编码如序列10自N末端起第432至446位所示的linker-2。
所述caspase3-2的编码基因和所述“猪捷申病毒核糖体stop/start 2A的结合位点”的编码基因之间可通过linker-3基因连接。
所述linker-3基因可为序列表中序列1自5’末端起第1630至1638位所示的DNA分子，其编码如序列11自N末端起第1至3位所示的linker-3。
所述特异DNA分子具体可为序列表的序列1所示的DNA分子。
本发明还保护上述任一所述重组B型流感病毒在制备产品中的应用；所述产品的功能可为如下k1)至k6)中的至少一种：
k1)抑制肿瘤细胞增殖；
k2)杀伤肿瘤细胞；
k3)诱导肿瘤细胞凋亡；
k4)治疗肿瘤；
k5)诱导干扰素的产生；
k6)提高白介素的含量。
上述应用中，所述k1)、所述k2)或所述k3)中的所述肿瘤细胞可为肺癌细胞、宫颈癌细胞或肝癌细胞。所述肺癌细胞可为A549细胞。所述宫颈癌细胞可为Hela细胞。所述肝癌细胞可为HepG2细胞。
上述应用中，所述k4)中的所述肿瘤可为肺癌、宫颈癌或肝癌。所述肺癌具体可为肺腺癌。
上述应用中，所述k6)中的所述白介素可为白介素1和/或白介素6。
为解决上述问题，本发明还提供了一种产品。
本发明所提供的产品，可包括上述任一所述重组B型流感病毒；所述产品的功能可为如下k1)至k6)中的至少一种：
k1)抑制肿瘤细胞增殖；
k2)杀伤肿瘤细胞；
k3)诱导肿瘤细胞凋亡；
k4)治疗肿瘤；
k5)诱导干扰素的产生；
k6)提高白介素的含量。
上述产品中，所述k1)、所述k2)或所述k3)中的所述肿瘤细胞可为肺癌细胞、宫颈癌细胞或肝癌细胞。所述肺癌细胞可为A549细胞。所述宫颈癌细胞可为Hela细胞。所述肝癌细胞可为HepG2细胞。
上述产品中，所述k4)中的所述肿瘤可为肺癌、宫颈癌或肝癌。所述肺癌具体可为肺腺癌。
上述产品中，所述k6)中的所述白介素可为白介素1和/或白介素6。
实验证明，本发明所提供的重组B型流感病毒对A549细胞、Hela细胞和HepG2细胞均具有抑制作用和杀伤作用，能够引起小鼠脾细胞的增殖，诱导干扰素的产生，提高细胞中白介素6和/或白介素1的含量，表明，本发明所提供的重组B型流感病毒对肿瘤有一定的治疗作用。可见，本发明提供的重组B型流感病毒对肿瘤的治疗具有重要价值。
附图说明
图1为病毒液对A549细胞的抑制作用。
图2为病毒液对Hela细胞的抑制作用。
图3为病毒液对HepG2细胞的抑制作用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
PBS缓冲液均为pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。
NS1蛋白的氨基酸序列如序列10自N末端起第1至281位所示，其编码基因(又称NS1基因)的核苷酸序列如序列1自5’末端起第1至843位所示。
linker-1的氨基酸序列如序列10自N末端起第282至284位所示，其编码基因(又称linker-1基因)的核苷酸序列如序列1自5’末端起第844至852位所示。
caspase3-1亚基的氨基酸序列如序列10自N末端起第285至431位所示，其编码基因(又称caspase3-1基因)的核苷酸序列如序列1自5’末端起第853至1293位所示。
linker-2的氨基酸序列如序列10自N末端起第432至446位所示，其编码基因(又称linker-2基因)的核苷酸序列如序列1自5’末端起第1294至1338位所示。
caspase3-2亚基的氨基酸序列如序列10自N末端起第447至542位所示，其编码基因(又称caspase3-2基因)的核苷酸序列如序列1自5’末端起第1339至1629位所示。
linker-3的氨基酸序列如序列11自N末端起第1至3位所示，其编码基因(又称linker-3基因)的核苷酸序列如序列1自5’末端起第1630至1638位所示。
猪捷申病毒(Porcine tescgovirus-1)核糖体stop/start 2A的结合位点的氨基酸序列如序列11自N末端起第4至22位所示，其编码基因的核苷酸序列如序列1自5’末端起第1639至1695位所示。
NEP蛋白的氨基酸序列如序列11自N末端起第23至144位所示，其编码基因(又称NEP基因)的核苷酸序列如序列1自5’末端起第1696至2064位所示。
caspase3-1亚基和caspase3-2亚基形成半胱氨酸蛋白酶，即caspase3。
载体pHH21记载在如下文献中：Neumann，G.et al.，Generation of influenza A virusesentirely from cloned cDNAs.P Natl Acad Sci Usa 96(16)，9345(1999).公众可以从中国科学院微生物所获得。
100×洗涤液：取KH2PO4 0.2g，Na2HPO4 12H2O 2.9g，NaCl 8g，KCl 0.2g和Tween-2050mL，用蒸馏水定容至1L，调pH至7.4。
洗涤液：用蒸馏水将100×洗涤液稀释至100倍体积。
病毒感染液：含2μg/mL对-甲苯磺酰-苯丙胺酰氯甲酮(TPCK)处理的胰酶、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM培养基。
MTT溶液：0.5g MTT溶于100mL的pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。
双抗DMEM培养基：含100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％(体积百分比)FBS的DMEM培养基。
结晶紫染色液：取50mg结晶紫，用20mL乙醇溶解，然后用蒸馏水定容至100mL。
BALB/c鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司产品，BALB/c鼠在下文中称为小鼠。淋巴细胞分离液为MP公司产品，产品目录号为50494X。1640培养基为Gibco公司产品，产品目录号为11897-020。HEK 293T/17细胞购自ATCC，编号为CRL-11268。MDCK细胞购自ATCC，编号为CCL-34。DMEM培养基为Gibco公司产品，产品目录号为31800-022。A549细胞(人肺腺癌细胞)为ATCC公司产品，产品目录号为CCL-185。Hela细胞(人宫颈癌细胞)为ATCC公司产品，产品目录号为CCL-2。HepG2细胞(人肝癌细胞)为ATCC公司产品，产品目录号为HB-8065。FBS(胎牛血清)为Gibco公司产品，产品目录号为16000-044。已包被caspase3单克隆抗体的微孔板为CORNING公司产品。TMB显色工作液为Aladdin公司产品，产品目录号为T117927。Binding Buffer为Miltenyi Biotec公司产品，产品目录号为130-092-820。荧光探针为用FITC标记的Annexin-V，Annexin-V为Mi ltenyi Biotec公司产品，产品目录号为130-092-052。Binding Buffer为Mi ltenyi Biotec公司产品，产品目录号为130-092-820。干扰素标准品为NIBSC公司产品，产品目录号为95/556。MDBK细胞为ATCC公司产品，产品目录号为CCL-22。VSV病毒购自中国兽医药品监察所。载体pHW2000为Biovector公司产品，产品目录号为186294。lipofectamine 2000为invitrogen公司产品，货号为11668019。OPTI-MEM培养基为Gibco公司产品。
实施例1、重组B型流感病毒的制备
一、质粒的构建
1、构建质粒pHW2000-NS-caspase3
在载体pHW2000的BsmBI酶切位点插入序列表的序列1所示的双链DNA分子，得到质粒pHW2000-NS-caspase3。经测序，所述质粒pHW2000-NS-caspase3中具有序列表的序列1所示的DNA分子。
序列表的序列1中，自5’末端起第1至843位所示的核苷酸序列为NS1基因，第844至852位所示的核苷酸序列为linker-1基因，第853至1293位所示的核苷酸序列为人caspase3-1基因，第1294至1338位所示的核苷酸序列为linker-2基因，第1339至1629位所示的核苷酸序列为人caspase3-2基因，第1630至1638位所示的核苷酸序列为linker-3基因，第1639至1695位所示的核苷酸序列为猪捷申病毒(Porcine tescgovirus-1)核糖体stop/start 2A的结合位点，第1696至2064位所示的核苷酸序列为NEP基因。其中linker-1基因、linker-2基因和linker-3基因仅起将各蛋白或亚基的编码基因分割开来的作用，以保证蛋白质折叠成准确的高级结构。猪捷申病毒(Porcine tescgovirus-1)核糖体stop/start 2A的结合位点的作用为使核糖体结合并进入，从而保证NEP蛋白的表达。
2、构建质粒pHH21-M
在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列2所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-M。
3、构建质粒pHH21-PA
在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列3所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-PA。
4、构建质粒pHH21-PB1
在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列4所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-PB1。
5、构建质粒pHH21-PB2
在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列5所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-PB2。
6、构建质粒pHH21-HA
在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列6所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-HA。
7、构建质粒pHH21-NP
在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列7所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-NP。
8、构建质粒pHH21-NA
在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列8所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-NA。
9、构建质粒质粒pHW2000-NS
在载体pHW2000的BsmBI酶切位点插入序列表的序列9所示的双链DNA分子，得到质粒pHW2000-NS。
二、重组B型流感病毒的制备
1、将步骤一构建的质粒pHW2000-NS-caspase3、质粒pHH21-M、质粒pHH21-PA、质粒pHH21-PB1、质粒pHH21-PB2、质粒pHH21-HA、质粒pHH21-NP和质粒pHH21-NA共转染HEK293T/17细胞(每1×107个HEK 293T/17细胞约转染1μg质粒pHW2000-NS-caspase3、1μg质粒pHH21-M、1μg质粒pHH21-PA、1μg质粒pHH21-PB1、1μg质粒pHH21-PB2、1μg质粒pHH21-HA、1μg质粒pHH21-NP和1μg质粒pHH21-NA)(共转染过程中，转染试剂为lipofectamine 2000，培养基为OPTI-MEM培养基)，37℃、5％CO2培养箱中孵育6h，然后更换OPTI-MEM培养基为病毒感染液，37℃、5％CO2培养箱中继续培养72h，最后将上清和细胞垂悬，获得P1代病毒混合液。
2、取P1代病毒混合液，冻融1次，1000rpm离心10min，收集上清液(即重组B型流感病毒的病毒液)，将该上清液命名为rIBV-caspase3病毒液。
与B型流感病毒唯一不同的是，重组B型流感病毒的基因组中含有猪捷申病毒(Porcinetescgovirus-1)核糖体stop/start 2A的结合位点、caspase3-1基因和caspase3-2基因，可表达caspase3。
取rIBV-caspase3病毒液，通过噬斑鉴定检测重组B型流感病毒滴度。噬斑鉴定的方法如下：(1)将MDCK细胞接种于12孔板(每孔约1×105细胞)，37℃、5％CO2培养箱中培养过夜；(2)用PBS缓冲液洗去细胞表面的培养基，然后将rIBV-caspase3病毒液用病毒感染液梯度稀释后分别加入各孔中，每个稀释度设置三个复孔，37℃孵育1h；(3)吸弃上清并用PBS缓冲液清洗细胞，每孔加入1mL混合溶液(混合溶液的制备方法为将1体积份融化后降温至37℃左右的3％低熔点琼脂糖与1体积份预热到37℃的DMEM培养基等体积混合，且混合物中加入TPCK处理的胰酶、青霉素和链霉素，使得胰酶浓度为2μg/ml，青霉素和链霉素的浓度均为100U/mL)；(4)完成步骤(3)后，所述12孔板4℃放置15min，待琼脂凝固后，将所述12孔板翻转过来倒置在37℃培养箱中培养，在显微镜下观察细胞病变情况，培养3d后，将所述12孔板从培养箱中取出，计数空斑数。
结果表明，rIBV-caspase3病毒液的滴度为2000PFU/mL。
三、IBV病毒液的制备
按照上述步骤二，将质粒pHW2000-NS-caspase3替换为质粒pHW2000-NS，其它步骤均不变，得到的上清液(即B型流感病毒的病毒液)，将该上清液命名为IBV病毒液，IBV病毒液的滴度为2000PFU/mL。
实施例2、检测caspase3的表达量
1、取处于对数生长期的A549细胞接种于6孔板，加入实施例1制备的rIBV-caspase3病毒液(感染剂量为0.1MOI)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。培养完毕后，收集细胞并用PBS缓冲液洗涤两次，超声破碎，得到细胞破碎液，离心，取上清，得到细胞破碎上清液。
2、取所述细胞破碎上清液，用PBS缓冲液稀释至5倍体积，获得稀释液。
3、取已包被caspase3单克隆抗体的微孔板，每孔加入100μL稀释液或PBS缓冲液(作为空白对照)，用封口膜封好，37℃孵育1h；然后弃上清，用洗涤液洗涤5次，拍干。
4、完成步骤3后，每孔加入100μL生物素化的抗Caspase3，形成免疫复合物连接在板上，用封口膜封好，37℃孵育1h；然后弃上清，用洗涤液洗涤5次，拍干。
5、完成步骤4后，每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与生物素结合，用封口膜封好，37℃孵育1h；然后弃上清，用洗涤液洗涤5次，拍干。
6、完成步骤5后，每孔加入100μl TMB显色工作液，37℃孵育15min；然后每孔加入2M硫酸终止反应，450nm处检测吸光值。
7、将步骤6得到的吸光值代入用caspase3标准品制作的标准曲线方程，计算得到rIBV-caspase3病毒液中caspase3的表达量为0.37mg/mL，空白对照无显色，表明没有caspase3蛋白存在。
实施例3、重组B型流感病毒对肿瘤细胞的抑制作用和杀伤作用
一、重组B型流感病毒对肿瘤细胞的抑制作用
采用MTT方法检测重组B型流感病毒对肿瘤细胞的抑制作用。具体步骤如下：
1、将处于对数生长期的肿瘤细胞(A549细胞、Hela细胞或HepG2细胞)用胰酶消化，然后用含10％(体积百分比)FBS的DMEM培养基中培养，获得浓度为5×104个/mL的肿瘤细胞悬浮液。
2、取实施例1制备的rIBV-caspase3病毒液，用DMEM培养基稀释，得到浓度为5×102PFU/mL的病毒稀释液。
3、取96孔板，每孔加入200μL步骤1获得的肿瘤细胞悬浮液，37℃培养12～16h(目的为使肿瘤细胞贴壁)，弃培养基。
4、完成步骤3后，取所述96孔板，每孔加入200μL病毒稀释液，感染1h，弃培养基；PBS缓冲液洗涤一次；每孔加入200μL含2％(体积百分比)FBS的DMEM培养基，37℃培养24h、48h、72h或96h，然后加入20μL MTT溶液，孵育4h，弃培养基，最后每孔加入150μL DMSO并充分混匀，采用酶标仪检测490nm处的吸光值，得到肿瘤细胞经rIBV-caspase3病毒液处理不同时间的吸光值。
按照上述步骤，将rIBV-caspase3病毒液替换为IBV病毒液，其它步骤均不变，作为对照。
按照上述步骤，将rIBV-caspase3病毒液替换为DMEM培养基，其它步骤均不变，作为空白对照。
以步骤4中37℃培养的时间为横坐标，生长抑制率为纵坐标，比较肿瘤细胞经rIBV-caspase3病毒液或IBV病毒液处理不同时间的增殖程度。生长抑制率的计算公式如下：
生长抑制率(100％)＝1-(肿瘤细胞经rIBV-caspase3病毒液或IBV病毒液处理不同时间的吸光值/肿瘤细胞在DMEM培养基培养相应时间的吸光值)×100％。
病毒液对肿瘤细胞的抑制作用分别见图1、图2和图3。结果表明，rIBV-caspase3病毒液和IBV病毒液对肿瘤细胞均有一定的抑制作用，且抑制率具有时间依赖性，但rIBV-caspase3病毒液对肿瘤细胞的抑制作用较强，当加入含2％(体积百分比)FBS的DMEM培养基37℃培养96h时，对肿瘤细胞的抑制率达到最高。
二、重组B型流感病毒对肿瘤细胞的杀伤效果
1、将处于对数生长期的肿瘤细胞(A549细胞、Hela细胞或HepG2细胞)用胰酶消化，然后用DMEM培养基培养，获得浓度为5×105个/mL的肿瘤细胞悬浮液。
2、取6孔板，每孔加入1mL步骤1获得的肿瘤细胞悬浮液，37℃培养至细胞贴壁覆盖率达到70％，弃培养基。
3、完成步骤2后，取所述6孔板，每孔加入实施例1制备的rIBV-caspase3病毒液(剂量为0.1MOI)，感染1h，弃培养基；然后用PBS缓冲液洗涤两次，每孔加入2mL含2％(体积百分比)FBS的DMEM培养基，37℃培养48h。
4、完成步骤3后，取所述6孔板，用胰酶消化，PBS缓冲液洗涤两次，然后用BindingBuffer(Mi ltenyi Biotec公司产品，产品目录号为130-092-820)重悬，获得细胞浓度为1×106个/mL的肿瘤细胞悬浮液。
5、取步骤4获得的肿瘤细胞悬浮液200μL，加入5μL荧光探针(用FITC标记的Annexin-V，混匀，室温避光孵育30min；再加入300μL Binding Buffer，混匀，室温避光孵育10min，立即用流式细胞仪定量检测。
按照上述步骤，将rIBV-caspase3病毒液替换为IBV病毒液，其它步骤均不变，作为对照。
按照上述步骤，将步骤3中加入实施例1制备的rIBV-caspase3病毒液(剂量为0.1MOI)替换为加入1mL的DMEM培养基，其它步骤均不变，作为空白对照。
按照上述步骤，将步骤5替换为“取步骤4获得的肿瘤细胞悬浮液200μL，加入300μL Binding Buffer，混匀，室温避光孵育10min，立即用流式细胞仪定量检测”，其它步骤均不变，作为阴性对照。
结果表明，rIBV-caspase3病毒液和IBV病毒液均可以诱导肿瘤细胞发生凋亡，但rIBV-caspase3病毒液引起肿瘤细胞的凋亡现象比相同条件下IBV病毒液引起的肿瘤细胞的凋亡现象更明显。
实施例4、动物水平检测重组B型流感病毒对肿瘤的治疗作用和安全性
一、MTT法测定重组B型流感病毒对小鼠脾细胞的增殖活性
采用MTT法测定重组B型流感病毒对小鼠脾细胞的增殖活性，具体步骤如下：
(1)取小鼠，断颈处死后浸入75％乙醇水溶液中浸泡1～2min。
(2)取所述小鼠，在无菌条件下取出小鼠脾脏。
(3)在无菌条件下，向60mm培养皿中放入4～5mL淋巴细胞分离液，用镊子把尼龙网固定在所述培养皿上。
(4)取所述小鼠脾脏，用注射器活塞轻轻研磨，使得分散的小鼠脾细胞透过所述尼龙网进入所述淋巴细胞分离液，然后转移到离心管中，加入约1mL 1640培养基进行覆盖，800g离心30min。
(5)完成步骤(4)后，取淋巴细胞，加入10mL 1640培养基洗涤一次，250g离心10min，弃上清，然后加入含10％(体积百分比)FBS的1640培养基进行稀释，得到单个细胞悬浮液。
(6)取实施例1制备的rIBV-caspase3病毒液，经超速离心和蔗糖梯度离心纯化，得到刺激物。
(7)取96孔板，将孔分成三组，分别处理如下：
试验孔：每孔加入200μL单个细胞悬浮液(每孔约(1～8)×105个细胞)，5％CO2、37℃培养24h；再每孔加入20μg刺激物(体积为20μL)，5％CO2、37℃培养72h，然后加入20μL MTT溶液，孵育4h，离心并弃培养基，最后每孔加入150μL的DMSO并充分混匀，采用酶联免疫监测仪检测570nm处的吸光值；
阳性对照孔：用20μL胸腺肽溶液(胸腺肽浓度为25μg/mL)代替所述20μg刺激物，其它同试验孔；
阴性对照孔：用20μL PBS缓冲液代替所述20μg刺激物，其它同试验孔；
空白对照孔：每孔加入200μL单个细胞悬浮液(每孔约(1～8)×105个细胞)，5％CO2、37℃培养100h，采用酶联免疫监测仪检测570nm处的吸光值。
根据下述公式计算刺激系数(SI)：
刺激系数(SI)＝(试验孔在570nm处的吸光值-空白对照孔在570nm处的吸光值)/(阴性对照孔在570nm处的吸光值-空白对照孔在570nm处的吸光值)×100％。
实验结果如下：加入刺激物的试验组与加入胸腺肽溶液的阳性对照组，差异不明显，而与空白对照组差异较明显。结果表明rIBV-caspase3病毒液经超速离心和蔗糖梯度离心纯化得到的刺激物能够引起脾细胞增殖，具有免疫活性。因此，重组B型流感病毒能够引起小鼠脾细胞的增殖。
二、采用细胞病变抑制法测定rIBV-caspase3病毒液的效价
1、制备标准溶液
取干扰素标准品，用双抗DMEM培养基稀释至0.001mg/mL，然后继续用双抗DMEM培养基稀释4倍，得到标准溶液1。
取标准溶液1，用双抗DMEM培养基稀释4倍，得到标准溶液2，如此倍比稀释得到标准溶液3、标准溶液4、标准溶液5和标准溶液6。
2、制备检测溶液
按照上述步骤1的方法，将干扰素标准品替换为rIBV-caspase3病毒液，其它步骤均不变，得到检测溶液1、检测溶液2、检测溶液3、检测溶液4、检测溶液5和检测溶液6。
3、铺板
将处于对数生长期的MDBK细胞用胰酶消化，加入双抗DMEM培养基培养，获得浓度为1×105个/mL的细胞悬浮液。
取96孔板，每孔加入100μL细胞悬浮液，37℃培养8～10h，使其成为单层细胞。
4、加样
取所述96孔板，每孔加入100μL的干扰素处理溶液(标准溶液1、标准溶液2、标准溶液3、标准溶液4、标准溶液5或标准溶液6)、检测溶液(检测溶液1、检测溶液2、检测溶液3、检测溶液4、检测溶液5或检测溶液6)或双抗DMEM培养基(作为空白对照)，37℃培养12～15h。设置三个复孔。
5、制备VSV病毒液
取VSV病毒，用DMEM培养基稀释至1000TCID50/mL，即为VSV病毒液。
6、攻毒
完成步骤4后，取所述96孔板，弃上清，每孔用100μL PBS缓冲液洗2～3遍。然后在已加入干扰素处理溶液或检测溶液的孔中加入100μL VSV病毒液(攻毒剂量为100TCID50)，在空白对照孔中加入100μL双抗DMEM培养基。
37℃培养24h，观察细胞病变情况。
7、染色
取所述96孔板，弃上清，每孔用100μL PBS缓冲液洗1遍，然后每孔加入100μL的结晶紫染色液，室温放置30min。
8、脱色
取所述96孔板，弃染色液，用自来水冲洗未着色染料，然后每孔加入100μL脱色液(由50mL乙醇、50mL蒸馏水和0.1mL乙酸混合制成)，室温放置10min。
9、比色
运用酶标仪测定在570nm处的OD值。
10、数据处理
以能抑制50％细胞病变的干扰素含量定义为一个活性单位，运用Reed-Muench法计算rIBV-caspase3病毒液的干扰素效价，即能抑制50％细胞病变的稀释倍数，并按下述公式计算实验结果：
rIBV-caspase3病毒液的效价(IU/mL)＝(标准品效价×rIBV-caspase3病毒液半效稀释倍数×rIBV-caspase3病毒液预稀释倍数)/(标准品半效稀释倍数×标准品预稀释倍数)
实验结果表明，rIBV-caspase3病毒液的抑制半数细胞病变的效价为106IU/mL。因此，重组B型流感病毒可以诱导干扰素的产生，因为干扰素对肿瘤有治疗作用，所以重组B型流感病毒可以用于治疗肿瘤。
三、采用荧光定量PCR法检测白介素1的含量
1、将质粒pHW2000-NS-caspase3转染HEK 293T/17细胞(每0.1μg质粒pHW2000-NS-caspase3约转染1×105个HEK 293T/17细胞)，37℃培养6小时后更换培养基为病毒感染液，继续培养24h，收集细胞，即24h转染细胞。
按照上述方法，将24h分别替换为0h、2h、4h、6h或8h，获得0h转染细胞、2h转染细胞、4h转染细胞、6h转染细胞和8h转染细胞。
2、取转染细胞(0h转染细胞、2h转染细胞、4h转染细胞、6h转染细胞、8h转染细胞或24h转染细胞)，采用Trizol法提取RNA，然后进行反转录获得cDNA。
3、以步骤2获得的cDNA为模板，通过荧光定量PCR检测转染细胞中白介素1的相对表达量(以GADPH基因为内参基因)。反应程序为95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，40个循环；60℃收集荧光。
鉴定白介素1的引物为5’-ATGGGATAACGAGGCTTATGTG-3’和5’-CAAGGCCACAGGTATTTTGTC-3’。
鉴定GADPH基因的引物为5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGGA-3’和5’-AACATCATCCCTGCTTCCAC-3’。
将0h转染细胞中白介素1的相对表达量作为1，2h转染细胞、4h转染细胞、6h转染细胞、8h转染细胞和24h转染细胞中白介素1的相对表达量分别为1.7、2.1、3.8、4.9和6.8。结果表明，重组B型流感病毒可以提高细胞中白介素1的含量。因为白介素1对肿瘤有治疗作用，所以重组B型流感病毒可以用于治疗肿瘤。
四、采用荧光定量PCR法检测白介素6的含量
1、同步骤三中的1。
2、同步骤三中的2。
3、以步骤2获得的cDNA为模板，通过荧光定量PCR检测转染细胞中白介素6的相对表达量(以GADPH基因为内参基因)。反应程序为95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，40个循环；60℃收集荧光。
鉴定白介素6的引物为5’-TGGATGAGCTGAACTGTACCC-3’和5’-GCTTGCCAAGGATTGTGAGT-3’。
鉴定GADPH基因的引物为5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGGA-3’和5’-AACATCATCCCTGCTTCCAC-3’。
将0h转染细胞中白介素6的相对表达量作为1，2h转染细胞、4h转染细胞、6h转染细胞、8h转染细胞和24h转染细胞中白介素6的相对表达量分别为1.7、2.8、3.5、4.1和5.6。结果表明，重组B型流感病毒可以提高细胞中白介素6的含量。因为白介素6对肿瘤有治疗作用，所以重组B型流感病毒可以用于治疗肿瘤。

Claims (10)

1.一种重组B型流感病毒，其特征在于：所述重组B型流感病毒是出发B型流感病毒的基因组进行如下改造得到的：增加了含有caspase3-1的编码基因和caspase3-2的编码基因的DNA分子；
所述caspase3-1为如下a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列为序列表中序列10自N末端起第285至431位所示的亚基；
a2)将a1)的N端或/和C端连接标签得到的亚基；
a3)将a1)或a2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的亚基；
所述caspase3-2为如下b1)或b2)或b3)：
b1)氨基酸序列为序列表中序列10自N末端起第447至542位所示的亚基；
b2)将b1)的N端或/和C端连接标签得到的亚基；
b3)将b1)或b2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的亚基。
2.如权利要求1所述的重组B型流感病毒，其特征在于：
所述caspase3-1的编码基因为如下c1)或c2)或c3)：
c1)序列表的序列1自5’末端起第853至1293位所示的DNA分子；
c2)与c1)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述caspase3-1的DNA分子；
c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的DNA分子杂交且编码所述caspase3-1的DNA分子或cDNA分子；
所述caspase3-2的编码基因为如下d1)或d2)或d3)：
d1)序列表的序列1自5’末端起第1339至1629位所示的DNA分子；
d2)与d1)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述caspase3-2的DNA分子；
d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的DNA分子杂交且编码所述caspase3-2的DNA分子或cDNA分子。
3.如权利要求1或2所述的重组B型流感病毒，其特征在于：所述改造的实现方式为：用特异DNA分子取代所述出发B型流感病毒的基因组中的非结构蛋白的编码基因；所述特异DNA分子中含有NS1区段、所述caspase3-1的编码基因、所述caspase3-2的编码基因和NEP区段；
所述NS1区段编码如下e1)或e2)或e3)：
e1)氨基酸序列为序列表中序列10自N末端起第1至281位所示的蛋白质；
e2)将e1)的N端或/和C端连接标签得到的蛋白质；
e3)将e1)或e2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
所述NEP区段编码如下f1)或f2)或f3)：
f1)氨基酸序列为序列表中序列11自N末端起第23至144位所示的蛋白质；
f2)将f1)的N端或/和C端连接标签得到的蛋白质；
f3)将f1)或f2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
4.如权利要求3所述的重组B型流感病毒，其特征在于：
所述NS1区段为如下g1)或g2)或g3)：
g1)序列表的序列1自5’末端起第1至843位所示的DNA分子；
g2)与g1)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述NS1区段的DNA分子；
g3)在严格条件下与g1)或g2)限定的DNA分子杂交且编码所述NS1区段的DNA分子或cDNA分子；
所述NEP区段为如下h1)或h2)或h3)：
h1)序列表的序列1自5’末端起第1696至2064位所示的DNA分子；
h2)与h1)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述NEP区段的DNA分子；
h3)在严格条件下与h1)或h2)限定的DNA分子杂交且编码所述NEP区段的DNA分子或cDNA分子；
所述出发B型流感病毒的基因组中的非结构蛋白的编码基因为序列表的序列9所示的DNA分子。
5.如权利要求3或4所述的重组B型流感病毒，其特征在于：所述特异DNA分子中自上游至下游依次含有如下元件：所述NS1区段、所述caspase3-1的编码基因、所述caspase3-2的编码基因、猪捷申病毒核糖体stop/start 2A的结合位点的编码基因和所述NEP区段。
6.如权利要求5所述的重组B型流感病毒，其特征在于：所述特异DNA分子为序列表的序列1所示的DNA分子。
7.如权利要求3至6中任一所述的重组B型流感病毒，其特征在于：其制备方法包括如下步骤：将质粒pHH21-M、质粒pHH21-PA、质粒pHH21-PB1、质粒pHH21-PB2、质粒pHH21-HA、质粒pHH21-NP、质粒pHH21-NA和质粒pHW2000-NS-caspase3共转染离体的哺乳动物细胞后培养哺乳动物细胞，得到重组病毒；
所述质粒pHH21-M含有B型流感病毒的基因组中基质蛋白的编码基因；
所述质粒pHH21-PA含有B型流感病毒的基因组中酸性聚合酶的编码基因；
所述质粒pHH21-PB1含有B型流感病毒的基因组中的聚合酶Ⅰ的编码基因；
所述质粒pHH21-PB2含有B型流感病毒的基因组中的聚合酶Ⅱ的编码基因；
所述质粒pHH21-HA含有B型流感病毒的基因组中的血凝素的编码基因；
所述质粒pHH21-NP含有B型流感病毒的基因组中的核蛋白的编码基因；
所述质粒pHH21-NA含有B型流感病毒的基因组中的神经氨酸酶的编码基因；
所述质粒pHW2000-NS-caspase3含有所述特异DNA分子。
8.一种特异DNA分子，其特征在于：所述特异DNA分子中含有权利要求3或4中所述NS1区段、权利要求1或2中所述caspase3-1的编码基因、权利要求1或2中所述caspase3-2的编码基因和权利要求3或4中所述NEP区段。
9.权利要求1至7任一所述重组B型流感病毒在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下k1)至k6)中的至少一种：
k1)抑制肿瘤细胞增殖；
k2)杀伤肿瘤细胞；
k3)诱导肿瘤细胞凋亡；
k4)治疗肿瘤；
k5)诱导干扰素的产生；
k6)提高白介素的含量。
10.一种产品，包括权利要求1至7任一所述重组B型流感病毒；所述产品的功能为如下k1)至k6)中的至少一种：
k1)抑制肿瘤细胞增殖；
k2)杀伤肿瘤细胞；
k3)诱导肿瘤细胞凋亡；
k4)治疗肿瘤；
k5)诱导干扰素的产生；
k6)提高白介素的含量。
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