CN105753946A

CN105753946A - 人乳头瘤病毒(hpv)18型致癌性e6和e7蛋白的抗原表位最小基序肽

Info

Publication number: CN105753946A
Application number: CN201410779252.9A
Authority: CN
Inventors: 徐万祥; 唐海平; 徐晨; 刘日廷; 王健; 连文博; 詹建民; 薛峰; 王莉
Original assignee: GUANGZHOU HENGSHANG MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Guangdong South Bay Medical Technology Co., Ltd.
Priority date: 2014-12-15
Filing date: 2014-12-15
Publication date: 2016-07-13

Abstract

本发明提供了人乳头瘤病毒(HPV)18型致癌性E6和E7蛋白的抗原表位最小基序肽，其可特异性地与抗HPV18型抗体进行结合；并且由于单个表位肽抗原是高度特异性的，可以组合应用，因此可提高检测的灵敏度(提高检测血清样本的稀释度)和特异性。

Description

人乳头瘤病毒(HPV)18型致癌性E6和E7蛋白的抗原表位最小基序肽

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及人乳头瘤病毒(HPV)18型致癌性E6和E7蛋白的抗原表位最小基序肽。

背景技术

由于发现或发明能诱发线性或非构象型抗体生成的B细胞表位(Bcellepitope,BCE,或称抗原决定簇)，能用作研制抗体有效的预防性合成肽疫苗的候选肽段，因此通常使用成熟的常规化学合成肽法、噬菌体展示文库法、不同长短肽芯片法以及借助计算机软件预测鉴定已知氨基酸序列靶蛋白上的BCE肽，一直是免疫学、病毒学和转化医学等领域中一个重要研究任务。

现在已清楚用兔多克隆抗体(多抗)鉴定的BCE肽由3-8个氨基酸残基组成。但是，由于表位扫描作图方法的限制，目前获得的可用于合成肽疫苗和临床诊断研制的肽段都较长，即它们实际上都是含靶抗原表位基序的一段抗原性肽，因而不能真正称为BCE肽。这样的抗原性肽在实际应用上的缺陷是显而易见，也就是，肽越长，其中的N个潜在表位数越多。因而作为合成肽疫苗的候选表位肽，其游离母蛋白抗原后单独诱发特定功能性/保护性抗体的效果，存在不确定性或效果不能达到最佳(因为在这一抗原性肽内的N个表位中，哪一潜在的表位是诱发抗体的优势表位就无法知晓或确定)。其作为诊断肽抗原往往也存在缺乏特异性的问题，尤其在自身免疫疾病和病毒自然感染抗体滴度不高的情况下，由于检测血清样本稀释度大多不可能高(常见1:10－1:100)，加上人体内原本就存在成千上万种抗不明抗原抗体的因素，易造成较高或一定比率假阳性检测结果，而大多数检测不容许假阳性结果的出现，因为那会造成对正常人不需要药物治疗的不可接受无谓伤害。

因此，从表位肽实际应用出发，鉴定每一个靶蛋白表位的抗体识别最小基序显得尤为重要。其必要性至少体现在两个方面：1)可使鉴定的表位肽中潜在N个表位数(如以4肽表位为例，它还可能存在另外两个潜在的表位，即由1-3和2-4氨基酸序列构成)减到最小，从而大大增加诱发目的抗体的概率，或减少检测目的抗体的假阳性误诊率；2)可揭示靶蛋白抗原上全部线性表位，例如，用兔多抗对HPV18-E7蛋白的表位扫描作图仅鉴定出1个长抗原性肽(BleulC,etal.Humanpapillomavirustype18E6andE7antibodiesinhumansera:increasedanti-E7prevalenceincervicalcancerpatients.JClinMicrobiol,29:1579-1588,1991)，原因就在于以前无法对许多相邻免疫印迹反应性抗原性肽进行每一个抗体识别最小基序的鉴定(见说明书附图2和3)。后者解码一个靶蛋白上全部精细表位肽的益处，更在于可合并它们构建一个真正特异的检测抗原，通过检测暴露在靶蛋白上多个表位诱发抗体，而提高临床检测的灵敏度(体现在可增加检测血清样本的稀释度，由此可减少众多低水平抗不明抗原抗体的干扰，极大地降低或完全避免假阳性检测结果)。

基于以上容易理解的理念和实际应用需求，本发明人建立了专门用于表位扫描作图和进行表位最小基序鉴定的改良生物合成肽法(XuWX,etal.Minimalmotifmappingofaknownepitopeonhumanzonapellucidaprotein-4usingapeptidebiosynthesisstrategy.JReprodImmunol,81:9-16,2009；XuWX,etal.MappingofminimalmotifsofB-cellepitopesonhumanzonapellucidaglycoprotein-3.ClinDevImmunol,2012,831010)，并开展相关研究，如最早申请并获得授权的基于抗体识别最小基序的HPV58-L1蛋白16/18个表位肽发明专利(徐万祥等.人乳头瘤58型病毒L1蛋白的线性抗原表位最小基序肽及其应用.专利号：CN101962400B；XuWX,etal.MinimalmotifsoflinearB-cellepitopesinL1proteinfromhumanpapillomavirustype58andtheirapplications.PatentNo.:US8,715,681B2)。很显然，基于精细表位肽的优点和应用前景，如同从一个已知序列靶蛋白上发现一段抗原性肽(有时也被误称为表位肽)是一项发明，从一个靶蛋白和/或其一段抗原性肽中鉴定出其中的精细表位肽也是更为重要更具有实际应用价值的发明。

人类乳头状瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)是一组环状DNA病毒的总称。目前发现HPV型别已超过150多种，其中超过40种型别可感染女性生殖道上皮，而与宫颈癌以及宫颈上皮内高度病变发生密切相关的高危型HPV涉及HPV16、18、26、31、33、35、39、45、52、53、56、58、66、67、69、73、82和97等20多种型别。在中国，流行率高的高危型HPV是16，18，52和58型(ShiJF,etal.EpidemiologyandpreventionofhumanpapillomavirusandcervicalcancerinChinaandMongolia.Vaccine,26:M53–M59,2008；JiangZ,etal.Purificationandimmunogenicitystudyofhumanpapillomavirus58virus-likeparticlesexpressedinPichiapastoris.ProteinExprPurif,80:203-210,2011)。

针对严重威胁妇女生殖健康的高危致癌性HPV病毒，作为预防和治疗措施，准确诊断不同高危型HPV感染是关键的第一步。目前的诊断方法可主要分为三大类，即细胞学诊断、HPVDNA鉴定和HPV血清学检测。其中前两者已在临床中应用，后者经济简便是一直在研究的技术，但一直未能用于临床诊断，目前仅用于基础和流行病学研究。究其原因，主要是目前普遍应用的诊断抗原缺乏真正的特异性(尽管从蛋白水平考虑，各HPV型的E6、E7、L1和L1-VLP假病毒蛋白可以被认为是特异的)，以及人体内应答HPV编码蛋白抗体水平低，检测准确率不高。

鉴于以上所说技术发展背景，本领域中急需开发出新型高特异性高灵敏度的重组多表位肽检测抗原。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人乳头瘤病毒(HPV)18型致癌性E6和E7蛋白的抗原表位最小基序肽。

本发明的第一方面，提供了一种人乳头瘤病毒18型E6蛋白的最小表位基序肽，所述最小表位基序肽具有SEQ.IDNo.1所示氨基酸序列，记为HPV18E6-1^6-10；或者具有SEQ.IDNo.2所示氨基酸序列，记为HPV18E6-2^76-81；或者具有SEQ.IDNo.3所示氨基酸序列，记为HPV58E6-3^113-121；或者具有SEQ.IDNo.4所示氨基酸序列，记为HPV58E6-4^133-137；或者具有SEQ.IDNo.5所示氨基酸序列，记为HPV58E6-5^154-158。

本发明的第二方面，提供了一种人乳头瘤病毒18型E7蛋白的最小表位基序肽，所述最小表位基序肽具有SEQ.IDNo.6所示氨基酸序列，记为HPV18E7-1^10-13；或者具有SEQ.IDNo.7所示氨基酸序列，记为HPV18E7-2^20-26；或者具有SEQ.IDNo.8所示氨基酸序列，记为HPV18E7-3^30-35；或者具有SEQ.IDNo.9所示氨基酸序列，记为HPV18E7-4^38-42；或者具有SEQ.IDNo.10所示氨基酸序列，记为HPV18E7-5^46-49；或者具有SEQ.IDNo.11所示氨基酸序列，记为HPV18E7-6^101-105。

本发明的第三方面，提供了一种含如权利要求1所述的最小表位基序肽的短肽，所述短肽：

具有X₁X₂DPTRRX₃所示氨基酸序列，记为HPV18E6-1-1(优选地如SEQ.IDNo.12所示)，其序列中X₁、X₂、和X₃分别独立地为非特定氨基酸残基或者为无；或者

具有X₁RELRHYX₂所示氨基酸序列，记为HPV18E6-2-1(优选地如SEQ.IDNo.13所示)，其序列中X₁、和X₂分别独立地为非特定氨基酸残基或者为无；或者

具有X₁NPAEKLRHLX₂所示氨基酸序列，记为HPV18E6-3-1(优选地如SEQ.IDNo.14所示)，其序列中X₁、和X₂分别独立地为非特定氨基酸残基或者为无；或者

具有X₁X₂HYRGQX₃所示氨基酸序列，记为HPV18E6-4-1(优选地如SEQ.IDNo.15所示)，其序列中X₁、X₂、和X₃分别独立地为非特定氨基酸残基或者为无；或者

具有X₁X₂X₃RETQV所示氨基酸序列，记为HPV18E6-5-1(优选地如SEQ.IDNo.16所示)，其序列中X₁、X₂、和X₃分别独立地为非特定氨基酸残基或者为无。

本发明的第四方面，提供了一种含如本发明第二方面所述的最小表位基序肽的短肽，其特征在于，所述短肽具有：

具有X₁X₂DIVLX₃X₄所示氨基酸序列，记为HPV18E7-1-1(优选地如SEQ.IDNo.17所示)，其序列中X₁、X₂、X₃、和X₄分别独立地为非特定氨基酸残基或者为无；或者

具有X₁EIPVDLLX₂所示氨基酸序列，记为HPV18E7-2-1(优选地如SEQ.IDNo.18所示)，其序列中X₁、和X₂分别独立地为非特定氨基酸残基或者为无；或者

具有X₁QLSDSEX₂所示氨基酸序列，记为HPV18E7-3-1(优选地如SEQ.IDNo.19所示)，其序列中X₁、和X₂分别独立地为非特定氨基酸残基或者为无；或者

具有X₁X₂NDEIDX₃所示氨基酸序列，记为HPV18E7-4-1(优选地如SEQ.IDNo.20所示)，其序列中X₁、X₂、和X₃分别独立地为非特定氨基酸残基或者为无；或者

具有X₁X₂HQHLX₃X₄所示氨基酸序列，记为HPV18E7-5-1(优选地如SEQ.IDNo.21所示)，其序列中X₁、X₂、X₃、和X₄分别独立地为非特定氨基酸残基或者为无；或者

具有X₁X₂X₃CASQQ所示氨基酸序列，记为HPV18E7-6-1(优选地如SEQ.IDNo.22所示)，其序列中X₁、X₂、和X₃分别独立地为非特定氨基酸残基或者为无。

本发明的第五方面，提供了一种人乳头瘤病毒(HPV)18型的抗原表位最小基序肽，所述的基序肽源自乳头瘤病毒18型的E6或E7蛋白，并且所述基序肽的长度≤9个氨基酸，并且所述的基序肽具有与抗HPV18型抗体结合的活性。

在另一优选例中，所述基序肽的长度可以为4、5、6、7、8、9个氨基酸。

在另一优选例中，去除所述基序肽的任一氨基酸后形成的短肽与所述抗体的结合能力显著减弱(优选地，结合能力降低30％以上；更优选地结合能力降低50％以上，最优选地结合能力降低90％以上)或丧失。

在另一优选例中，所述的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体或抗血清。

在另一优选例中，所述基序肽源自E6蛋白，并且所述基序肽选自下组：

DPTRR(SEQIDNO.:1)、RELRHY(SEQIDNO.:2)、NPAEKLRHL(SEQIDNO.:3)、HYRGQ(SEQIDNO.:4)和RETQV(SEQIDNO.:5)。

在另一优选例中，所述基序肽源自E7蛋白，并且所述基序肽选自下组：

DIVL(SEQIDNO.:6)、EIPVDLL(SEQIDNO.:7)、QLSDSE(SEQIDNO.:8)、NDEID(SEQIDNO.:9)、HQHL(SEQIDNO.:10)和CASQQ(SEQIDNO.:11)。

在另一优选例中，所述的E6蛋白包括野生型和突变型的E6蛋白。

在另一优选例中，所述的E7蛋白包括野生型和突变型的E7蛋白。

本发明的第六方面，提供了一种人乳头瘤病毒(HPV)18型的抗原肽，所述抗原肽结构如式I所示：

Ya-Y-Yb式I，

并满足以下特征：

(a)式I中Y为权利要求5所述的基序肽；

(b)式I中Ya、Yb独立地为无、1、2、或3个氨基酸组成的片段，且Y1和Y2氨基酸个数总和≤4；和

(c)所述的抗原肽具有与抗HPV抗体结合的活性；

其中，“-”表示肽键或肽接头。

在另一优选例中，所述抗原肽序列与天然HPV18型E6或E7蛋白的特定序列完全一致(特定序列是指来源于HPV18型E6或E7蛋白的某一截短的片段)。

DPTRR、RELRHY、NPAEKLRHL、HYRGQ和RETQV。

在另一优选例中，所述抗原肽选自下组：

Y₁Y₂DPTRRY₃、Y₁RELRHYY₂、Y₁NPAEKLRHLY₂、Y₁Y₂HYRGQY₃、和Y₁Y₂Y₃RETQV，其中各Y₁、Y₂、和Y₃分别代表一个氨基酸残基。

在另一优选例中，所述抗原肽选自下组：

FEDPTRRP、IRELRHYS、HNPAEKLRHLN、AGHYRGQC、和QRRRETQV。

DIVL、EIPVDLL、QLSDSE、NDEID、HQHL和CASQQ。

在另一优选例中，所述抗原肽选自下组：

Y₁Y₂DIVLY₃Y₄、Y₁EIPVDLLY₂、Y₁QLSDSEY₂、Y₁Y₂NDEIDY₃、Y₁Y₂HQHLY₃Y₄、和Y₁Y₂Y₃CASQQ，其中各Y₁、Y₂、Y₃、和Y₄分别代表一个氨基酸残基。

在另一优选例中，所述抗原肽选自下组：

LQDIVLHL、NEIPVDLLC、EQLSDSEE、EENDEIDG、VNHQHLPA、和CPWCASQQ.

在另一优选例中，所述抗原肽采用化学合成或生物工程方法获得，包括重组蛋白、融合蛋白。

本发明的第七方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白含有本发明第五方面所述的基序肽或者本发明第六方面所述的抗原肽，以及来自于非HPV蛋白的载体序列，以及任选的标签序列。

本发明的第八方面，提供了一种分离的多肽集合，所述的肽集合由选自以下一组或多组的两种以上的多肽构成：

(i)一种或多种选自本发明第五方面所述的基序肽；和/或

(ii)一种或多种选自本发明第六方面所述的抗原肽；和/或

(iii)一种或多种选自本发明第七方面所述的融合蛋白。

本发明的第九方面，提供了本发明第一、五方面所述的基序肽、本发明第六方面所述的抗原肽、本发明第七方面所述的融合蛋白、或本发明第八方面所述的多肽集合的用途，用于制备检测HPV18型E6和/或E7早期蛋白诱发抗体的试剂或试剂盒；或

用于制备预防或治疗HPV18型感染的药物；或

用于制备预防或治疗由HPV18型感染所引起的疾病(如宫颈癌)的药物；或

用于检测抗HPV18型的E6和/或E7蛋白抗体。

在另一优选例中，所述的试剂包括检测片、检测板、蛋白芯片、磁珠。

在另一优选例中，所述抗人乳头瘤病毒抗体为人体液样品中的抗人乳头瘤病毒抗体。优选地，所述体液是血液或唾液。

本发明的第十方面，提供了一种免疫检测试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一、五方面所述的基序肽；和/或本发明第六方面所述的抗原肽；和/或本发明第七方面所述的融合蛋白。所述试剂盒中可以包括一种或多种本发明第一、五方面所述的基序肽、本发明第六方面所述的抗原肽和/或本发明第七方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括载体，用于检测抗人乳头瘤病毒抗体的本发明第一、五方面所述的基序肽；本发明第六方面所述的抗原肽；和/或本发明第七方面所述的融合蛋白包被在所述载体上。

本发明的第十一方面，提供了一种预防或治疗HPV感染或者HPV感染所引起的疾病的方法，向所需的对象施用安全有效量的本发明第一或五方面所述的基序肽、本发明第六方面所述的抗原肽、本发明第七方面所述的融合蛋白、本发明第八方面所述的多肽集合。

在另一优选例中，所述HPV为HPV18型。

本发明的第十二方面，提供了一种检测抗HPV18型抗体的方法，包括步骤：将本发明第五方面所述的基序肽、本发明第六方面所述的抗原肽、和/或本发明第七方面所述的融合蛋白与含有抗HPV18型抗体的样品接触，并检测抗原－抗体复合物的形成。

在另一优选例中，所述检测为非诊断目的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1.HPV18E6蛋白第一轮抗原性肽作图的免疫印迹鉴定

注：抗原为跨越全长HPV18E6蛋白序列相互重叠9个残基的一组16聚肽(编号：E6/P1-P19，对应于泳道1-19)，一抗是1:3000稀释的兔抗重组E6蛋白抗血清。用免疫前兔对照血清未产生任一反应性条带(结果未显示)。箭头分别指示免疫印迹反应性16肽(融合蛋白)。

图2HPV18E7蛋白第一轮抗原性肽作图的免疫印迹鉴定

注：抗原为跨越全长HPV18E7蛋白序列相互重叠9个残基的一组16聚肽(编号：E7/P1-P12，对应于泳道1-12)，一抗是1:3000稀释的兔抗重组E7蛋白抗血清。用免疫前兔对照血清未产生任一反应性条带(结果未显示)。箭头分别指示免疫印迹反应性16聚肽(融合蛋白)。

图3.HPV18E6-1表位肽的免疫印迹鉴定

A，衍生自E6蛋白的反应性16聚肽相互重叠7个残基的一组8聚肽(E6/P20-P28)免疫印迹鉴定；B，依据反应性8肽中共有残基序列的表位最小基序分析。箭头分别指示与兔抗重组E6蛋白抗血清产生的印迹反应性条带，阴影表示反应性肽中的共同肽序列(最小基序肽)，图A中从左至右的泳道与图B中从上至下的肽段相对应。

图4.HPV18E6-2表位肽的免疫印迹鉴定

A，覆盖全长E6/P10反应性16聚肽相互重叠7个残基的一组8聚肽(E6/P29-P37)免疫印迹鉴定；B，依据反应性8肽中共有残基序列的表位最小基序分析。箭头分别指示与兔抗重组E6蛋白抗血清产生的印迹反应性条带，阴影表示反应性肽中的共同肽序列(最小基序肽)，图A中从左至右的泳道与图B中从上至下的肽段相对应。

图5.HPV18E6-3表位肽的免疫印迹鉴定

A，衍生自E6蛋白的反应性16聚肽相互重叠9个残基的一组10聚肽(E6/P62-P69)免疫印迹鉴定；B，依据反应性10肽中共有残基序列的表位最小基序分析。箭头分别指示与兔抗重组E6蛋白抗血清产生的印迹反应性条带，阴影表示反应性肽中的共同肽序列(最小基序肽)，图A中从左至右的泳道与图B中从上至下的肽段相对应。

图6.HPV18E6-4表位肽的免疫印迹鉴定

A，衍生自E6蛋白的反应性16聚肽相互重叠7个残基的一组8聚肽(仅显示最后的E6/P78-P84)免疫印迹鉴定，包括使用了从反应性P23的N端起逐一删除1个残基的短肽(E6/P78-P84)；B，依据反应性8肽中共有残基序列的表位最小基序分析。箭头分别指示与兔抗重组E6蛋白抗血清产生的印迹反应性条带，阴影表示反应性肽中的共同肽序列(最小基序肽)，图A中从左至右的泳道与图B中从上至下的肽段相对应。

图7.HPV18E6-5表位肽的免疫印迹鉴定

A，覆盖全长E6/P19反应性14聚肽相互重叠7个残基的一组8聚肽(E6/P89-P96)免疫印迹鉴定；B，依据反应性8肽中共有残基序列的表位最小基序分析。箭头分别指示与兔抗重组E6蛋白抗血清产生的印迹反应性条带，阴影表示反应性肽中的共同肽序列(最小基序肽)，图A中从左至右的泳道与图B中从上至下的肽段相对应。

图8.HPV18E7-1表位肽的免疫印迹鉴定

A，衍生自E7蛋白的反应性16聚肽相互重叠7个残基的一组8聚肽(E7/P13-P22)免疫印迹鉴定；B，依据反应性8肽中共有残基序列的表位最小基序分析。箭头分别指示与兔抗重组E6蛋白抗血清产生的印迹反应性条带，阴影表示反应性肽中的共同肽序列(最小基序肽)，图A中从左至右的泳道与图B中从上至下的肽段相对应。

图9HPV18E7-2表位肽的免疫印迹鉴定

A，覆盖全长E7/P3反应性16聚肽相互重叠7个残基的一组8聚肽(E7/P29-P37)免疫印迹鉴定；B，依据反应性8肽中共有残基序列的表位最小基序分析。箭头分别指示与兔抗重组E7蛋白抗血清产生的印迹反应性条带，阴影表示反应性肽中的共同肽序列(最小基序肽)，图A中从左至右的泳道与图B中从上至下的肽段相对应。

图10HPV18E7-3表位肽的免疫印迹鉴定

A，衍生自E7蛋白的反应性16聚肽相互重叠7个残基的一组8聚肽(E7/P38-P44)免疫印迹鉴定；B，依据反应性8肽中共有残基序列的表位最小基序分析。箭头分别指示与兔抗重组E7蛋白抗血清产生的印迹反应性条带，阴影表示反应性肽中的共同肽序列(最小基序肽)，图A中从左至右的泳道与图B中从上至下的肽段相对应。

图11HPV18E7-4表位肽的免疫印迹鉴定

A，覆盖全长E7/P5反应性16聚肽相互重叠7个残基的一组8聚肽(E7/P45-P53)免疫印迹鉴定；B，依据反应性8肽中共有残基序列的表位最小基序分析。箭头分别指示与兔抗重组E7蛋白抗血清产生的印迹反应性条带，阴影表示反应性肽中的共同肽序列(最小基序肽)，图A中从左至右的泳道与图B中从上至下的肽段相对应。

图12HPV18E7-5表位肽的免疫印迹鉴定

A，衍生自E7蛋白的反应性16聚肽相互重叠7个残基的一组8聚肽(E7/P54-P61)免疫印迹鉴定；B，依据反应性8肽中共有残基序列的表位最小基序分析。箭头分别指示与兔抗重组E7蛋白抗血清产生的印迹反应性条带，阴影表示反应性肽中的共同肽序列(最小基序肽)，图A中从左至右的泳道与图B中从上至下的肽段相对应。

图13HPV18E7-6表位肽的免疫印迹鉴定

A，衍生自E7蛋白的反应性多肽相互重叠7个残基的一组8聚肽(E7/P67-P75)免疫印迹鉴定；B，依据反应性8肽中共有残基序列的表位最小基序分析。箭头分别指示与兔抗重组E7蛋白抗血清产生的印迹反应性条带，阴影表示反应性肽中的共同肽序列(最小基序肽)，图A中从左至右的泳道与图B中从上至下的肽段相对应。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一类人乳头瘤病毒(HPV)18型致癌性E6和E7蛋白的抗原表位最小基序肽，其可特异性地与抗HPV18型E6或E7蛋白抗体进行结合。在此基础上完成了本发明。

HPV18

人乳头瘤病毒(HPV)18型是一种高致癌性的病毒，其在宿主细胞中表达的E6、E7蛋白为致癌性蛋白。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述HPV18E6蛋白的氨基酸序列如下：

MARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAACHKCIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQV(158aa)(SEQIDNO.:12)。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述HPV18E7蛋白的氨基酸序列如下：MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ(105aa)(SEQIDNO.:13)。

线性B细胞表位

一般而言，绝大多数蛋白都具有抗原性，即在哺乳动物体内诱发针对特异抗原的线性(非构象型)B细胞表位和构象型表位抗体，或诱发辅助性T细胞或细胞毒性T细胞分泌特定的细胞因子应答。相对检测抗原和抗体有效疫苗研制用途，目前研究最多的是用化学合成肽法和噬菌体展示文库等技术鉴定靶蛋白中氨基酸序列连续的线性表位。

基序肽

在本案发明人建立“改良生物合成肽法”(XuWX,etal.Minimalmotifmappingofaknownepitopeonhumanzonapellucidaprotein-1usingpeptidebiosynthesisstrategy.JReprodImmunol,2009；81:9–16；XuWX,etal.XuWan-xiang,HeYaping,WangJian,TangHai-ping,ShiHui-juan,SunXiao-xi,JiChao-neng,GuShao-huaandYiXie,MappingofminimalmotifsofB-cellepitopesonhumanzonapellucidaglycopotein-3.ClinDevImmunol,2012；2012:831010.)之前，无法用抗重组蛋白多抗鉴定小于或等于9个残基多肽的抗体识别表位最小基序(抗原表位最小基序肽)，因此，严格地说，未经过表位最小基序鉴定的肽不能称为表位或表位肽，只能称之为“抗原性肽”。换言之，在靶蛋白表位扫描作图鉴定中，只有经过表位最小基序鉴定的肽序列，才能称作“表位”、“表位肽”或“表位最小基序肽”。

在本发明中，“本发明表位肽”、“本发明基序肽”、“本发明表位最小基序肽”可互换使用，指源自乳头瘤病毒的致癌性E6或E7蛋白，并且所述基序肽的长度≤9个氨基酸，并且具有与抗HPV抗体结合的活性的抗原表位基序肽的统称。

在本发明中优选的基序肽分别如表2、4中所示。

抗原肽

术语“抗原肽”、“本发明多肽”可互换使用指包含本发明基序肽的具有与抗HPV抗体结合的活性的多肽。应理解，所述术语还包括本发明多肽的衍生物，指本发明多肽在经过1-3个氨基酸添加、1-2个缺失并仍含有所述基序肽的序列，且具有与抗人HPV抗体结合活性的多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多肽是没有分离纯化的，但同样的多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的肽”是指本发明多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它抗原性肽(未经过表位最小基序鉴定)物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化本发明多肽。基本上纯化的多肽(融合蛋白)在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。在本发明中，本发明多肽包括符合式I结构式的短肽或含有核心序列X的多肽。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。

一旦鉴定获得了相关的肽序列，就可以用重组法来大批量地获得相关肽序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到相关肽(融合蛋白)。

此外，还可用化学方法直接合成相关肽序列。

本发明的优选的抗原肽如表3、5所示。

应用

本发明多肽除了可用于HPV感染的诊断外，还可用作制备预防或治疗HPV感染或HPV感染相关疾病的药物组合物或疫苗组合物。

本发明涉及定性和定量检测抗HPVE6/E7蛋白抗体水平诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。

检测样品中是否存在抗HPVE6/E7蛋白抗体的方法可利用本发明多肽与样品中抗HPVE6/E7蛋白抗体特异性结合的原理进行检测，它包括：通过样品与本发明多肽或其融合表达蛋白的抗原抗体反应，观察检测样品OD值是否大于对照二倍，或者观察是否形成抗体复合物(印迹条带)，或通过肽芯片法观察荧光显色抗原抗体反应，OD值高、形成印迹条带或荧光显色就表示样品中存在抗HPVE6/E7蛋白抗体或某一表位的抗体。

可以将本发明表位肽固定点样在蛋白质芯片上从而形成试剂或试剂盒，用于检测样品中的抗HPVE6/E7蛋白抗体。

此外，可将本发明多肽(化学合成肽，或与载体蛋白偶联的融合蛋白，或通过构建重组多表位肽抗原)，点样于检测板或检测试纸条。在检测时，使待测样品与本发明多肽发生免疫反应，从而诊断待测样品中是否存在HPVE6/E7蛋白抗体和/或存在哪些HPVE6/E7蛋白表位的抗体。

在本发明中，检测板可采用本领域常用的检测板材料，采用常规的检测板制备方法制成。代表性的免疫检测板包括测试条和支撑测试条的支撑板，如可采用PVC聚脂胶板等；所述的测试条由滤纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成，搭接部位可以采用常规的方法，如胶带等固定连接；其中：层析材料预包被胶体金或有色标记的本发明多肽或肽集合，优选地与偶联有载体蛋白的本发明的肽集合，且层析材料预包被有胶体金，硝酸纤维素膜上吸附检测线和质控线。

本发明还提供了一种可用作HPV疫苗的疫苗组合物，该疫苗(组合物)可用于实现抗肿瘤(HPV阳性肿瘤，如宫颈癌)疫苗研制。通常，该疫苗含有：(i)本发明多肽作为免疫活性成分，以及(ii)药学上或免疫学上可接受的载体。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

在本发明中，这些疫苗包含免疫性抗原(包括本发明多肽或其衍生物)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体的例子包括(但并不限于)蛋白质、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。

在本发明中，疫苗可用常规方式施用于需要的对象。

本发明主要内容在于用生物合成肽技术和兔多抗揭示HPV18E6和E7早期蛋白的全部线性BCEs，尽管早先已有相似的两个蛋白的表位扫描作图研究，但获得的都是抗原性肽(BleulC,etal.Humanpapillomavirustype18E6andE7antibodiesinhumansera:increasedanti-E7prevalenceincervicalcancerpatients.JClinMicrobiol,29:1579-1588,1991)而不是抗原表位最小基序肽。

本发明涉及与妇女宫颈癌发生密切相关的高危型人乳头瘤病毒(HPV)18型E6和E7致癌蛋白的全部线性B细胞表位(Bcellepitope,BCE,或称抗原决定簇)及其最小基序肽。本发明进一步涉及所述的HPV18型E6和E7蛋白十一个抗原表位最小基序和扩展的8-11肽可作为制备宫颈癌治疗性包括以细胞毒性T细胞表位为主的多价HPV疫苗的候选表位肽，以及它们单独或组合用作HPV18型病毒感染的ELISA和/或芯片法等方法的化学合成肽型特异性感染检测抗原，或通过单独或组合的重组抗原用于蛋白免疫印迹检测。

本发明的目的在于提供人乳头瘤病毒(HPV)18型E6和E7蛋白上申请人第一次鉴定的11个BCE肽，以及它们可化学合成或与GST载体蛋白融合表达的含各BCE最小基序8肽或长于8肽抗原。前者可单个或组合用作设计研制治疗性HPV多表位疫苗的抗原肽，后者8肽或其融合蛋白可用于普查正常妇女或子宫颈癌患者血清中是否存在抗HPV18E6和E7抗体的检测抗原。

本发明的内容进一步具体描述如下：

1、依据HPV18原型病毒基因组序列(GenBankNo.:X05015.1)，由上海捷瑞生物工程有限公司化学合成编码全长E6(158aa)和E7(105aa)蛋白基因(经DNA测序确证基因序列无误)，用常规分子克隆技术分别将它们分别重组插入pBV221和pRSET-A原核表达质粒。在热诱导表达E6和用IPTG诱导E7蛋白后，通过SDS-PAGE电泳分析和使用它们的特异性单抗的蛋白免疫印迹试验确认重组E6和E7蛋白高表达。进而使用电泳割胶回收方法(邹永水，徐万祥等.重组人绒毛膜促性腺激素嵌合肽12的聚丙烯酰胺凝胶电泳制备.生物化学与生物物理学报,34:671-674,2002)，分别从热诱导表达宿主菌总蛋白中纯化重组E6和E7蛋白。最后，分别主动免疫4只新西兰白兔，加强二次免疫后获得用于它们线性表位扫描作图的兔抗HPV18E6和E7蛋白抗血清。

2、本申请中使用申请人在先构建的专门用于抗原表位扫描作图的短肽生物合成的pXXGST-1融合表达载体(Xuetal.Minimalmotifmappingofaknownepitopeonhumanzonapellucidaprotein-4usingapeptidebiosynthesisstrategy.JReprodImmunol,81:9-16,2009)。首先运用DNA重组技术(经化学合成编码DNA正负链片段，退火重组插入表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌，重组克隆测序验证插入片段DNA序列，以及热诱导表达目的GST188-16聚肽融合蛋白等步骤)，表达了跨越全长E6和E7蛋白序列相互重叠9个氨基酸残基的系列16聚肽融合蛋白。然后将表达的E6/P1-P19和E7/P1-P12短肽融合蛋白和电转移到0.22μm硝酸纤维素膜上，分别用兔抗重组E6和E7蛋白多抗进行表位扫描作图。结果在分别鉴定出九个(图1中的P1-2、P9-11、P15-17和P19)和七个(图2中的P1-P6和P12)印迹反应阳性16聚肽(融合蛋白)。

3、进一步构建表达了以GST188为载体的跨越E6和E7蛋白上印迹反应性16聚的相互重叠7个残基的系列融合表达8肽(E6/P20～P96，E7/P13～P75)，继而用兔抗E6和E7多抗鉴定第一轮抗原性肽扫描作图显示的全部反应性肽中可能存在的表位及其抗体识别最小基序。

结果根据各表位肽印迹反应阳性的8肽之间共同的氨基酸序列，在E6蛋白上确定了五个表位肽，它们分别是存在于反应性P1和P2、P9和P10以及P16和P17重叠区、P15和P19的最小基序表位肽DPTRR^6-10、RELRHY^76-81、NPAEKLRHL^113-121、HYRGQ^133-137和RETQV^154-158；在E7蛋白上确定了六个表位肽，它们是DIVL^10-13、EIPVDLL^20-26、QLSDSE^30-35、NDEID^38-42、HQHL^46-49和CASQQ^101-105

以上HPV18型E6和E7蛋白的11个最小基序BCE肽的鉴定，为今后设计研制治疗性HPV多表位肽疫苗(以诱发细胞免疫的T细胞表位为主)奠定了基础。这些E6和E7最小基序表位肽和它们扩展肽(衍生肽)的另一重要用途是，它们或单独或组合被化学合成，或者与GST融合表达，可用作开发检测HPV18型病毒感染后产生抗体的ELISA、肽芯片法和蛋白免疫印迹法的检测用抗原，有助于建立能应用于临床诊断的HPV感染血清学检测方法。

本发明的主要优点在于：

(1)首次揭示了HPV18型蛋白的一组抗原表位最小基序肽，其可特异性地与抗HPV18型抗体进行结合；

(2)本发明的多肽可组合应用于鉴定样品(尤其是血清样品)，因为检测的是暴露在HPV18型E6蛋白表面多个表位的多种抗体(非通常用一个抗原性肽检测一种抗体)，从而诊断HPV18感染或HPV18感染引起的疾病(宫颈癌等)；由于单个表位肽抗原是高度特异性的，且可组合应用，因此可提高检测的灵敏度(提高检测血清样本的稀释度)和特异性。

(3)本发明表位最小基序肽还可用于制备抗HPV感染的疫苗组合物，任一基序肽都使可能存在的N个潜在表位数降低到最小，因而最大限度地排除了可能是人体内其他组织蛋白表位，或非HPV18型E6蛋白特异表位，因而本发明多肽的应用可避免引发针对非HPV蛋白的非特异性免疫反应，更具安全和有效性。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件以及[美]J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔编著黄培堂等翻译的第三版“分子克隆：实验室手册”(科学出版社，2002)和[美]E.哈洛和D.莱恩编著沈关心等翻译的“抗体技术实验指南”(科学出版社，2002)中所述的步骤，或按照生产销售商建议的条件进行。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1：人乳头瘤病毒18型(HPV18)E6和E7蛋白第一轮抗原性肽线性作图

材料和方法：

1.HPV18E6和E7蛋白编码基因根据原型HPV18基因组序列(GenBankNo.:X05015.1)，由上海捷瑞生物工程有限公司化学合成。原核表达质粒pBV221购自优宝(Youbio)生物技术有限公司，pRSETC质粒购自美国Invitrogen公司。热诱导表达质粒pXXGST-1和pXXGST-2由本专利发明人构建(专利号：ZL200710173305.2)。大肠杆菌BL21(DE3)菌株购自北京康为世纪生物科技有限公司。

2.限制性内切酶EcoRI、BamHI、SalI、Taq酶和T4DNA连接酶购自日本TaKaRaBiotechnology公司，预染蛋白分子量标准、辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗(IgG/HRP)、二氨基联苯胺(DAB)和0.2μm硝酸纤维素膜购自上海生工生物技术服务公司。6×His单抗购自上海睿星生物技术有限公司。

3.QIAprepspinminiprepKit质粒抽提试剂盒、QIAquickPCR产物纯化试剂盒和quick凝胶回收试剂盒购自德国QIAGEN公司。

4.新西兰白兔购自上海BK实验动物有限公司。EcoRI和SalI以及BAMHI和EcoRI

5.两端分别为BamHI和SalI粘性末端，中间为各8/16肽编码DNA序列加TAA终止密码子的正负链DNA片段由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

6.抗HPV18E6和E7蛋白抗血清制备参照文献方法(宋力雯等.人卵透明带蛋白ZP3a和ZP3b肽段的免疫原性及其抗血清体外抑制人精子-半透明带结合.生理学报，57：682-688,2005)。制备过程摘要如下：1)通过热诱导或IPTG诱导方式表达重组HPV18E6和E7蛋白；2)用制备胶电泳方法分别纯化两个目的蛋白；3)用纯化的重组E6和E7蛋白作为免疫原，经弗氏佐剂乳化后分别主动免疫4只雄性新西兰白兔；4)加强免疫二次后抽取血清，储存-20℃冰箱备用。

HPV18E6和E7蛋白第一轮抗原性肽作图的具体步骤如下：

1.依据HPV18型E6和E7基因序列公开信息，设计跨越全长E6蛋白(aa1－158)和E7蛋白(aa1-105)序列相互重叠9个氨基酸残基的系列16肽编码DNA正负链片段(正链5’-端加5’-gatcc,3’-端加taag-3’；负链5’-端加5’-tcgactta，3’-端加g-3’)，合成DNA片段。

2.将1或2个OD的互补正负链片段用ddH₂O溶解成20μmol/μl储存液(根据DNA合成报告单数据)；各取10μl储存液和20ddH₂O于1.5mlEppendorf管中，94℃水浴加热5min,自然降至室温后，在15μl反应体积中吸入2μl退火片段、1μl约200ng/μl经BamHI和SalI双酶切的pXXGST-1质粒、1μlT4DNA连接酶和其1.5μl缓冲液，连接过夜；连接液转化感受态BL21(DE3)宿主菌，涂布含Amp的LB平板上，于37℃培养过夜；第二天挑取氨苄LB平板上长出的单克隆转接3mlLB培养液诱导表达，以由pXXGST-2表达的GST188蛋白为对照，各表达的GST188-16肽(E6/P1-P19和E7/P1-P12)融合蛋白经15％SDS-PAGE分析确认(与对照蛋白电泳迁移率相差约2kDa)，挑取各重组克隆外送进行DNA测序；

3.将插入片段测序结果正确的E6克隆接种加入Amp的3mlLB培养液中，于30℃振荡培养过夜，翌日晨按1/50比例转接新鲜含Amp的LB培养液中，30℃振荡培养2-3h至菌体浓度达到0.6-0.8OD后，调高温度至42℃热诱导4h，离心收集菌体，加上样裂解液煮沸5min备用；关于E7克隆的表达，则在37℃培养过夜，翌日晨按1/50比例转接新鲜含Amp的LB培养液中，37℃振荡培养后加IPTG诱导4h。

4.将诱导的细菌总蛋白样品同时走15％SDS-PAGE，电泳结束后，一块凝胶用考马斯亮蓝染色，二块凝胶进行硝酸纤维素膜电(100mA)转移2h，用丽春红染膜2min，在目的短肽融合蛋白条带处用针头打孔标记，用水冲洗掉丽春红染色；

5.印迹膜用PBS缓冲液反复洗涤四次，用5％脱脂奶粉封闭过夜，PBS缓冲液洗涤四次，分别在8-10ml反应液中加入30μl一抗兔抗重组E6血清或正兔血清，室温反应2h，PBS缓冲液洗涤后加入5μl二抗羊抗兔IgG/HRP(1:10000稀释)，室温反应1h，用PBS缓冲液洗涤后用ECL化学发光试剂盒显色(图1和图2)。

6.依据用抗E6和抗E7抗血清的印迹结果(图1和图2)，确定HPV18型E6和E7蛋白上分别存在九个(E6/P1-P2、P9-P11、P15-P17和P19)和七个(E7/P1-P6和P12)反应性16聚肽。

实施例2：HPV18E6蛋白第二轮两个代表性表位最小基序鉴定

材料和方法：

见实施例1相应部分。

E6-2和E6-5表位最小基序鉴定的具体步骤如下：

1.依据实施例1中第一轮E6蛋白16聚抗原性肽作图结果，以P1和P19反应性肽为例进行它们的抗体识别最小基序鉴定。设计跨越P1和P19全长序列相互重叠7个氨基酸残基的系列8肽编码DNA正负链片段(正链5’-端加5’-gatcc,3’-端加taag-3’；负链5’-端加5’-tcgactta，3’-端加g-3’)，合成DNA片段。

2-4操作步骤同实施例1中的2-4步骤。

5.印迹膜用PBS缓冲液反复洗涤四次，用5％脱脂奶粉封闭过夜，PBS缓冲液洗涤四次，分别在8-10ml反应液中加入30μl一抗兔抗人重组E6血清(1:3000稀释)，室温反应2h，PBS缓冲液洗涤后加入5μl二抗羊抗人IgG/HRP(1:10000稀释)，室温反应1h，用PBS缓冲液洗涤后进行ECL化学发光显色(图3A和图4A)。

6.依据它们中连续3个(图4A中Lanes2-4，E6/P30-P32)和4个(图7A中Lanes3-6，E6/P91-P94)印迹阳性片段共有残基序列(图4B和图7B)，确定两个表位最小基序分别为RELRHY和RETQV。

基于上述方法，鉴定出的HPV18E6蛋白的抗原表位最小基序肽如下表所示。

表2HPV18E6蛋白的抗原表位最小基序肽

SEQ ID NO.:	氨基酸序列
		1	DPTRR
2	RELRHY
		3	NPAEKLRHL
4	HYRGQ
		5	RETQV

实验过程中鉴定出的具有良好的抗体结合能力的源自HPV18E6蛋白的抗原肽如下表所示。

表3HPV18E6蛋白的抗原肽

SEQ ID NO.:	氨基酸序列
		14	RFEDPTRR
15	FEDPTRR
		16	EDPTRR
17	DPTRRPYK
		18	RYRELRHY
19	IRELRHY
		20	RELRHYSD
21	HNPAEKLRHL
		22	NPAEKLRHLN
23	IAGHYRGQ
		24	AGHYRGQ
25	GHYRGQ
		26	HYRGQCHS
27	QRRRETQV
		28	RRRETQV
29	RRETQV

实施例3：HPV18E7蛋白第二轮两个代表性表位最小基序鉴定

材料和方法：

见实施例1相应部分。

E7-2和E7-4表位最小基序鉴定的具体步骤如下：

1.依据实施例1中第一轮E7蛋白16聚抗原性肽作图结果，以P3和P5反应性肽为例进行它们的抗体识别最小基序鉴定。设计跨越P3和P5全长序列相互重叠7个氨基酸残基的系列8肽编码DNA正负链片段(正链5’-端加5’-gatcc,3’-端加taag-3’；负链5’-端加5’-tcgactta，3’-端加g-3’)，合成DNA片段。

2-4操作步骤同实施例1中的2-4步骤。

5.印迹膜用PBS缓冲液反复洗涤四次，用5％脱脂奶粉封闭过夜，PBS缓冲液洗涤四次，分别在8～10ml反应液中加入30μl一抗兔抗人重组E6血清(1:3000稀释)，室温反应2h，PBS缓冲液洗涤后加入5μl二抗羊抗人IgG/HRP(1:2000稀释)，室温反应1h，用PBS缓冲液洗涤后进行ECL化学发光显色(图9A和图11A)。

6.依据它们中连续2个(图5A中Lanes3-4，E7/P31-P32)和4个(图6A中Lanes3-6，E6/P47-P50)印迹阳性片段共有残基序列(图9B和图11B)，确定两个表位最小基序分别为EIPVDLL和NDEID。

基于上述方法，鉴定出的HPV18E7蛋白的抗原表位最小基序肽如下表所示。

表4HPV18E7蛋白的抗原表位最小基序肽

SEQ ID NO.:	氨基酸序列
		6	DIVL
7	EIPVDLL
		8	QLSDSE
9	NDEID
		10	HQHL
11	CASQQ

实验过程中鉴定出的具有良好的抗体结合能力的源自HPV18E7蛋白的抗原肽如下表所示。

表5HPV18E7蛋白的抗原肽

SEQ ID NO.:	氨基酸序列
		30	ATLQDIVL
31	TLQDIVLH
		32	LQDIVLHL
33	QDIVLHLE
		34	DIVLHLEP
35	NEIPVDLL
		36	EIPVDLLC
37	HEQLSDSE
		38	EQLSDSE
39	QLSDSEEE
		40	EEENDEID
41	EENDEIDG
		42	ENDEIDGV
43	NDEIDGVN
		44	DGVNHQHL
45	GVNHQHLP
		46	VNHQHLPA
47	NHQHLPAR
		48	HQHLPARR

49	CPWCASQQ
		50	PWCASQQ
51	WCASQQ

尽管本发明描述了HPV18致癌性E6和E7蛋白上共11个抗原表位最小基序肽，以及可单独和/或组合用含最小基序的多肽(如8肽)或多肽融合蛋白研制治疗性HPV多表位疫苗，或可单独和/或组合用作临床检测人HPV18型感染的抗原(可以化学合成或融合表达这些抗原)，但是在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明的表位肽基序和扩展的含最小基序的多肽融合蛋白作各种显而易见的变化，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims

1.一种人乳头瘤病毒18型E6蛋白的表位最小基序肽，其特征在于，所述最小表位基序肽具有SEQ.IDNo.1所示氨基酸序列，记为HPV18E6-1^6-10；或者具有SEQ.IDNo.2所示氨基酸序列，记为HPV18E6-2^76-81；或者具有SEQ.IDNo.3所示氨基酸序列，记为HPV58E6-3^113-121；或者具有SEQ.IDNo.4所示氨基酸序列，记为HPV58E6-4^133-137；或者具有SEQ.IDNo.5所示氨基酸序列，记为HPV58E6-5^154-158。

2.一种人乳头瘤病毒18型E7蛋白的表位最小基序肽，其特征在于，所述最小表位基序肽具有SEQ.IDNo.6所示氨基酸序列，记为HPV18E7-1^10-13；或者具有SEQ.IDNo.7所示氨基酸序列，记为HPV18E7-2^20-26；或者具有SEQ.IDNo.8所示氨基酸序列，记为HPV18E7-3^30-35；或者具有SEQ.IDNo.9所示氨基酸序列，记为HPV18E7-4^38-42；或者具有SEQ.IDNo.10所示氨基酸序列，记为HPV18E7-5^46-49；或者具有SEQ.IDNo.11所示氨基酸序列，记为HPV18E7-6^101-105。

3.一种含如权利要求1所述的表位最小基序肽的多肽，其特征在于，所述多肽：

4.一种含如权利要求2所述的表位最小基序肽的多肽，其特征在于，所述多肽具有：

5.一种人乳头瘤病毒(HPV)18型的抗原表位最小基序肽，所述的基序肽源自乳头瘤病毒18型的E6或E7蛋白，并且所述基序肽的长度≤9个氨基酸，并且所述的基序肽具有与抗HPV18型抗体结合的活性；优选地，所述基序肽选自下组：

DPTRR(SEQIDNO.:1)、RELRHY(SEQIDNO.:2)、NPAEKLRHL(SEQIDNO.:3)、HYRGQ(SEQIDNO.:4)、RETQV(SEQIDNO.:5)、DIVL(SEQIDNO.:6)、EIPVDLL(SEQIDNO.:7)、QLSDSE(SEQIDNO.:8)、NDEID(SEQIDNO.:9)、HQHL(SEQIDNO.:10)和CASQQ(SEQIDNO.:11)。

6.一种人乳头瘤病毒(HPV)18型的抗原肽，其特征在于，所述抗原肽结构如式I所示：

Ya-Y-Yb式I，

并满足以下特征：

(a)式I中Y为权利要求5所述的基序肽；

(c)所述的抗原肽具有与抗HPV抗体结合的活性；

其中，“-”表示肽键或肽接头；优选地，所述抗原肽选自下组：

Y₁Y₂DPTRRY₃、Y₁RELRHYY₂、Y₁NPAEKLRHLY₂、Y₁Y₂HYRGQY₃、Y₁Y₂Y₃RETQV、

7.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白含有权利要求5所述的基序肽或者权利要求6所述的抗原肽，以及来自于非HPV蛋白的载体序列，以及任选的标签序列。

8.一种组合物，其特征在于，它含有：

(a)选自下组的一种或多种肽片段：

权利要求1、2或5所述的基序肽、权利要求3、4所述的多肽、权利要求6所述的抗原肽和权利要求7所述的融合蛋白；和

(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

9.一种分离的多肽集合，其特征在于，所述的多肽集合由选自以下一组或多组的两种以上的多肽构成：

(i)一种或多种选自权利要求5所述的基序肽；和/或

(ii)一种或多种选自权利要求6所述的抗原肽；和/或

(iii)一种或多种选自权利要求7所述的融合蛋白。

10.权利要求1、2或5所述的基序肽、权利要求3、4所述的多肽、权利要求6所述的抗原肽、权利要求7所述的融合蛋白、权利要求8所述的组合物、或权利要求9所述的多肽集合的用途，其特征在于，用于制备检测HPV18型E6和/或E7早期蛋白诱发抗体的试剂或试剂盒；或

用于制备预防或治疗HPV18型感染的药物；或

用于制备预防或治疗由HPV18型感染所引起的疾病的药物；或

用于检测抗HPV18型的E6和/或E7蛋白抗体。