CN105734127A - miR-21-3p在制备用于检测早期急性肾损伤的试剂中的用途 - Google Patents

miR-21-3p在制备用于检测早期急性肾损伤的试剂中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了miR?21?3p在制备用于检测早期急性肾损伤的试剂中的用途，其中急性肾损伤由马兜铃酸类中药所致，通过中药马兜铃酸A经腹腔注射大鼠建立急性肾损伤模型发现，在急性肾损伤的早期阶段，miR?21?3p在肾脏、血浆中表达上调，且在其他脏器中表达不明显。本发明提供了一种可检测早期马兜铃酸类中药急性肾损伤的生物标志物，为急性肾损伤的早期诊断和临床医学提供了一种新方案，具有划时代的进步和意义。

Description

miR-21-3p在制备用于检测早期急性肾损伤的试剂中的用途
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别涉及马兜铃酸类中药致急性肾损伤的早期检测的生物标记物，更具体涉及miR-21-3p在制备用于检测早期急性肾损伤的试剂中的用途。
背景技术
目前，急性肾损伤(AKI)仍然是诊断及治疗的极大难题，当血液及尿液生化指标尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)等变化明显时，肾脏的损伤已经很严重，很难恢复了，因此，寻找新的生物标志物来尽早检测AKI已经成为亟待解决的问题。
中药是我国传统医学的宝贵财富，一直以来都以其较好的临床疗效和较少的副作用而受到人们的亲睐，在世界范围内也得到了广泛的应用。但无法避免的是，中药存在一定的毒性，马兜铃酸的肾毒性就是其中之一，但是当常规的肾毒性检测指标(如Scr、BUN等指标)出现异常时，肾脏已经受到了较严重的损伤，因此筛选中药早期肾毒性生物指标监测肾毒性已成为亟待解决的问题。
发明内容
为克服现有技术中的上述问题，本发明提供了一种miR-21-3p在制备用于检测早期急性肾损伤的试剂中的用途，提供了一种马兜铃酸类中药早期急性肾损伤的生物标志物，为临床医学和生物医药发展提供了一种新方案。
本发明采用了以下的技术方案：
miR-21-3p在制备用于检测早期急性肾损伤的试剂中的用途，其中急性肾损伤由含马兜铃酸的中药所致。
优选地，马兜铃酸为马兜铃酸A。
进一步地，早期急性肾损伤后，miR-21-3p在肾脏、血浆中表达上调。
进一步地，含马兜铃酸的中药引起急性肾损伤的给药途径为腹腔注射或口服。
进一步地，检测包括以下步骤：
(1)检测血浆中miR-21-3p的表达；
(2)基于步骤(1)中的检测结果判断急性肾损伤的发病可能性。
优选地，在步骤(1)中，采用染料法实时荧光定量PCR检测血浆中miR-21-3p的表达。
其中，miR-21-3p的核苷酸序列为：GACAGCCCATCGACT。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种miR-21-3p在制备用于检测早期急性肾损伤的试剂中的用途，即，提供了一种可检测早期急性肾损伤的生物标志物miR-21-3p。本发明可方便、准确地检测出早期急性肾损伤，为临床医学提供了一种新方案，具有良好而广泛的应用前景。在本发明中，选用研究公认的具有肾毒性的含马兜铃酸的中药，更具体地，马兜铃酸A，从microRNA的角度筛选出肾毒性早期生物标志物，建立了中药肾毒性的可靠的早期生物学监测指标，同时可预期地应用到其他类型急性肾损伤中，大大方便了急性肾损伤的早期诊断，可尽早地对患者进行确诊并调整治疗方案，因而本发明在急性肾损伤的检测和临床医学方面迈出了划时代的一步，具有广泛而良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1的大鼠给药后随时间的体重变化图。
图2为实施例1的大鼠的肾脏病理组织学图片。
图3为实施例1的染料法实时定量PCR检测的大鼠肾脏中miR-21-3P的表达图。
图4为实施例1中大鼠血浆中miR-21-3P的表达图。
图5为实施例1中40mg/kg剂量组大鼠给药第二天后miR-21-3P在不同组织中的表达图。
图6为实施例2的大鼠的血浆中miR-21-3P的表达图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
马兜铃酸A经腹腔注射给予雄性Wistar大鼠6天，建立马兜铃酸A致急性肾损伤的模型。
实验过程：对4-5周龄，体重约80-100g的雄性Wistar大鼠给药，首次给药前至少适应3天，根据适应期动物的健康状况和体重选自适宜的大鼠，按照体重均衡性原则随机分成4组。每天给药1次，连续给药6天，其中给药的溶媒为PEG400溶液与去离子水的体积比为1：1的混合溶剂。给药期结束后，大鼠经由腹主动脉采集血液及组织样本。采集时间：D2、D4、D6。动物分组为对照组、10mg/kg剂量组、20mg/kg剂量组、40mg/kg剂量组。
实验组动物在给药期D2、D4、D6经戊巴比妥钠麻醉后解剖，每次每组解剖5只大鼠，制备40mg/kg剂量动物肾脏的miRNA的芯片，检测出肾脏特异性表达上调的miRNA，即miR-21-3P，通过染料法实时荧光定量PCR验证实验证明上调确实存在。
检测miR-21-3P在血浆中的表达，同时检测其在肝、脑、心脏中的表达，结果显示肾脏表达上调，脑、心及肝脏表达不明显，确定miR-21-3P是马兜铃酸A致急性肾损伤的肾脏特异性miRNA。
图1为马兜铃酸A所建立的急性肾损伤模型中大鼠给药后随时间的体重变化图。表1中展示了马兜铃酸A致急性肾损伤模型中大鼠的体重变化数据(平均值及SD)。
表1
组别 D1 D2 D4 D6
对照组 90.2±5.6 91.8±5.9 93.8±9.1 105±10.4
10mg/kg 89.2±1.8 89±3.8 89.2±2.3 104.2±3.3
20mg/kg 95.2±3.6 93.2±4.4 93.6±6.7 89.8±8.4*
40mg/kg 101.2±3.8 93.2±3* 84.6±6.5** 75.6±5.1***
从图1和表1可以看出，随着实验进程增加，除10mg/kg剂量组实验动物体重持续增加外，20mg/kg及40mg/kg剂量组体重均呈降低的趋势。相比于对照组，20mg/kg剂量组实验动物D6时体重明显降低且具有统计学意义(P<0.05)，40mg/kg剂量组动物体重D2起即明显降低(P<0.05或p<0.001)。
表2中展示了大鼠的血清中的临床病理学检测结果(平均值及SD)。
表2
血液生化检测了TP、ALB、BUN和CREA四个指标在血清中的变化水平，主要的变化见于BUN，其余三个指标未见明显改变。其中BUN的改变表现为40mg/kg剂量组血清BUN水平的持续升高。D2至D6，相比于40mg/kg剂量组血清BUN明显升高，随着实验进程的增加，BUN持续升高且具有统计学意义(p<0.05或P<0.01)。20mg/kg剂量组D2时BUN水平升高具有统计学意义，但考虑其水平在正常值的波动范围之内，因此不认为具有生物学意义；10mg/kg剂量组未见明显改变。
图2中展示了大鼠的肾脏病理组织学图片。D2时，各剂量组肾脏形态结构正常，未见任何损伤。D4时，仅40mg/kg剂量组见轻微的单细胞坏死，其余剂量组未见肾脏损伤。D6时，20mg/kg剂量组皮髓交界处见轻度的肾小管变性及单细胞坏死，40mg/kg剂量组皮髓质交界处见明显的肾小管变性，单细胞坏死。
图3为qRT-PCR检测的40mg/kg剂量组大鼠肾脏组织中miR-21-3p的表达图。
表3展示了qRT-PCR检测的40mg/kg剂量组大鼠肾脏中miR-21-3p的表达结果。
表3
对照组 1.155 1.500 0.483 1.196 0.804
D2 2.996 2.402 0.669 1.271 1.298
D4 15.069 7.931 11.982 25.425 5.257
D6 4.658 12.431 4.254 2.851 7.103
图4展示了大鼠血浆中miR-21-3p的表达图。
表4中展示了大鼠血浆中miR-21-3p的表达结果。
表4
*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001vs对照组，T-Test
图5为40mg/kg剂量组给药第二天后在组织中miR-21-3P的表达图。
表5展示了40mg/kg剂量组给药第二天后在组织中miR-21-3P的表达结果。
表5
组别 脑
对照组 1.253 1.183 1.116 0.658 1.048
40mg/kg 1.845 0.636 0.634 0.439 0.847
组别 心脏
对照组 1.964 0.915 0.361 2.097 0.799
40mg/kg 0.443 0.491 0.502 0.442 0.726
组别 肝脏
对照组 1.571 1.049 0.303 1.495 1.373
40mg/kg 0.452 0.690 0.525 0.618 1.011
组别 肾脏
对照组 1.155 1.500 0.483 1.196 0.804
40mg/kg 2.996 2.402 0.669 1.271 1.298
RQ(Relative quantification)D2时，相对于对照组，脑、心及肝脏中miR-21-3p表达水平呈降低趋势，但在肾脏中，处理组肾脏miR-21-3p表达水平呈升高趋势。
实施例1表明含马兜铃酸的中药(马兜铃酸A)所建立的急性肾损伤模型中，D2开始，miR-21-3p在肾脏及血浆中即明显上调，而在脑、心、肝中表达量很低。因此，肾脏特异性的miR-21-3p可作为AKI的早期诊断生物标志物。
实施例2
含马兜铃酸A的中药制剂(关木通醇提浸膏)灌胃180-200g左右雄性Wistar大鼠，6天后腹主动脉采血，EDTA抗凝离心后分离血浆，检测miR-21-3p在血浆中的表达。
马兜铃酸A致早期急性肾损伤的检测包括以下步骤：
(1)染料法实时荧光定量PCR检测血浆中miR-21-3p的表达水平：
(2)基于步骤(1)中的检测结果判断含马兜铃酸类中药致急性肾损伤的患病可能性。
步骤(1)的具体过程如下：抽提血浆中miR-21-3p，茎环法反转录，染料法实时荧光定量PCR检测miR-21-3p的表达。
抽提血浆中miR-21-3p：
组织/血浆miRNA抽提选用天根miRcutemiRNA提取分离试剂盒，Cat:DP501。
准确称取30-50mg的大鼠肾脏皮随交界处组织的样品，将样品放入Lysing D磁珠管中，并加入1mL裂解液MZ。6.0m/s，匀浆40秒。如果磁珠管中仍有较大的组织块，重复匀浆一次。血浆样品每100μl中加入等体积裂解液MZ，振荡器振荡混匀30sec。
样品匀浆完毕后室温放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。室温12,000rpm(～13,400×g)离心10min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置5min。室温12,000rpm(～13,400×g)离心15min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积1/3体积的无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRspin，室温放置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，离心后弃掉吸附柱miRspin，保留流出液。(此步骤是去掉总RNA中200nt的长RNA)。
量取流出液的体积，缓慢加入流出液体积2/3体积的无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelute，室温放置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，离心后弃掉流出液，保留吸附柱miRelute。此步骤是将<200nt的RNA结合到吸附柱上。
向吸附柱miRelute中加入500μl去蛋白液MRD，室温静置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液。
向吸附柱miRelute中加入600μl漂洗液RW，室温静置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液。
将吸附柱miRelute放入2ml收集管中，室温12,000rpm(～13,400×g)离心1min，去除残余液体。
将吸附柱miRelute转入一个新的RNase-Free 1.5ml离心管中，加20μl RNase-Free ddH2O，室温放置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心2min。
将抽提好的RNA置于-80℃保存。
茎环法反转录：
1、按照下表6中的组分进行反应液的配制。
表6
2、移液器轻轻混匀上述反应液，短暂离心后按照以下表7程序在PCR仪中反应。(反转录系统，A5000，Promega)。
表7
5℃ 5min
10℃ 10min
15℃ 25min
42℃ 60min
70℃ 15min
C、染料法实时荧光定量PCR检测miRNA的表达(SYBRPremix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)，RR820A,Takara)，参见表8。
表8
SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus) 5μl
ROX Reference Dye II 0.2μl
正向引物(5μM) 0.5μl
反向引物(5μM) 0.5μl
cDNA 3.8μl
将miRNA第一链cDNA稀释4×后置于冰上，并按下表配制反应体系。
使用ABI Viia7荧光定量PCR仪进行扩增。
表9
图6为大鼠血浆中miR-21-3p的表达图。
表10展示了马兜铃酸A中药制剂致急性肾损伤实验中miR-21-3p的表达，其中中药制剂为马兜铃酸A的关木通醇提取浸膏，经过HPLC检测后，浓度为89mg/kg。
表10
组别 血浆
对照组 0.372 1.021 0.524 1.149
89mg/kg 1.644 2.415 5.204 1.965 1.508 6.611 2.821 2.821
实施例2表明大鼠血浆中miR-21-3p的表达明显高于对照组。
以上对本发明的特定实施例进行了说明，但本发明的保护内容不仅仅限定于以上实施例，在本发明的所属技术领域中，只要掌握通常知识，就可以在其技术要旨范围内进行多种多样的变更。

Claims (7)

1.miR-21-3p在制备用于检测早期急性肾损伤的试剂中的用途，其中所述急性肾损伤由含马兜铃酸的中药所致。
2.根据权利要求1所述的miR-21-3p在制备用于检测早期急性肾损伤的试剂中的用途，其特征在于：所述马兜铃酸为马兜铃酸A。
3.根据权利要求1或2所述的miR-21-3p在制备用于检测早期急性肾损伤的试剂中的用途，其特在于：早期急性肾损伤后，miR-21-3p在肾脏、血浆中表达上调。
4.根据权利要求1所述的miR-21-3p在制备用于检测早期急性肾损伤的试剂中的用途，其特征在于：含马兜铃酸的中药引起急性肾损伤的给药途径为腹腔注射或口服。
5.根据权利要求1所述的miR-21-3p在制备用于检测早期急性肾损伤的试剂中的用途，其特在于，所述检测包括以下步骤：
(1)检测血浆中miR-21-3p的表达；
(2)基于步骤(1)中的检测结果判断急性肾损伤的患病可能性。
6.根据权利要求5所述的miR-21-3p在制备用于检测早期急性肾损伤的试剂中的用途，其特征在于：在步骤(1)中，采用染料法实时荧光定量PCR检测血浆中miR-21-3p的表达。
7.根据权利要求1的miR-21-3p在制备用于检测早期急性肾损伤的试剂中的用途，其特征在于：miR-21-3p的核苷酸序列为GACAGCCCATCGACT。
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