CN105727909A - 一种具有核壳结构的硅胶微球及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种核壳结构硅胶微球及其制备方法和应用。该方法以鞣酸为模板剂，通过正硅酸乙酯水解聚合在无孔硅胶的表面合成出含有模板剂的壳层。通过乙醇洗和水洗可以去除模板剂鞣酸得到以无孔硅胶为核，介孔硅胶为壳的核壳结构微球。通过控制加入正硅酸乙酯的量可以调节壳层的厚度，通过控制生长正硅酸乙酯的次数可以控制壳层的厚度和微球的粒径。微球的最终粒径由无孔硅胶的大小和壳层厚度的大小决定。该微球的比表面积和孔径可以通过无机酸刻蚀的方法控制。该微球经过C18改性后，在反相液相色谱条件下用于蛋白样品和蛋白的酶解产物的快速分离。

Description

一种具有核壳结构的硅胶微球及其制备和应用

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种制备介孔核壳结构硅胶微球的工艺。

技术背景

核壳颗粒在分析化学中应用很广泛，其核和壳可以具有不同的结构，通过不同修饰可以发挥各自的作用。例如给磁球外面包覆硅层，然后再在硅层上面键合官能团或者进一步进行其他聚合反应M.Shao,M.Wei,D.G.Evans,X.Duan,Chemistry-AEuropeanJournal19(2013)4100；M.Zhao,Y.Xie,C.Deng,X.Zhang,JournalofChromatographyA1357(2014)182。这种复合型核壳颗粒既可以利用磁核与磁铁的作用进行快速的聚集和释放，又可以利用硅层外面的修饰基团与外界环境中的样品物质进行作用J.Cao,X.Zhang,X.He,L.Chen,Y.Zhang,JournalofMaterialsChemistryB1(2013)3625；X.Chen,N.Ding,H.Zang,H.Yeung,R.S.Zhao,C.Cheng,J.Liu,T.W.D.Chan,JournalofChromatographyA1304(2013)241。同时，核壳微球在液相色谱中也受到了很好地关注E.P.Nesterenko,P.N.Nesterenko,D.Connolly,X.He,P.Floris,E.Duffy,B.Paull,Analyst138(2013)4229。有报道将不规则的金属有机骨架(MOF)晶体生长在球形硅胶上制备成色谱填料，这种填料既发挥了MOF材料对特定小分子特异性吸附的功能，又具有硅胶微球高柱效的能力Y.Y.Fu,C.X.Yang,X.P.Yan,Chemistry-AEuropeanJournal19(2013)13484；A.Ahmed,M.Forster,R.Clowes,D.Bradshaw,P.Myers,H.Zhang,JournalofMaterialsChemistryA1(2013)3276。

然而目前制备介孔核壳硅胶颗粒所用的模板剂大多是阳离子表面活性剂，如十六烷基三甲基氯化铵，十六烷基三甲基溴化铵等，还有非离子表面活性剂如P123，F127等，这些模板剂用于制孔后难以从材料中去除，且污染环境J.D.Glennon,J.O.Omamogho,in,UnitedStates,2011/0226990A1；H.Dong,J.D.Brennan,JournalofMaterialsChemistry22(2012)13197；J.Liu,H.Q.Yang,F.Kleitz,Z.G.Chen,T.Yang,E.Strounina,G.Q.Lu,S.Z.Qiao,AdvancedFunctionalMaterials22(2012)591。所以寻找新的易于去除同时环境友好的模板剂意义重大，但是也困难重重。

鞣酸是一种自然界中存在的聚多酚类物质，可以从植物中提取到，广泛用于食品和医药添加剂。最近，有报道将其用于模板剂制备介孔纳米颗粒，粒径和孔径分别为200nm和6-13nm，同时，鞣酸可以通过水和乙醇洗涤除去Z.Gao,I.Zharov,ChemistryofMaterials26(2014)2030。目前还未有将鞣酸用于制备核壳颗粒的报道。因此，本研究采用鞣酸为模板剂制备核壳硅球微球，粒径在0.5和1.7μm之间，其壳层厚度可以调控在10到120nm间。对微球的孔径进行了表征，进一步研究了对蛋白的色谱分离效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以天然物质--鞣酸为模板剂合成介孔核壳结构硅胶色谱填料的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

以鞣酸为模板剂，将无孔硅胶投入氨水的乙醇溶液中，通过正硅酸乙酯水解聚合在无孔硅胶的表面合成出含有模板剂的壳层。通过乙醇洗和水洗可以基本去除模板剂鞣酸，便得到了核为无孔硅胶，壳层含有介孔的核壳结构硅胶微球。

一种介孔核壳结构硅胶色谱填料的制备方法，该方法步骤如下：

取鞣酸0.05-3wt.％之间，加入70-80wt.％无水乙醇，搅拌至溶液澄清；接着加入0.8-2wt.％硅胶，超声分散5-30min，然后在搅拌条件下加入16-25wt.％浓氨水(质量分数25-28％)，最后加入0.1-1wt.％正硅酸乙酯，反应2-6h。反应完后微球依次用乙醇洗1-10次，水洗4-6次，然后在80-100℃条件下烘干6-10h。将烘干后的微球放入马弗炉在550-800℃进行烧结1-2h，升温速率1-10℃/min。孔径进一步通过无机酸回流调节，酸可以是盐酸或者氢氟酸，盐酸的浓度为3-5mol/L,氢氟酸的浓度为100-200ppm，回流温度为100-120℃，回流时间为0.5-12h。

本发明具有以下优点：

1合成的核壳型硅胶微球填料单分散性好，粒径均一；

2模板剂鞣酸可以通过水和乙醇洗涤除去；

3壳层厚度可以通过调节硅酸酯的用量和生长的层数决定；

4微球的孔径可以通过酸回流的方式进行调节；

5将这种微球用于色谱填料，可以实现生物大分子的快速，高效分离；

6对蛋白样品分离具有高回收率和低残留；

7相对于无孔硅胶具有较高的载样量。

本发明提出了以鞣酸为模板剂合成核壳微球的方法，该基质微球可以用于色谱填料。通过表面改性键合不同的官能团，可以应用于不同模式的色谱分离。

附图说明

图1不同层厚的核壳硅胶微球的透射电镜表征图片。

图2核壳结构硅胶微球的场发射扫描电镜表征图片。

图3核壳结构硅胶微球的等温吸附线(A)和孔径分布图(B)。STP代表标准温度和压力。

图4核壳结构硅胶反相色谱填料用于蛋白混合物分离

色谱柱：50x2.1mmi.d.,1.7μmC18核壳硅胶微球,孔径:6.5nm.反压:392bar.色谱峰:0.溶剂,1.RNaseA,2.Cytc,3.Lys中杂质,4.Lys,5.BSA,6.OVA。

图5不同载样量条件下分离蛋白色谱图。

进样量：0.3μL,0.6μL,1.0μL,1.3μL,1.6μL,相对于0.65to3.5μg.线性梯度27-65％B，其他条件同图4。

图6色谱柱上蛋白残留色谱图

进样一次后分别走两个空白梯度，其他条件同图4。

具体实施方式

实施例1

以鞣酸为模板剂制备单层壳层的核壳硅胶微球(M1)。称取0.15g鞣酸溶于50mL无水乙醇中，加入1g无孔硅胶微球种子，搅拌条件下加入25mL浓氨水(28％)，加入0.3mL正硅酸乙酯，反应2小时。水洗3遍，95％(v/v％)乙醇洗一遍，再用水洗一遍，每次洗涤时离心条件为3000rpm，5min。生长过程中用吸管取少许在光学显微镜下观察微球的分散情况。取少许微球离心后分散于无水乙醇中分散，用透射电镜观察，如图1所示。

实施例2

以鞣酸为模板剂制备三层壳层的核壳硅胶微球(M2)。将M1分散于鞣酸的无水乙醇溶液中，按照M1的反应条件生长第二层，反应完后经离心再继续生长第三层。室温反应(21℃)。水洗三遍，95％(v/v％)乙醇洗1遍，3000rpm，5min，水中分散。再水洗3遍，95％(v/v％)乙醇洗3遍，经甲醇分散，离心和干燥后做氮吸附。透射电镜图片见图1。

实施例3

优化正硅酸乙酯加入量制备微球(M3)。反应条件如M1但是正硅酸乙酯加入量为1mL，生长完第一层后水洗一遍，95％(v/v％)乙醇洗一遍，再用水洗2遍，水中分散。电镜图片见图1。

实施例4

以正硅酸乙酯优化后的条件制备三层壳层的核壳硅胶微球(M4)。将M3分散于鞣酸的无水乙醇溶液中，按照M3的反应条件生长第二层，反应完离心后再继续生长第三层。水洗三遍，95％(v/v％)乙醇洗三遍，接着水洗4遍，离心条件为3000rpm,5min,然后水洗一遍，2500rpm,3min,水中分散。

实施例5

对合成的核壳微球进行孔径表征。首先，对只用水和乙醇进行清洗后的核壳硅胶微球进行了孔径表征。具体过程为80℃烘干6h，然后进行比表面积和孔径的表征。接着，将核壳微球在空气中进行烧结，以10℃/min的升温速率升到550℃，保持1小时，然后进行比表面积和孔径的测定。最后将核壳微球进行活化，在200ppmHF溶液中于100℃回流6h,微球电镜图片见图2，物理吸附表征见图3。

注意：氢氟酸具有高度腐蚀性，操作者必须在通风橱中操作，同时戴面罩和穿实验服。

实施例6

应用核壳硅胶微球制备反相C18填料。取粒径为1.63±0.04μm的无孔硅胶按照方法M2制备核壳硅胶微球粒径为1.67±0.06μm。通常取1g核壳微球在120℃至少烘干6h，然后分散于干燥甲苯中，超声分散后，加入1ml十八烷基三氯硅烷在110℃回流6h。最后抽滤洗涤，依次用干燥甲苯，甲苯，丙酮和甲醇洗。实验中采用匀浆法装柱。称取0.23gC18核壳填料分散于3mL甲醇溶液中，超声分散。用甲醇作为顶替液，装填50x2.1mmi.d.色谱柱。将压力缓慢升至800bar，每次升高100bar，保持1小时后自然泄压。待压力降到零时，拆下色谱柱装上筛板，用甲醇冲洗平衡。

注意：800bar压力很高，操作者必须戴护目镜。

实施例7

将装好的色谱柱用于整体蛋白分离。对整体蛋白进行分离的色谱流动相A为水加0.1％三氟乙酸(TFA)(v/v)，流动相B为乙腈加0.1％TFA(v/v)，见图4。紫外检测波长为214nm。梯度条件为26-65％B，梯度时间为1min，柱温箱温度设置为50℃，流速为1.0mL/min。进样量为0.3μL。五种蛋白的混合物包括核糖核酸酶A(1mg/mL,RNaseA)，细胞色素C(1.2mg/mL,Cytc)，溶菌酶(0.5mg/mL,Lys)，牛血清白蛋白(2mg/mL,BSA)，卵清蛋白(7.7mg/mL,OVA)。配制混合物时除了20μLLys和7μLBSA外各取10μL混合。不同进样量条件下分离色谱图见图5，色谱柱上蛋白残留色谱图见图6。

Claims (7)

1.一种具有核壳结构的硅胶微球，其特征在于：核为无孔硅胶微球，核的粒径500-1600nm，包裹于核外表面的硅胶壳上具有介孔结构，微球壳上的介孔是由以鞣酸为模板剂制备形成的，孔径介于5到30nm之间，壳的厚度10-200nm，微球粒径大于500nm小于2μm。

2.一种权利要求1所述微球的制备方法，其特征在于：

(1)以鞣酸作为形成介孔的模板剂；

(2)核为无孔硅胶微球；

(3)孔径和比表面积通过酸回流的方式控制。

3.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中：核为无孔硅胶微球，粒径在500-1600nm。

4.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中：于无孔硅胶微球表面，鞣酸与正硅酸乙酯在氨水的乙醇溶液中相互作用，待正硅酸乙酯完全水解和聚合后；经过乙醇和水依次洗涤，可以除去鞣酸得产物，或经过乙醇和水依次洗涤后烧结得产物，或烧结得产物；这样原先有鞣酸在硅胶中占据的位置就形成了相互连接的介孔结构，通过控制鞣酸的量可以调节孔径的大小；

具体过程：取鞣酸于反应体系中的终含量0.05-3wt.％之间，加入于反应体系中的终含量70-80wt.％无水乙醇，搅拌至溶液澄清；接着加入于反应体系中的终含量0.8-2wt.％硅胶，超声分散5-30min，然后在搅拌条件下加入于反应体系中的终含量16-25wt.％浓氨水(质量分数25-28％)，最后加入于反应体系中的终含量0.1-1wt.％正硅酸乙酯，反应2-6h；

反应完后微球依次用乙醇洗1-10次，水洗4-6次，然后在80-100℃条件下烘干6-10h得产物；

或，反应完后微球放入马弗炉在550-800℃进行烧结1-2h，烧结时从室温起的升温速率1-10℃/min；

或，反应完后微球依次用乙醇洗1-10次，水洗4-6次，然后在80-100℃条件下烘干6-10h；将烘干后的微球放入马弗炉在550-800℃进行烧结1-2h得产物，烧结时从室温烘干起的升温速率1-10℃/min。

5.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

步骤(3)中：酸为无机酸，可以是盐酸或者氢氟酸，盐酸的浓度为3-5mol/L,氢氟酸的浓度为100-200ppm，回流温度为100-120℃，回流时间为0.5-12h。

6.按照权利要求3中所述的具体过程，其特征在于：

具体过程中微球的洗涤方式为：采用离心的方式进行清洗，离心的转速控制在2000-4000rpm之间，离心的时间设置在3-5min之间，离心的次数为3-15次。

7.一种权利要求1所述的核壳结构硅球是种多孔材料，可用于液相色谱填料或固相萃取固定相。