CN105708891A - 控制和治疗人体脂肪肝的药物组合物及其应用 - Google Patents

控制和治疗人体脂肪肝的药物组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了甘草的精制提取物，其通过于大孔吸附树脂层析柱和聚酰胺树脂层析柱依次对醇溶性且非水溶性的甘草提取物进行精制而得。该提取物质量稳定，疗效可靠，尤其是适合用于控制人体血脂和治疗脂肪肝。另外，本发明还提供了基于该提取物的药物制剂和应用等。

Description

控制和治疗人体脂肪肝的药物组合物及其应用
技术领域
本发明属于传统医药领域，具体而言，本发明涉及甘草的精制提取物及其制剂和应用，特别适合于控制人体血脂和治疗脂肪肝。
背景技术
本发明人致力于甘草等中药材的研究，在先开发了醇溶性且非水溶性的甘草提取物，并将其与抗肿瘤药物或降糖降脂药物(如，枸杞)联合施用，用于抗肿瘤或降糖降脂，如可参见中国专利第201180007632号和第201280012972号。
然而，本发明人发现，由于甘草的品种不同，产地来源不同，各生产批次更是差别巨大，醇溶性且非水溶性的甘草提取物的质量非常不稳定，所以在其现有技术的公开中通常只能采用联合施用的形式。
本发明人并没有自满于该提取物联合应用后已经能抗肿瘤或降糖降脂，而是进一步深耕，令人意外地开发了精制醇溶性且非水溶性的甘草提取物的方法，所得产物不受甘草原料的多样性的影响，能够获得检测特征稳定的甘草的精制提取物，尽管在一些适应症方面疗效有所倒退，但是在控制人体血脂和治疗脂肪肝等方面却疗效确切并有所提高，可以单独给药，而不必限于联合施用。
发明内容
本发明的目的在于提供新的甘草提取物，其是在现有的醇溶性且非水溶性的甘草提取物基础上精制而得的，质量稳定，疗效确切，适合用于控制人体血脂和治疗脂肪肝等。另外，本发明的目的还在于提供基于该甘草提取物的药物、制备方法和应用等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了甘草的精制提取物，其由如下方法制备而成：
(1)用水浸提甘草后，保留固体部分；
(2)用浓度大于85％(V/V)的醇浸提步骤(1)得到的固体部分，保留液体部分并干燥；
(3)将步骤(2)得到的干燥产物用浓度为50～57％(V/V)的醇溶解后上样于大孔吸附树脂层析柱，收集用浓度为59～70％(V/V)的醇洗脱的洗脱液并干燥；和，(4)将步骤(3)得到的干燥产物用浓度为30～60％(V/V)的醇溶解后上样于聚酰胺树脂层析柱，用浓度为30～60％(V/V)的醇洗脱，收集洗脱液并任选干燥。
在本文中，甘草(RadixGlycyrrhizae)可以各种来源的甘草，例如是乌拉尔甘草或胀果甘草或它们的混合物。现有技术相当于执行上述方法的步骤(1)和(2)，得到的甘草提取物受到甘草的来源影响大，然而，本发明的方法克服该缺陷。因此，优选本发明第一方面的甘草精制提取物的HPLC检测图谱具有如图1所示的三个特征峰。更优选这三个特征峰的比例也是稳定的，例如，如图1所示的这三个特征峰从左至右的峰面积之比为7～9：4～6：150：170，在8：5：160左右。
优选在本发明第一方面的甘草精制提取物中，醇是甲醇和/或乙醇，优选是乙醇。
也优选在本发明第一方面的甘草精制提取物中，步骤(2)中，浓度大于90％(V/V)，优选大于93％(V/V)，如95％(V/V)。
还优选在本发明第一方面的甘草精制提取物中，步骤(3)中，溶解的醇的浓度为53～56％(V/V)，如55％(V/V)；和/或，洗脱的醇得浓度为60～62％(V/V)，如60％(V/V)。
另外优选在本发明第一方面的甘草精制提取物中，步骤(4)中，浓度为40～50％(V/V)，优选为43～48％(V/V)，如45％(V/V)。
在第二方面，本发明提供了本发明第一方面的甘草精制提取物的制备方法，其包括：
(1)用水浸提甘草后，保留固体部分；
(2)用浓度大于85％(V/V)的醇浸提步骤(1)得到的固体部分，保留液体部分并干燥；
(3)将步骤(2)得到的干燥产物用浓度为50～57％(V/V)的醇溶解后上样于大孔吸附树脂层析柱，收集用浓度为59～70％(V/V)的醇洗脱的洗脱液并干燥；和，(4)将步骤(3)得到的干燥产物用浓度为30～60％(V/V)的醇溶解后上样于聚酰胺树脂层析柱，用浓度为30～60％(V/V)的醇洗脱，收集洗脱液并任选干燥。
优选在本发明第二方面的制备方法中，醇是甲醇和/或乙醇，优选是乙醇。
也优选在本发明第二方面的制备方法中，步骤(2)中，浓度大于90％(V/V)，优选大于93％(V/V)，如95％(V/V)。
还优选在本发明第二方面的制备方法中，步骤(3)中，溶解的醇的浓度为53～56％(V/V)，如55％(V/V)；和/或，洗脱的醇得浓度为60～62％(V/V)，如60％(V/V)。
另外优选在本发明第二方面的制备方法中，步骤(4)中，浓度为40～50％(V/V)，优选为43～48％(V/V)，如45％(V/V)。
在第三方面，本发明提供了药物制剂，其包括本发明第一方面的甘草精制提取物和药学上可接受的辅料。在本文中，术语“药学上可接受的辅料”包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂等，它们与药物活性成分相容。运用药学上可接受的辅料制备药物制剂对本领域普通技术人员来说是公知的。本发明的药物制剂包含本发明第一方面的组合物作为活性成分，将该组合物和药学上可接受的辅剂(如本领域普通技术人员所熟知的载体、赋形剂、稀释剂和调味剂等)组合在一起，配制成各种制剂，优选为固体制剂和液体制剂，如片剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释释放形式)、粉剂(如冻干粉剂)、混悬剂、颗粒剂、酊剂、糖浆剂、乳液剂、悬浮液、针剂等剂型以及各种缓释剂型，从而适合各种给药形式，例如口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等的给药形式，最优选是口服。在本发明的具体实施方式中，本发明第三方面的药物制剂是液体口服制剂。
本发明第一方面的甘草精制提取物可以单独应用，也可以联合其他药物应用。根据现有技术，枸杞对降糖降脂也有帮助，因此本发明第三方面的药物制剂还可以包括枸杞。
在第四方面，本发明提供了本发明第一方面的甘草精制提取物在制备用于预防或治疗脂肪性肝损伤的药物中的应用。在本发明的具体实施方式中，脂肪性肝损伤是非酒精性的脂肪性肝损伤。
在第五方面，本发明提供了本发明第一方面的甘草精制提取物在制备用于预防或治疗肥胖或降低血脂水平的药物中的应用。在本发明的具体实施方式中，肥胖是高脂饮食导致的肥胖，和/或，血脂水平是高脂饮食导致的血脂水平。
在第六方面，本发明提供了本发明第一方面的甘草精制提取物在制备用于降低炎症因子水平的药物中的应用。在本发明的具体实施方式中，炎症因子水平是高脂饮食导致的炎症因子水平。所述炎症因子包括TNF-α、IL-6和/或MCP-1。
本发明的有益效果在于：本发明的甘草精制提取物能够有效地控制人体血脂和/或体重，并能改善脂肪肝症状；另外，本发明的甘草精制提取物的质量稳定，品质特征几乎不受甘草来源的影响。
本发明引用了现有公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文之中，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。利用本发明实施例所述的方法，也可以获得本发明其他的技术方案。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。
附图说明
图1显示了本发明的甘草精制提取物的HPLC检测结果。
图2显示了各药物对非酒精性脂肪性肝损伤模型大鼠体重的试验结果，其中，###p<0.001，相对于正常对照组；*p<0.05，相对于模型组。
图3显示了各药物对非酒精性脂肪性肝损伤模型大鼠肝脏指数的试验结果。图4显示了各药物对非酒精性脂肪性肝损伤模型大鼠血清游离脂肪酸的试验结果，其中，###p<0.001，相对于正常对照组；*p<0.05，相对于模型组。
图5、图6分别显示了各药物对非酒精性脂肪性肝损伤模型大鼠肝功能(转氨酶ALT、AST)的试验结果，其中，###p<0.001，相对于正常对照组；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，相对于模型组。
具体实施方式
具体实施例中的植物原料和化学试剂均为从市场渠道购买的常规材料，其中药理实验遵循了CFDA的相关动物实验指引。
实施例1甘草精提取物的制备
取甘草50g，加入水250mL，于85℃浸泡7小时，冷却至室温，滤纸过滤，弃去滤液；滤渣再加入水250mL，于85℃浸泡7小时，冷却至室温，滤纸过滤，弃去滤液；然后，滤渣再加入水250mL，于85℃浸泡7小时，冷却至室温，滤纸过滤，弃去滤液。
然后，滤渣加入95％(v/v)的乙醇200mL，85℃回流提取2小时，冷却置室温，滤纸过滤，保留滤液；滤渣再加入95％(v/v)的乙醇200mL，85℃回流提取2小时，冷却置室温，滤纸过滤，保留滤液；然后，滤渣再加入95％(v/v)的乙醇200mL，85℃回流提取2小时，冷却置室温，滤纸过滤，保留滤液。合并三次滤液，60℃减压浓缩后于烘箱中60℃干燥，得甘草粗提取物A(编号Z018)4.023g。
将4.023g甘草粗提取物A用55％(v/v)的乙醇70mL在超声条件下溶解。AB-8型大孔吸附树脂层析柱(树脂110g，柱体积460mL；可购自北京元宝山色谱科技有限公司)用55％(v/v)的乙醇平衡，然后上样甘草粗提取物A的乙醇溶液，用7倍柱体积的55％(v/v)的乙醇洗脱后再用7倍柱体积的60％(v/v)的乙醇洗脱，收集60％(v/v)乙醇部分的洗脱液，60℃减压浓缩后于烘箱中60℃干燥，得甘草粗提取物B704.5mg。
将704.5mg甘草粗提取物B用45％(v/v)的乙醇20mL在超声条件下溶解。聚酰胺树脂层析柱(树脂11g，柱体积95mL；可购自北京元宝山色谱科技有限公司)用45％(v/v)的乙醇平衡，然后上样甘草粗提取物B的乙醇溶液，用45％(v/v)的乙醇洗脱，分段收集洗脱液，每段60mL，合并第8至14段收集的洗脱液，60℃减压浓缩后于烘箱中60℃干燥，得甘草精提取物(编号Z018A)342.3mg。
取甘草精提取物少量，溶于甲醇，进行HPLC检测，即上样于DiamonsilC18层析柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温25℃，以甲醇-0.2％磷酸水溶液为流动相，以0.8mL/min的流速如表1所述条件进行梯度洗脱，以379nm波长检测。
不同来源、各批次的甘草经过上述精制，所得甘草精提取物的产量有相当大的差异，但是质量稳定，HPLC检测结果基本都如图1所示，呈现三个特征峰，从左至右这三个峰的峰面积之比约为8：5：160。
表1：梯度洗脱表
实施例2甘草粗提取物A和甘草精提取物对非酒精性的脂肪性肝损伤大鼠的药理试验
实施例1制备的甘草粗提取物A(Z018)和甘草精提取物(Z018A)分别作为Z018和Z018A高、低剂量组的给药药物；阳性对照组分别以水飞蓟素和阿托伐他汀作为给药药物。各药物均用0.5％CMC-Na溶解。
Wistar大鼠(雄性，体重180g)适应性饲养一周后，根据体重随机分为正常对照组(control)、模型组(model)、水飞蓟素对照组(silymarin)、阿托伐他汀对照组(atorvastatin)、Z018高剂量组、Z018低剂量组、Z018A高剂量组、Z018A低剂量组。正常对照组喂饲基础饲料(基础饲料购自北京科澳协力饲料有限公司，批号：13083111)，其余各组喂养高脂饲料(78.8％基础饲料+l％胆固醇+10％蛋黄粉+10％猪油+0.2％胆酸钠)8周，第九周起各给药组灌胃给予相应药物(给药方案如表2所示)，连续给药4周。末次给药后禁食不禁水，16h后大鼠称重，取血，分离血清，测定大鼠血清中相关生化指标，包括总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、游离脂肪酸(FFA)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性，以及炎性因子TNF-α、IL-6、MCP-1含量。每周称量动物体重一次。处死大鼠，取大鼠肝脏，置冰生理盐水中洗净血液，滤纸吸去水分并拍照称重，取一部分肝脏以10％福尔马林溶液固定，供病理学检测使用。
表2给药方案
甘草粗提取物A(Z018)和甘草精提取物(Z018A)对非酒精性脂肪性肝损伤模型大鼠体重的试验结果如图2所示，与正常对照组比较，模型组大鼠的体重明显升高；而连续给药后，水飞蓟素对照组、阿托伐他汀对照组、Z018高剂量组、Z018A高剂量组与模型组相比，体重均有显著下降(p<0.05)。
甘草粗提取物A(Z018)和甘草精提取物(Z018A)对非酒精性脂肪性肝损伤模型大鼠肝脏指数的试验结果如图3所示，与正常对照组比较，模型组大鼠的肝脏指数略微升高；连续给药后，Z018各剂量组与模型组相比，肝指数均有所下降。
甘草粗提取物A(Z018)和甘草精提取物(Z018A)对非酒精性脂肪性肝损伤模型大鼠血清相关生化指标水平的试验结果如表3所示，与正常对照组比较，模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C均显著升高(p<0.01)，而HDL-C则显著降低(p<0.01)；与模型组比较，连续给药后，水飞蓟素对照组、阿托伐他汀对照组、Z018各剂量组、Z018A各剂量组的TC、TG、LDL-C、HDL-C水平基本上均有显著改善。
表3Z018和Z018A对非酒精性脂肪性肝损伤模型大鼠血清生化指标水平的影响
###p<0.01，相对于正常对照组；*p<0.05and**p<0.01and***p<0.001，相对于模型组
甘草粗提取物A(Z018)和甘草精提取物(Z018A)对非酒精性脂肪性肝损伤模型大鼠血清游离脂肪酸的试验结果如图4所示，与正常对照组比较，模型组大鼠血清中FFA含量均明显升高(p<0.001)；与模型组比较，连续给药后，水飞蓟素对照组、阿托伐他汀对照组、Z018A各剂量组大鼠血清中FFA含量均有所降低，与模型组相比具有显著性差异(p<0.05)。
甘草粗提取物A(Z018)和甘草精提取物(Z018A)对非酒精性脂肪性肝损伤模型大鼠肝功能的试验结果如图5、图6所示，与正常对照组比较，模型组血清中ALT、AST含量明显高于空白对照组(p<0.001)；与模型组比较，连续给药后，水飞蓟素对照组、阿托伐他汀对照组、Z018高剂量组、Z018A高剂量组均能明显降低血清中ALT、AST含量(p<0.05，p<0.01，p<0.001)，减轻肝损伤的程度。
甘草粗提取物A(Z018)和甘草精提取物(Z018A)对非酒精性脂肪性肝损伤模型大鼠血清TNF-α、IL-6、MCP-1的试验结果如表4所示，与正常对照组比较，与空白对照组比较，模型组大鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-6、MCP-1含量均明显升高(p<0.001)；与模型组比较，连续给药后，水飞蓟素对照组、阿托伐他汀对照组、Z018A高剂量组大鼠血清中TNF-α、IL-6、MCP-1含量均所有降低。
表4Z018、Z018A对非酒精性脂肪性肝损伤模型大鼠血清炎症因子水平的影响
###p<0.001，相对于正常对照组；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，相对于模型组。

Claims (10)

1.甘草的精制提取物，其由如下方法制备而成：
(1)用水浸提甘草后，保留固体部分；
(2)用浓度大于85％(V/V)的醇浸提步骤(1)得到的固体部分，保留液体部分并干燥；
(3)将步骤(2)得到的干燥产物用浓度为50～57％(V/V)(优选为53～56％(V/V)，如55％(V/V))的醇溶解后上样于大孔吸附树脂层析柱，收集用浓度为59～70％(V/V)(优选为60～62％(V/V)，如60％(V/V))的醇洗脱的洗脱液并干燥；和，
(4)将步骤(3)得到的干燥产物用浓度为30～60％(V/V)的醇溶解后上样于聚酰胺树脂层析柱，用浓度为30～60％(V/V)的醇洗脱，收集洗脱液并任选干燥。
2.权利要求1所述的精制提取物，其HPLC检测图谱具有如图1所示的三个特征峰。
3.权利要求1所述的精制提取物，其中，
醇是甲醇和/或乙醇，优选是乙醇；
步骤(2)中，浓度大于90％(V/V)，优选大于93％(V/V)，如95％(V/V)；和/或，
步骤(4)中，浓度为40～50％(V/V)，优选为43～48％(V/V)，如45％(V/V)。
4.权利要求1所述的精制提取物的制备方法，其包括：
(1)用水浸提甘草后，保留固体部分；
(2)用浓度大于85％(V/V)的醇浸提步骤(1)得到的固体部分，保留液体部分并干燥；
(3)将步骤(2)得到的干燥产物用浓度为50～57％(V/V)(优选为53～56％(V/V)，如55％(V/V))的醇溶解后上样于大孔吸附树脂层析柱，收集用浓度为59～70％(V/V)(优选为60～62％(V/V)，如60％(V/V))的醇洗脱的洗脱液并干燥；和，
(4)将步骤(3)得到的干燥产物用浓度为30～60％(V/V)的醇溶解后上样于聚酰胺树脂层析柱，用浓度为30～60％(V/V)的醇洗脱，收集洗脱液并任选干燥。
5.权利要求4所述的制备方法，其中，
醇是甲醇和/或乙醇，优选是乙醇；
步骤(2)中，浓度大于90％(V/V)，优选大于93％(V/V)，如95％(V/V)；和/或，
步骤(4)中，浓度为40～50％(V/V)，优选为43～48％(V/V)，如45％(V/V)。
6.药物制剂，其包括权利要求1～3之任一所述的精制提取物和药学上可接受的辅料。
7.权利要求6所述的药物制剂，其为口服制剂，优选为固体口服制剂；和/或，其还包括枸杞。
8.权利要求1～3之任一所述的精制提取物在制备用于预防或治疗脂肪性肝损伤(优选是非酒精性的脂肪性肝损伤)的药物中的应用。
9.权利要求1～3之任一所述的精制提取物在制备用于预防或治疗肥胖(优选是高脂饮食导致的肥胖)或降低血脂水平(优选是高脂饮食导致的血脂水平)的药物中的应用。
10.权利要求1～3之任一所述的精制提取物在制备用于降低炎症因子水平(优选是高脂饮食导致的炎症因子水平)的药物中的应用。
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