CN105695586A - 一种检测人类mthfr基因677位点的酶切方法 - Google Patents

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徐兴顺
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明公开了一种检测人类MTHFR基因677位点的酶切方法，包括提取血液基因组DNA，设计特异性引物，PCR扩增反应及酶切鉴定等步骤。本发明采用基因组DNA的PCR扩增结合限制性内切酶方法，可快速准确鉴定MTHFR基因677位点基因型，仅需要PCR仪等基本设备仪器，结果准确易懂，非专业人员也可分析，且成本低，是一种可以广泛应用于临床检验的方法。

Description

一种检测人类MTHFR基因677位点的酶切方法
技术领域
本发明涉及基因型检测领域，尤其涉及一种检测人类MTHFR基因677位点的酶切方法。
背景技术
亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-MethylenetetrahydrofolateReductase，MTHFR)是叶酸代谢系统中的关键酶，主要作用是在叶酸代谢途径中将5,10-亚甲基四氢叶酸催化转化为5-甲基四氢叶酸进入甲基通路，即：通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接为DNA甲基化和蛋白质甲基化提供甲基，同时降低血液中的同型半胱氨酸水平。
MTHFR与多种疾病的发生密切相关，其基因缺陷将导致其编码的酶活性降低，引起叶酸代谢障碍，产生高同型半胱氨酸血症，继而产生多种病症，其中以脑卒中以及新生儿神经管缺陷最为严重。因此，检测MTHFR基因型，可以提示脑卒中风险性，同时还能指导孕妇服用叶酸，降低唐氏综合征、唇腭裂、神经管缺陷等新生儿缺陷。
MTHFR基因具有11个编码外显子区域，目前可以通过MTHFR全基因编码区域测序法筛查突变，为患者提供辅助诊断。其中MTHFR基因最常见的突变位点为C677T，C/C为正常基因型，当个体为C/T基因型时，酶活性降低到60％左右；当个体为T/T基因型时，酶活性降低到30％。由于T基因型在中国人群体中基因频率较高，接近50％，因此直接针对该特定位点进行检测会节省成本，更快速为患者提供结果。如发现T/T基因型，将为此类高危人群提供辅助诊断，提示个体发生脑卒中及新生儿缺陷的风险度，并同时指导叶酸和维生素用药剂量，将有利于降低疾病发生。
已有检测手段包括基因芯片、直接测序、纳米技术、HRM技术等，虽然都能达到准确诊断，但实验操作较复杂，费用高，需要相对高端设备仪器，如测序仪。因此限制了该检测项目在临床的推广。
发明内容
解决的技术问题：为了获得一种快速、准确、结果易读且成本低的MTHFR基因677位点基因型检测方法，本发明提供了一种检测人类MTHFR基因677位点的酶切方法。
技术方案：一种检测人类MTHFR基因677位点的酶切方法，包含以下步骤：
(1)提取受试者血液基因组DNA；
(2)以人类MTHFR基因677位点附近序列设计特异性引物，
上游引物：GATGCTTGTTGGCCAAAGTACAAC，
下游引物：GATTTGCTTGGCTGCTCAAGG；
(3)使用步骤(2)中的特异性引物，以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，获得扩增产物，电泳检测扩增产物；PCR扩增产物的片段大小为727bp；
其中野生型的扩增片段为：
GATGCTTGTTGGCCAAAGTACAACAAACCCCTCAACAGACACTGTTGCTGGGTTTTGGGGGGAAAATTAGAGGTAACCAAAATGGGGTGGCCAAGCAACGCTGTGCAAGTTCTGGACCTGAGAGGAGATCTGGGAAGAACTCAGCGAACTCAGCACTCCACCCAGAGCCCCCAGCCTGTGCGAGGACGGTGCGGTGAGAGTGGGGTGGAGGGAGCTTATGGGCTCTCCTGGGCCCCTCACCTGGATGGGAAAGATCCCGGGGACGATGGGGCAAGTGATGCCCATGTCGGTGCATGCCTTCACAAAGCGGAAGAATGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCGGCTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAAGTGCTTCAGGTCAGCCTCAAAGCTCCCTGCTTCGGGGTGGCCTTTGGGGTAACCTGCCAATAGGGATGACAGTCAGGAGAGGCTGGCCTCCACCTGTTCAAGGCGAGGGATGAAGAGACCACAGGGACTGGGCAGAGAGAGTCCTCTGCTTTGGGGGCTCTGATCTTGCACCTTCCAACAGCACAGCACAGCCTGAACTAAAACAGTGAGTGGCTGGGCTCATGACTGATATGCTTCTGACCCCAGAGATGACTCTCAGGGGAGGTGGCTCAGAGCCCAGTTCCAAGAGTGGGGGTGGATTGCTCCAAACTCCCACACTGTCCTGCCTTGAGCAGCCAAGCAAATC
突变型的扩增片段为：
GATGCTTGTTGGCCAAAGTACAACAAACCCCTCAACAGACACTGTTGCTGGGTTTTGGGGGGAAAATTAGAGGTAACCAAAATGGGGTGGCCAAGCAACGCTGTGCAAGTTCTGGACCTGAGAGGAGATCTGGGAAGAACTCAGCGAACTCAGCACTCCACCCAGAGCCCCCAGCCTGTGCGAGGACGGTGCGGTGAGAGTGGGGTGGAGGGAGCTTATGGGCTCTCCTGGGCCCCTCACCTGGATGGGAAAGATCCCGGGGACGATGGGGCAAGTGATGCCCATGTCGGTGCATGCCTTCACAAAGCGGAAGAATGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCGACTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAAGTGCTTCAGGTCAGCCTCAAAGCTCCCTGCTTCGGGGTGGCCTTTGGGGTAACCTGCCAATAGGGATGACAGTCAGGAGAGGCTGGCCTCCACCTGTTCAAGGCGAGGGATGAAGAGACCACAGGGACTGGGCAGAGAGAGTCCTCTGCTTTGGGGGCTCTGATCTTGCACCTTCCAACAGCACAGCACAGCCTGAACTAAAACAGTGAGTGGCTGGGCTCATGACTGATATGCTTCTGACCCCAGAGATGACTCTCAGGGGAGGTGGCTCAGAGCCCAGTTCCAAGAGTGGGGGTGGATTGCTCCAAACTCCCACACTGTCCTGCCTTGAGCAGCCAAGCAAATC
(4)采用限制性内切酶TaqI，TthHB8I，TaqaI中的任意一种酶切步骤(3)获得的扩增产物；上述酶能够特异性的识别677位点突变型T/T产生的TCGA位点；
(5)电泳检测经步骤(4)酶切后的产物，并进行分型判断结果。
优选的，步骤(3)中所述PCR扩增反应的条件为：95℃3分钟，1个循环；95℃变性30秒，60～65℃退火30秒，72℃延伸45秒，35～40循环；72℃延伸5～10分钟。
优选的，步骤(4)中所述酶切的体系为：20μL反应体系，8μL受试者样品PCR产物，2μL10X酶切缓冲液，限制性内切酶1-5Unit。
优选的，步骤(4)中所述酶切的条件为：65℃水浴或孵育箱中酶切2小时。
有益效果：本发明采用基因组DNA的PCR扩增结合限制性内切酶方法，可快速准确鉴定MTHFR677基因型，仅需要PCR仪等基本设备仪器，结果准确易懂，非专业人员也可分析，且成本低，是一种可以广泛应用于临床检验的方法。
附图说明
图1是MTHFR基因677位点的扩增产物测序结果图；
图2是MTHFR基因677位点的扩增产物酶切后的电泳图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1临床中风合并同型半胱氨酸血症患者基因型检测
检测人类MTHFR基因677位点的酶切方法，包含以下步骤：
(1)提取中风合并同型半胱氨酸血症患者血液基因组DNA
采用EDTA抗凝，酚氯仿或试剂盒常规提取患者外周血基因组DNA，溶解于双蒸水或TE缓冲液中备用。
(2)以人类MTHFR基因677位点附近序列设计特异性引物，
上游引物：GATGCTTGTTGGCCAAAGTACAAC，
下游引物：GATTTGCTTGGCTGCTCAAGG；
(3)使用步骤(2)中的特异性引物，以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，获得扩增产物，电泳检测扩增产物；
其中，PCR扩增反应的体系为：20μLPCR扩增体系，1μL、10～50ng受试者血液基因组DNA，Taq酶、缓冲液及dNTPs共19μL。
PCR扩增反应的条件为：95℃3分钟，1个循环；95℃变性30秒，60～65℃退火30秒，72℃延伸45秒，35～40循环；72℃延伸5～10分钟。
扩增后的样品在1.2～1.5％琼脂糖凝胶孔中进行电泳分离，TAE或TBE缓冲电泳液；电泳时间为15～20min，确保空白对照未见扩增条件下，进行判别扩增产物是否扩增成功。
(4)采用限制性内切酶TaqI，TthHB8I，TaqaI中的任意一种酶切步骤(3)获得的扩增产物；
其中，酶切的体系为：20μL反应体系，8μL受试者样品PCR产物，2μL10X酶切缓冲液，限制性内切酶1-5Unit。酶切的条件为：65℃水浴或孵育箱中酶切2小时。
(5)电泳检测经步骤(4)酶切后的产物，并进行分型判断结果。
电泳检测：将酶切后的产物5～10μL在1.5％琼脂糖凝胶孔中进行电泳分离，结果判别标准如下：只有一条特异性条带，长度为727bp，且与未经酶切的PCR扩增产物大小一致的条带，为野生型纯合C/C；低于未经酶切的条带，大致为未经酶切片段一半大小，长度为356bp/371bp，为纯合突变型T/T；同时表现为具有上述两条带，为杂合子C/T基因型。
结果如图1，图2所示，从图1可见，扩增产物中有三种基因型，即野生型纯合C/C，纯合突变型T/T和杂合子C/T。从图2可见，酶切后三种基因型的产物结果清晰，无杂带，便于阅读，且与测序结果一致。

Claims (4)

1.一种检测人类MTHFR基因677位点的酶切方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)提取受试者血液基因组DNA；
(2)以人类MTHFR基因677位点附近序列设计特异性引物，
上游引物：GATGCTTGTTGGCCAAAGTACAAC，
下游引物：GATTTGCTTGGCTGCTCAAGG；
(3)使用步骤(2)中的特异性引物，以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，获得扩增产物，电泳检测扩增产物；
(4)采用限制性内切酶TaqI，TthHB8I，TaqaI中的任意一种酶切步骤(3)获得的扩增产物；
(5)电泳检测经步骤(4)酶切后的产物，并进行分型判断结果。
2.根据权利要求1所述的一种检测人类MTHFR基因677位点的酶切方法，其特征在于，步骤(3)中所述PCR扩增反应的条件为：95℃3分钟，1个循环；95℃变性30秒，60～65℃退火30秒，72℃延伸45秒，35～40循环；72℃延伸5～10分钟。
3.根据权利要求1所述的一种检测人类MTHFR基因677位点的酶切方法，其特征在于，步骤(4)中所述酶切的体系为：20μL反应体系，8μL受试者样品PCR产物，2μL10X酶切缓冲液，限制性内切酶1-5Unit。
4.根据权利要求1所述的一种检测人类MTHFR基因677位点的酶切方法，其特征在于，步骤(4)中所述酶切的条件为：65℃水浴或孵育箱中酶切2小时。
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