CN105687181B - 连翘苷元在制备治疗乙型病毒性肝炎药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，涉及连翘苷元在制备治疗乙型肝炎病毒药物中的用途。为了克服现有乙型病毒性肝炎治疗药物毒副作用大，治疗过程中易出现耐受性等不足，本发明提供一种治疗乙型病毒性肝炎的有效治疗药物。该治疗药物以连翘苷元为活性成分，其用于乙型病毒性肝炎患者治疗时，不仅具有直接抗乙型肝炎病毒的作用，而且能够抑制乙型肝炎病毒分泌HBsAg和HbeAg，更能修复病毒感染所导致的肝损伤，其疗效确切，毒副作用小，安全性和耐受性均较好，具有十分广泛的医疗应用前景。

Description

连翘苷元在制备治疗乙型病毒性肝炎药物中的用途

技术领域

本发明涉及连翘苷元的一种新的医药用途，特别涉及连翘苷元在制备治疗乙型病毒性肝炎药物中的用途，属于医药领域。

背景技术

乙型病毒性肝炎是由乙型病毒性肝炎病毒(HBV)引起的、以肝脏炎性病变为主并可引起多器官损害的一种病。本病广泛流行于世界各国，主要侵犯儿童及青壮年，少数患者可转化为肝硬化或肝癌。因此，它已成为严重威胁人类健康的世界性疾病，也是我国当前流行最为广泛、危害性最严重的一种病。乙型病毒性肝炎无一定的流行期，一年四季均可发病，但多属散发。近年来乙型病毒性肝炎发病率呈明显增高趋势。

慢性乙型病毒性肝炎治疗的目的是在肝脏发生明显损伤之前抑制HBV的复制。治疗的初期目标是抑制病毒复制，阻止肝脏损伤；治疗的远期目标是清除病毒，阻止疾病向肝硬化以及肝癌的发展，延长生存期。抗病毒治疗还用于防止肝移植后、化疗或免疫抑制治疗时乙型病毒性肝炎病毒的再复制。因为目前所有的抗病毒药物不能有效的清除HBV DNA，所以实现长期清除HBV的目标几乎不可能实现。慢性乙型病毒性肝炎的治疗有两种方式：免疫调节和抑制病毒。肝移植可用于对药物治疗无效的终末期肝病患者。

目前市场上治疗乙型病毒性肝炎的方法主要有注射干扰素类药物、服用阿德福韦酯，恩替卡韦等核苷类似物类药物以及注射乙型病毒性肝炎疫苗三种方式。但上述三种方式均存在比较大的缺点，长期服用干扰素会造成患者出现流感感样症状、并可能使患者出现消化道症状、脱发等不良反应。严重者还能抑制骨髓导致白细胞、血小板减少，这样就会导致患者的凝血功能下降。而服用阿德福韦酯，恩替卡韦等核苷类似物类则会导致乳酸性酸中毒和重度的脂肪性肝肿大，且很多患者服用半年左右就会耐药，而且还不能随时停药，否则可能会导致病情迅速恶化，甚至转化为肝硬化、肝癌。虽然乙型病毒性肝炎疫苗能够抑制HBV的复制，其安全性和耐受性都很好，但是还不足以打破乙型病毒性肝炎的免疫耐受状态进而清除HBV，仍需辅以抗乙型病毒性肝炎药物的治疗。

连翘为我国传统中草药，其味苦，性凉主治胆汁扩散引起的目、身发黄，协日热宿于五脏，肠刺痛，血协日性腹泻等症，现代植物化学研究显示，其果实中含木脂体类化合物:连翘苷(forsythin，phillyriy)，连翘苷元(Phillygenin)，右旋松脂酚(pipores-inol)；黄酮类化合物:芸香苷(rutin)；苯乙烷类衍生物:连翘酯苷(forsythoside)A、C、D、E，毛柳苷(salidroside)；乙基环己醇类衍生物:梾木苷(cornoside)，连翘环己醇(rengyol)，异连翘环己醇(sorengyol)，连翘环已醇氧化物(renyoxide)，连翘环己醇酮(rengydone)，连翘环己醇苷(rengyoside)A、B、C；三萜类化合物:白桦脂酸(betulinic acid)，齐墩果酸(oleanolicacid)，熊果酸(ursolic acid)。药理学研究显示，其具有多种药理活性，其水煎剂具有显著的抗肝损伤，抗炎解热作用，镇吐以及抗病原微生物作用，连翘苷及连翘苷元静脉注射后还具有明显的降压作用。

发表于2014年6月的《连翘酯苷A抗LPS介导大鼠类风湿性关节炎机制研究》一文中公开了连翘酯苷A可降低LPS刺激类风湿性关节炎组大鼠关节炎指数、抑制炎症因子IL-1β和IL-17蛋白翻译，影响抗氧化酶及自由基含量，最终发挥抗炎功效。

发明内容

为了克服现有乙型病毒性肝炎治疗药物毒副作用大，治疗过程中易出现耐受性等不足，本发明提供一种治疗乙型病毒性肝炎的有效治疗药物。该治疗药物以连翘苷元为活性成分，其用于乙型病毒性肝炎患者治疗时，疗效确切，毒副作用小，且连翘苷元的安全性和耐受性均较好，具有十分广泛的医疗应用前景。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

本发明请求连翘苷元的一种新的医药用途，即连翘苷元用于制备治疗乙型病毒性肝炎的药物中的应用。连翘苷元Phillygenin，其分子式为：C₂₁H₂₄O₆，结构式为：

本发明实施例9研究了连翘苷元体外抗HepG2.2.15细胞的作用，研究发现，连翘苷元对于HepG2.2.15细胞具有明显的细胞抑制作用，并且连翘苷元对HepG2.2.15细胞分泌HB_SAg和HBeAg有显著的抑制作用，连翘苷元浓度在50μg/ml时对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为70.9％和38.5％，提示连翘苷元在体外对于HBV具有较强的抑制作用。本发明实施例10研究了连翘苷元对鸭体内乙型病毒性肝炎病毒感染的治疗效果，研究证实连翘苷元对感染鸭血清DHBV-DNA水平的具有显著的抑制效果，并有抑制停药反跳的特点，停止给药后对乙型病毒性肝炎病毒仍有抑制作用。其中以连翘苷元高剂量组(5mg/kg)抑制效果最佳。本发明实施例11研究了连翘苷元对刀豆蛋白A(ConA)致小鼠肝损伤作用，结果显示：连翘苷元各剂量组能够修复ConA所导致的肝损伤，其能够显著降低小鼠血清ALT、AST，与连翘提取物组或连翘苷组相比，具有极显著性或显著性的差异，表明连翘苷元治疗肝损伤的效果优于连翘提取物或连翘苷。病理检测结果支持了上述实验结果。

本发明还提供适用于上述用途的包含连翘苷元的药物制剂，所述包含连翘苷元的药物制剂为其口服制剂或注射制剂，其中所述的口服制剂为其片剂、胶囊剂、或微乳制剂，所述的注射制剂为其注射液，其由连翘苷元和药用辅料组成，所述的药用辅料可以为乙醇、丙二醇、PEG400、PEG600、吐温80中的一种或多种。

本发明的药效试验结果说明连翘苷元注射剂对HBsAg和HBeAg均有明显的抑制作用，对感染鸭血清DHBV-DNA水平的抑制效果也尤为显著，并有抑制停药反跳的特点，因此，本发明的连翘苷元的注射剂治疗乙型病毒性肝炎病毒感染鸭有效，停药后对乙型病毒性肝炎病毒仍有抑制作用。

总之，本发明提供的连翘苷元注射剂同现有技术相比，具有如下突出的优势：

1.连翘苷元有较强的抗病毒活性，并且不会产生耐药性；本发明的体外药效试验结果说明连翘苷元不仅能够直接抑制乙型肝炎病毒的增殖，而且对于乙型肝炎病毒分泌的HBsAg和HBeAg均有明显的抑制作用，

2.连翘苷元对于体内抗乙肝病毒疗效确切，停药后不反跳；本发明药效实施例证实，连翘苷元对感染鸭血清DHBV-DNA水平的抑制效果也尤为显著，并有抑制停药反跳的特点。

3.连翘苷元能够修复乙型肝炎病毒感染导致的肝损伤，连翘苷元各剂量组能够修复乙型肝炎病毒所导致的肝损伤，其能够显著降低小鼠血清ALT、AST，与连翘提取物组或连翘苷组相比，具有极显著性或显著性的差异，表明连翘苷元治疗肝损伤的效果优于连翘提取物或连翘苷。

4.连翘苷元为从传统中药中提取得到的中药单体，其不良反应和毒副作用显著小于现有的化学治疗药物，并且连翘苷元在乙型肝炎时疗效确切，其治疗效果上显著优于连翘苷。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步说明本发明的发明内容，但应该理解，本发明实施例并不以任何方式限制本发明。凡在本发明基础上作出的等同替代均落入本发明请求专利保护的范围。

实施例1 连翘苷元注射液

制备工艺：将处方量的丙二醇和乙醇混合均匀，加入连翘苷元，搅拌溶解，加入处方量的0.9％氯化钠溶液，搅拌均匀，加入0.5％针用活性炭搅拌脱炭后分装即得。

实施例2 连翘苷元注射液

制备工艺：将处方量的PEG-400与乙醇混合，加入连翘苷元，搅拌溶解后加入0.9％氯化钠溶液至10000ml，搅拌均匀，加入0.5％针用活性炭搅拌脱炭后分装即得。

实施例3 连翘苷元注射液

制备工艺：将处方量的乙醇和吐温-80混合均匀，加入连翘苷元，搅拌溶解，加入注射用水至10000ml，搅拌均匀，加入0.5％针用活性炭搅拌脱炭后分装即得。

实施例4 连翘苷元注射液

制备工艺：取处方量的乙醇加入连翘苷元，搅拌溶解，加入注射用水至10ml，搅拌均匀，加入0.5％针用活性炭搅拌脱炭后分装即得。

实施例5 连翘苷元片剂

制备工艺：将主药及各辅料成分烘干、粉碎过筛预处理，将主药与糖分、乳糖、羧甲基纤维素钠混匀，以纯水作为粘合剂将混匀的物料制备软材，过20目筛制粒并于60度下干燥制备干颗粒，将硬脂酸镁加入到上述干颗粒总混，压片即得。

实施例6 连翘苷元胶囊剂

制备工艺：按胶囊剂常规制备工艺制备而成。

实施例7 连翘苷元微乳制剂

制备工艺：称取处方量薄荷油、辛酸油酸乙酯、1，2-丙二醇、聚乙二醇3350，混合后搅拌均匀，然后加入连翘苷元溶解，也可以超声波处理以加速溶解，得澄清浓缩液，即为连翘苷元微乳浓缩物。

实施例8 连翘苷元微乳制剂

制备工艺：称取处方量薄荷油、聚氧乙烯-23-月桂基醚、1，2-丙二醇，混合后搅拌均匀，然后加入连翘苷元溶解，也可以超声波处理以加速溶解，得澄清浓缩液，即为连翘苷元微乳浓缩物。

实施例9 连翘苷元体外抗HBV药效测定

1、HepG2.2.15细胞培养

本实验利用目前公认的研究HBV复制的细胞模型HepG2.2.15细胞为研究对象，实验中采用的HepG2.2.15细胞购买于中国典型微生物保藏中心。

细胞培养液为MEN培养液，每100ml含胎牛血清10ml，质量百分比浓度为3％的谷氨酰胺溶液1ml，G418380μg/ml，庆大霉素50U/ml；细胞消化液为含质量百分比为0.25％胰酶溶液，用Hanks液配制。

细胞培养方法：将HepG 2.2.15细胞解冻后，接种入25cm²培养瓶，浓度为1×10⁵个/ml，待细胞长满后，加0.25％胰酶37℃消化3-5分钟。加培养液吹打，l:3传代，每天收集上清，连续2周，冷藏待检。

2、连翘苷元对HepG2.2.15细胞增殖的抑制作用

用MTT法测定药物的细胞毒性，将连翘苷元用DMEM培养液稀释成浓度分别为100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml，12.5μg/ml的含药培养液；在96孔板每孔加入HepG2.2.15细胞100μl(细胞浓度为3×10⁵个细胞/ml)，37℃5％CO₂培养箱中培养。培养24小时后换用含药培养液，每个浓度4孔，每3天换同浓度含药培养液，37℃5％CO₂培养箱中继续培养8天。培养结束后，向每孔细胞中加入5μg/ml MTT 10μl，每孔中存留有上清100μl，37℃5％CO₂培养箱中培养4h后，酶标仪570/630nm波长测定OD值。空白对照及细胞对照各4孔。按照下述公式计算细胞抑制百分率。

细胞抑制百分率＝[(细胞对照0D值一药物作用组OD值)/(细胞对照OD值一空白对照OD值)]×100％。

表1连翘苷元对HepG2.2.15细胞增殖的抑制作用

连翘苷元的浓度(μg/ml)	OD	抑制率(％)
			100	0.217±0.035	71.2
50	0.636±0.011	15.6
			25	0.714±0.017	5.24
12.5	0.738±0.023	2.17
			空白对照	0.754±0.058	____

初步的细胞学实验显示，连翘苷元对于HepG2.2.15细胞具有明显的细胞抑制作用，因此其具有潜在的抑制乙型肝炎病毒的作用。

3、连翘苷元对HepG2.2.15细胞分泌HB_SAg和HBeAg的影响

96孔板每孔3×10⁵个细胞/ml2.2.15细胞100μl，37℃5％CO₂培养箱中培养。一天后，换用含药培养液，每个浓度4孔，将连翘苷元用DMEM培养液稀释成(50μg/ml，25μg/ml，12.5μg/ml，6.25μg/ml)，每3天换同浓度含药培养液，第9天收集培养上清，-20℃冰冻保存。ELISA检测试剂盒测定HBsAg和HBeAg，酶标仪540/630nm波长测定OD值。空白对照及细胞对照各4孔。

抑制百分率＝[(细胞对照OD值一药物作用组OD值)/(细胞对照OD值一空白对照OD值)]×100％。结果见表2。

表2连翘苷元对HepG2.2.15细胞分泌HB_SAg和HBeAg的影响

HBsAg和HBeAg是乙型病毒性肝炎病人血清中主要的标记，本实验结果显示连翘苷元对HepG2.2.15细胞分泌HB_SAg和HBeAg有显著的抑制作用，连翘苷元浓度在50μg/ml时对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为70.9％和38.5％，有显著性抑制作用。提示连翘苷元在体外有抗HBV细胞分泌HB_SAg和HBeAg作用。

实施例10 连翘苷元对鸭体内乙型病毒性肝炎病毒感染的治疗效果

本发明采用国内外公认的实验模型，在乙型病毒性肝炎病毒感染的鸭体内进行实验。

1.DHBV感染:50只雏鸭经胫静脉注射DHBV-DNA阳性鸭血清，每只0.2ml。在感染后7天取血，分离血清。70℃保存待检。

2.药物治疗试验：DHBV感染1日龄北京鸭随机分组，给药组分3个剂量腹腔注射给以实施例1制备的连翘苷元注射剂，分别为连翘苷元低剂量组(0.5mg/kg)、连翘苷元中剂量组(2.5mg/kg)、连翘苷元高剂量组(5mg/kg)，每天2次，连续给药10d，空白对照组，以生理盐水代替药物；阳性药物阿昔洛韦组(50mg/kg)，每天2次，连续10d。给药前，给药第5d、10d和停药后3d，分别自鸭腿胫静脉取血，分离血清，于-70℃保存待检。

3.检测方法：取上述待检鸭血清，每批同时点膜，测定鸭血清中DHBV-DNA的动态水平。按缺口翻译试剂盒说明书方法，用32p标记DHBV-DNA探针，作鸭血清斑点杂交，放射自显影膜片斑点，测定OD值(490nm)，计算血清DHBV-DNA密度，以杂交斑点OD值作为标本DHBV-DNA水平值。

4.药效计算:计算每组不同时间点血清DHBV-DNA水平，各组用药前后比较采用配对t检验，计算DHBV-DNA抑制率，比较各组鸭血清DHBV-DNA抑制率的动态变化。给药组与病毒对照组比较，采用成组t检验。DHBV-DNA抑制率＝(给药前OD值一给药后OD值)/给前OD值×100％。结果见表3。

表3连翘苷元注射剂对DHBV感染鸭血清DHBV-DNA水平的影晌

与空白对照组相比，^*p<0.05，^**p<0.01；与阿昔洛韦组相比，^#p<0.05，^##p<0.01

本实验通过鸭乙型病毒性肝炎模型证明了连翘苷元具有更好的抗鸭乙型病毒性肝炎病毒活性，乙型病毒性肝炎病毒感染鸭腹腔注射给以连翘苷元治疗，一天给药两次，连翘苷元各治疗组对感染鸭血清DHBV-DNA水平均有显著抑制作用，其中连翘苷元高剂量组(5mg/kg)对感染鸭血清DHBV-DNA水平的抑制效果尤为显著，并有抑制停药反跳的特点，停止给药后对乙型病毒性肝炎病毒仍有抑制作用。

实施例11 连翘苷元对刀豆蛋白A(ConA)致小鼠肝损伤作用的实验研究

刀豆蛋白(ConA)是一种被广泛应用可活化T细胞的有丝分裂原，ConA静脉注射小鼠体内后，大部分在肝脏内聚集，通过活化T淋巴细胞而致免疫性肝损伤，表明肝脏是ConA体内诱导毒性的靶器官。这一实验模型很好地模拟了人类病毒性肝炎、自身免疫性肝病等疾病，是筛选急性肝炎和暴发性肝衰竭治疗药物较理想的动物模型。

1.动物分组及给药

健康BALB/C小鼠，清洁级，60只，雌雄各半，体重(20±2)g，将小鼠按体重随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组、模型对照组、连翘提取物组(按照专利申请CN101085043B实施例2制备工艺制备得到连翘提取物)、连翘苷组(按照《中药化学》第188页，上海科学技术出版社，1987年出版，自制连翘苷，纯度大于97％)、连翘苷元低剂量组、连翘苷元高剂量组。各组分别给予下述药物：

正常对照组：等体积的生理盐水，灌胃给药

模型对照组：等体积的生理盐水，灌胃给药

连翘提取物组：50mg/kg连翘提取物，灌胃给药

连翘苷组：50mg/kg连翘苷，灌胃给药

连翘苷元低剂量组：5mg/kg连翘苷元，灌胃给药

连翘苷元高剂量组：10mg/kg连翘苷元，灌胃给药

按剂量每日给药一次，连续10d，末次给药后1h，除正常对照组外，其余每个组均给与ConA诱导肝损伤，具体方法为：小鼠尾静脉注射15mg/kg ConA。造模后，禁食，8h后小鼠摘眼球采血，分离血清，用于测定血清生化指标；取出肝脏以制备肝组织匀浆和肝组织病理学检查。其中，血清ALT和AST的测定方法为：小鼠造模后禁食不禁水8h，麻醉后取血，静置1h，3000r/min，离心15min取血清，冷藏4℃待用自动生化分析仪测ALT、AST。

2.数据处理

数据以

表示，采用SPSS15.0软件进行方差分析。

3.结果与讨论

由表4结果可知:(1)与正常对照组相比，模型对照组小鼠血清ALT、AST均显著升高。各给药组处理小鼠后，均能降低小鼠血清ALT、AST，与对照组相比具有统计学差异。连翘苷元各剂量组能够显著降低小鼠血清ALT、AST，与连翘提取物组相比，极显著性(P<0.01)差异，表明连翘苷元治疗肝损伤的效果优于连翘提取物。连翘苷元各剂量组能够显著降低小鼠血清ALT、AST，与连翘苷组相比，具有显著性(P<0.05)或极显著性(P<0.01)差异，表明连翘苷元治疗肝损伤的效果优于连翘苷。

表4连翘苷元对ConA致小鼠肝损伤的的影响

与正常对照组相比，^￥P<0.05，^￥￥P<0.01；

与模型对照组相比，^#P<0.05，^##P<0.01；

与连翘提取物组相比，^Ω<0.05，^ΩΩP<0.01；

与连翘苷组相比，^&P<0.05，^&&P<0.01。

(2)病理检测结果显示，正常对照组小鼠肝脏内可见多个肝小叶，肝索排列规整，肝小叶的结构清晰，门管区结构清楚，无明显炎细胞浸润和肝细胞坏死。模型对照组小鼠肝索排列紊乱，肝小叶结构破坏，有较多淋巴细胞和单核细胞浸润，可见小灶状肝细胞坏死。连翘苷元各组小鼠肝小叶结构基本保留，肝索排列基本规整，门管区有少量淋巴细胞、单核细胞浸润，未见明显肝细胞坏死，病变较模型对照组明显减轻。

以上通过具体实施方式进一步描述了本发明，任何等同替换对于本领域的技术人员来说都是显而易见的且包含在本发明之中。

Claims (7)

1.下述化合物在制备治疗乙型病毒性肝炎药物中的用途，所述化合物为连翘苷元，其化学结构式为：

，

该化合物通过抑制乙型肝炎病毒的增殖达到所述用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述包含连翘苷元的药物制剂为其口服制剂或注射制剂。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述包含连翘苷元的口服制剂为其片剂、胶囊剂、或微乳制剂。

4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述包含连翘苷元的的注射制剂为其注射液，其由连翘苷元和药用辅料制成。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的药用辅料可以为乙醇、丙二醇、PEG400、PEG600、吐温80中的一种或多种。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，连翘苷元能够抑制乙型肝炎病毒分泌HBsAg和HbeAg。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，连翘苷元能够修复乙型肝炎病毒感染所导致的肝损伤。