CN105671013B - 一种木糖还原酶突变体、基因工程菌及在生产木糖醇中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种木糖还原酶突变体、基因工程菌及在生产木糖醇中的应用。所述木糖还原酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明对木糖还原酶进行了8个氨基酸位点的突变，降低了其催化阿拉伯糖为阿拉伯糖醇的活性，提高了其转化木糖醇的选择性，生物转化产物中副产物阿拉伯糖醇已经检测不到，本发明可使生物转化生产木糖醇下游的分离步骤简化，降低生产成本，提高木糖醇产品的纯度。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和生物技术领域，尤其涉及一种木糖还原酶突变体、基因工程菌及在生产木糖醇中的应用。
背景技术
玉米芯半纤维素水解液是目前国内生产木糖醇的主要原料，其除主要成分木糖外，还含有葡萄糖、阿拉伯糖等其它成分。在木糖醇的工业化生产中，镍催化加氢时，其对半纤维素水解液中各种糖没有选择性，在催化木糖还原生产木糖醇时也会催化其它糖类生成相应的糖醇，影响了木糖醇的产品质量。所以，在进行化学催化之前，需要对半纤维素水解液中的木糖进行分离和纯化，尽可能除去水解液中的杂糖，这就需要额外的分离步骤，无疑增加了生产成本。作为水解液中含量仅次于木糖的阿拉伯糖，是木糖的同分异构体，与木糖的分离难度大，导致镍催化后产物中有阿拉伯糖醇的存在，而木糖醇中阿拉伯糖醇的去除更加困难，所以使用化学催化获得高纯度的木糖醇较为困难，成本较高。目前市场上高纯度的木糖醇的价格往往是普通木糖醇价格的几倍到十几倍(Ravella S R,Gallagher J,FishS,et al.Overview on commercial production of xylitol,economic analysis andmarket trends[M].D-xylitol.Springer.2012:291-306.)，因此提高木糖醇的纯度对提高其附加值有着重要的现实意义。
目前虽然有报道酵母可以利用半纤维素水解液生产木糖醇，然而天然存在的木糖还原酶，其对底物木糖没有绝对的专一性，在还原木糖的同时也可以催化其它多种糖类特别是阿拉伯糖，生成相应的醇，这就导致副产物阿拉伯糖醇的产生。此外，在产物中会残留一些杂糖，因为很多酵母在木糖存在的情况下，不能够利用阿拉伯糖、半乳糖等糖类，这样会增加下游产物分离成本(Yoon B H,Jeon W Y,Shim W Y,et al.L-arabinose pathwayengineering for arabitol-free xylitol production in Candida tropicalis[J].Biotechnol Lett,2011,33(4):747-753.)。虽然目前发现的绝大多数木糖还原酶选择性不高，但作为天然大分子，通过定向进化、饱和突变或定向改造提高底物专一性是完全可行的，并且有过很多成功的例子。Woodyer等从粗糙脉孢菌中分离到一株木糖还原酶，其对木糖的催化效率是阿拉伯糖的2.4倍，进行静息细胞转化实验时可以显著提高产物中木糖醇的比例(Woodyer R,Simurdiak M,van der Donk W A,et al.Heterologous expression,purification,and characterization of a highly active xylose reductase fromNeurospora crassa[J].Appl Environ Microbiol,2005,71(3):1642-1647.)。为了进一步提高木糖还原酶对木糖的选择性，Nair等对其进行了定向进化，获得了一个对阿拉伯糖选择性提高50倍的突变体，在进行静息细胞转化时，阿拉伯糖醇含量显著减少，但并没有完全消除(Nair N U,Zhao H.Evolution in reverse:engineering a D-xylose-specificxylose reductase[J].ChemBioChem,2008,9(8):1213-1215.)；为了更进一步提高生物催化的选择性，Nair等构建了一株能有效利用阿拉伯糖作为碳源的大肠杆菌(crp*)，此菌联合获得的突变酶在等比例转化葡萄糖、木糖和阿拉伯糖时，产物中已检测不到阿拉伯糖醇。但是在试验中使用相同的突变酶，使用大肠杆菌(野生型crp)转化半纤维素水解液时，摇瓶发酵实验中有少量阿拉伯糖醇产生，但在发酵罐发酵中水解液中几乎所有阿拉伯糖都转化成阿拉伯糖醇(Su B,Wu M,Zhang Z,et al.Efficient production of xylitol fromhemicellulosic hydrolysate using engineered Escherichia coli[J].Metab Eng,2015,31(112–122.))。
在阿拉伯糖进入细胞后，可以从以下两个方面着手减少阿拉伯糖醇的产生：1)木糖还原酶的表达量相对于代谢阿拉伯糖的酶来说，不能过量太多，否者会阻隔阿拉伯糖和代谢阿拉伯糖的酶，导致阿拉伯糖被还原而不会被代谢，所以控制好木糖还原酶的表达量对生产高纯度木糖醇至关重要；2)提高木糖还原酶的选择性，使其对阿拉伯糖的催化活性降低甚至无活性，这样即使有大量木糖还原酶表达也不会造成阿拉伯糖醇的产生，但目前来说获得对木糖绝对专一的木糖还原酶还是比较困难的。为了获得较高的生产效率和高纯度的木糖醇，只有结合这两种策略，才能达到目的。
发明内容
基于现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种对木糖选择性高的木糖还原酶突变体。
一种木糖还原酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
该木糖还原酶突变体来源为将来自粗糙脉孢菌的木糖还原酶的8个氨基酸分别进行突变，8个氨基酸分别突变为：L102V，L107M，L109Q，I110C，V114I，KSN271-273RTT，这些突变点都是对阿拉伯糖识别影响较大而对木糖的识别没有太大影响，经过这些点突变后，所得的木糖还原酶突变体对底物木糖的选择性会大大提高，降低在木糖醇生产中对阿拉伯糖的识别催化。获得的木糖还原酶突变体命名为XR-8M。
本发明还提供了编码所述木糖还原酶突变体的基因，命名为xr-8m，基因序列如SEQ ID No.2所示。当然，由于密码子的简并性，根据所使用的表达菌的种类不同，可进行适当的密码子优化。
本发明还提供了所述木糖还原酶突变体在生产木糖醇中的应用。
本发明还提供了一种基因工程菌，包含所述的基因。转基因方式可以是质粒表达，也可以是将外源基因整合到基因组上，形成稳定表达外源基因的整合型工程菌。
所述基因工程菌的宿主细胞可以是大肠杆菌、酵母或其他常用于表达外源基因的宿主细胞。优选的，所述基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌。大肠杆菌相对其他宿主细胞来说，结构简单，发酵条件较简单，成本低，在高效表达目的基因的前提下，首先选用大肠杆菌。
优选的，所述木糖还原酶突变体基因整合到大肠杆菌的基因组上，获得整合型工程菌。基因整合进基因组后，不存在质粒分离不稳定的问题，也不需要添加抗生素，在降低生产成本的同时，减少了抗药性的问题，并且其表达不需要诱导剂，进一步降低生产成本。
优选的，所述木糖还原酶突变体基因的拷贝数不小于2。拷贝数的增加有利于提高目的蛋白表达量，但增加到一定数量后，由于基因工程菌本身所限，目的蛋白表达量不再增加，而对基因工程菌的负担却加重了，这样反而不利于目的蛋白的有效高表达。所以筛选合适的拷贝数是需要的。
优选的，所述木糖还原酶突变体基因上游的启动子为组成型启动子P43。实验表明，含启动子P43的表达载体转化大肠杆菌后得到的基因工程菌在木糖醇生产中的生产效率更高，并且不需要昂贵的诱导剂，所以，优选组成型的P43启动子。
本发明又提供了所述基因工程菌在生产木糖醇中的应用。将包含所述基因工程菌的种子液接种至装有发酵培养基的发酵罐中，培养一段时间后，向发酵液中添加玉米芯半纤维素水解液(酸解中和获得)，继续进行发酵，发酵完成后，将发酵产物进行分离纯化获得木糖醇。
本发明对木糖还原酶进行了8个氨基酸位点的突变，降低了其催化阿拉伯糖为阿拉伯糖醇的活性，提高了其转化木糖醇的选择性，生物转化产物中副产物阿拉伯糖醇已经检测不到，本发明可使生物转化生产木糖醇下游的分离步骤简化，降低生产成本，提高木糖醇产品的纯度。
附图说明
图1为利用大肠杆菌生产高纯度木糖醇策略流程图；
图2为来源于不同微生物的木糖还原酶氨基酸序列保守性分析图；
图3为转入不同木糖还原酶突变体基因的工程菌木糖醇生产性能比较图，
其中，(A)HK442，(B)HK452，(C)HK412，(D)HK462；
图4为菌株HK462利用半纤维素水解液生产木糖醇发酵结果图；
图5为菌株IS5-d利用半纤维素水解液生产木糖醇发酵结果图；
图6为菌株IS5-M利用半纤维素水解液生产木糖醇发酵结果图。
Concentration(g/L)：浓度(g/L)；Time(h)：发酵时间(h)；Glucose：葡萄糖；Xylose：木糖；Arabinose：阿拉伯糖；Xylitol：木糖醇；Arabitol：阿拉伯糖醇；OD600：细胞浓度；Xylose reductase activity：木糖还原酶总酶活
具体实施方式
本发明是在申请号为201510196843.8、名为“大肠杆菌基因组整合载体、基因工程菌以及在生产木糖醇中的应用”发明专利申请的基础上做的进一步研究。
上述发明专利申请中公开了一种大肠杆菌基因组中的拷贝数较多的IS序列作为整合位点，进行载体与基因组的整合，不仅整合方法简单，而且整合到基因组上的目的基因遗传稳定，既解决了质粒作为表达载体时，工程菌代谢负担重、分离不稳定和蛋白表达不可控的问题，又简化了现有的整合技术，解决了现有整合技术多拷贝整合繁琐、耗时等问题。
下列实施例中，质粒pRC43、pTrc99a-rbs-xr6600和菌株HK401、IS5-d，HK412以及XR基因均来自申请号为201510196843.8、名为“大肠杆菌基因组整合载体、基因工程菌以及在生产木糖醇中的应用”的发明专利申请文献中。
实施例1木糖还原酶专一性改造
由于天然木糖还原酶专一性较差，可以将阿拉伯糖催化还原成阿拉伯糖醇；在申请号为201510196843.8的发明专利申请文献中使用选择性已经提高50倍的XR(经过5个点突变)，但在发酵罐发酵中阿拉伯糖还是几乎全部转化成阿拉伯糖醇。所以，木糖还原酶的选择性还有待提高；为了进一步降低木糖还原酶对阿拉伯糖的催化活性，我们对选择性已经提高50倍的木糖还原酶进行了定点突变。
以质粒pTrc99arbs-xr6600为模板，采用大引物全质粒PCR方法，使用引物poit-M1-F和poitM1-R对其进行定点突变，引入的突变为KSN271-273RTT，转入HK401获得菌株HK462；使用野生型木糖还原酶基因构建质粒pTrc99a-xr-WT，转入HK401获得菌株HK442；使用引物poit-M1-F和poit-M1-R，对野生型木糖还原酶进行3个点的突变(KSN271-273RTT)，构建质粒pTrc99a-xr-3，转入HK401获得菌株HK452。上述表达载体构建过程中采用的引物以及PCR反应体系和反应条件如下：
(1)引物序列：
poit-M1-F：5’-CATCATCCCCCGCACTACCCGCGAGGCCACCATGA-3’；
poit-M1-R：5’-TCATGGTGGCCTCGCGGGTAGTGCGGGGGATGATG-3’。
(2)PCR反应体系：
体系总体积为50μL，其中PrimerSTAR Max DNA Polymerase 25μL，上下游引物(10μM)各1.5μL，模板(50ng/μL)1μL，ddH2O 21μL。
(3)PCR反应程序：
95℃预变性2min；98℃变性10s，Tm退火15s，72℃延伸5s/kb，30个循环；72℃延伸5min，4℃保温。其中Tm为引物退火温度，具体延伸时间由扩增长度乘以5s/kb得到。
将各基因工程菌经活化后接种于LB培养基(酵母膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L)，诱导表达后分别在30℃下培养15h，将细胞培养物菌体浓度调成一致(OD600＝2.0)，10000×g离心5min，收集菌体，用50mM磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 7.4)清洗3次，并重新悬浮，超声破碎，10000×g离心10min，将沉淀和上清分离，上清用来测定粗酶酶活。
木糖还原酶酶活测定根据NADPH在30℃条件下的氧化水平，采用分光光度法测定，检测波长340nm。木糖还原酶的酶活采用标准的反应体系进行测定，反应体系为1mL，含200μM NADPH，0.5M木糖(50mM MOPS pH 6.3溶解)，添加适量的酶溶液启动反应。酶活力定义：1单位(U)为1min催化1μM NADPH所需要的酶量。其中，发酵活力表示1L发酵液中的木糖还原酶活力，单位：U/L。
木糖还原酶对阿拉伯糖还原活性的测定与木糖还原活性类似，只是将其中的木糖换成阿拉伯糖。
所得结果如表1所示，本发明八个点突变的木糖还原酶突变体虽然木糖还原活性有所下降，但对阿拉伯糖的还原活性较野生型降低到原来的3.6％。
表1 不同突变体木糖还原酶对木糖和阿拉伯糖的还原活性比较。
| 菌株 | 木糖还原活性 | 阿拉伯糖还原活性 |
| HK442 | 18.97±3.86 | 22.44±4.32 |
| HK412 | 16.32±2.98 | 3.06±1.21 |
| HK452 | 31.62±5.33 | 28.76±4.78 |
| HK462 | 9.6±1.67 | 0.81±0.11 |
实施例2含有不同突变酶基因工程菌产木糖醇能力的测试
将基因工程菌HK442，HK452，HK412，HK462按2％接种于45mL改良M9培养基(1L培养基中含4～6g Na2HPO4，2～5g KH2PO4，1～2g NH4Cl，1～5g NaCl，1～5mmol MgSO4，1～5mmolCaCl2，2～10g酵母膏)中，于30℃下培养至OD600为0.6～1，添加适量诱导剂IPTG并向发酵液中添加木糖至终浓度为20g/L、添加葡萄糖至终浓度为10g/L，添加阿拉伯糖至终浓度为5g/L，于30℃继续培养，考察各工程菌的发酵特性，结果如图3所示，各基因工程菌在0.1mMIPTG诱导后木糖醇的生产效率并无显著差别。
实施例3整合型菌株IS5-M的构建
以质粒pRC43为模板，采用大引物全质PCR方法，使用引物poit-M1-F和poitM1-R对其进行定点突变，获得质粒pRC43M。使用申请号为201510196843.8的发明专利申请文献中的基因组多拷贝整合方法，将木糖还原酶突变体基因xr-8m整合进大肠杆菌基因组，获得菌株IS5-M。
实施例4利用基因工程菌HK462、IS5-d和IS5-M生产木糖醇的应用实例
(1)将工程菌HK462、IS5-d和IS5-M按2％分别接种过夜的种子培养基中，于30℃下培养8h，获得种子液；
种子培养基及发酵培养基的配方为：1L培养基中含4～6g Na2HPO4，2～5g KH2PO4，1～2g NH4Cl，1～5g NaCl，1～5mmol MgSO4，1～5mmol CaCl2，10～20g蛋白胨，2～8g酵母膏。
(2)将种子液按10％分别接种至装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，于30℃下培养至OD600为5～15(约4h)时，向发酵液中添加玉米芯半纤维素水解液(酸解获得)使其木糖终浓度为100g/L、葡萄糖终浓度为50g/L，于30℃培养，其中菌株HK462需添加0.1mM IPTG进行诱导，定点采集样品测定各种糖、木糖醇和阿拉伯糖醇的含量。
分析条件：Dionex UltiMate 3000高效液相系统，Corona Charged Aerosol电喷雾检测器，Aminex HPX-87C(7.8mm×300mm)糖柱，流动相为纯水(0.6mL/min，76℃)。
考察工程菌HK462、IS5-d和IS5-M发酵液中的发酵特性，结果如图4～6所示。
如图4所示，工程菌K462能快速转化木糖生产木糖醇，发酵液中，木糖醇最终浓度能达到132.8g/L，生产效率为1.30g/L/h，但还是产生了4.89g/L的阿拉伯糖醇。
如图5所示，工程菌IS5-d也能快速转化木糖生产木糖醇，发酵液中，木糖醇最终浓度能达到107.0g/L，生产效率为1.49g/L/h，只产生了0.78g/L阿拉伯糖醇，比使用质粒的菌株减少了84％。
如图6所示，工程菌IS5-M也能快速转化木糖生产木糖醇，发酵液中，木糖醇最终浓度能达到97.34g/L，生产效率为1.35g/L/h，最终产物中已检测不到阿拉伯糖醇。
Claims (9)
1.一种木糖还原酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.编码如权利要求1所述的木糖还原酶突变体的基因。
3.一种基因工程菌，其特征在于，包含如权利要求2所述的基因。
4.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，宿主细胞为大肠杆菌。
5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因整合到大肠杆菌的基因组中。
6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因上游的启动子为组成型启动子P43。
7.如权利要求3～6任一所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因的拷贝数不小于2。
8.如权利要求4所述的基因工程菌在生产木糖醇中的应用。
9.如权利要求1所述的木糖还原酶突变体在生产木糖醇中的应用。
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| Selective reductionofxylosetoxylitolfromamixture of hemicellulosicsugars;Nikhil U.Nair，HuiminZhao;《Metabolic Engineering》;20100504;第12卷;摘要，第462页左栏第1段至第467页右栏最后1段 |
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