CN105670946A - 一种培养基、生物转化菌丝体、提取物及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种培养基、生物转化菌丝体、提取物及用途，所述培养基包括如下重量份的组分：麦麸490～350份，玉米面140～100份，谷糠63～45份，白糖7～5份，银杏叶300～500份，水400～600份；生物转化菌丝体的制备方法为：将猴头菌类菌株接种至所述的培养基中，在20～27℃下，猴头菌培育30～40天，烘干得到；提取物的制备方法为：将生物转化菌丝体进行水提，得到提取液，将提取液减压浓缩，抽真空干燥，得到提取物；所述提取物能显著增加凝血活性，具有显著的抗凝血作用，因此可应用于制备抗凝血药物或保健食品。

Description

一种培养基、生物转化菌丝体、提取物及用途
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种培养基、生物转化菌丝体、提取物及用途。
背景技术
血液凝固(bloodcoagulation)是指血液由流动的液体状态变成不能流动的凝胶状态的过程，是生理性止血过程的重要环节。血液凝固的实质就是血浆中的可溶性纤维蛋白原转变成不溶性的纤维蛋白的过程。当形成的纤维蛋白交织成网时，可把血细胞及血液的其他成分网罗在内，从而形成血凝块。血液凝固是一系列复杂的酶促反应过程，需要多种凝血因子的参与。凝血酶原的激活是在凝血酶原酶复合物作用下进行的。因此，凝血过程可分为凝血酶原酶复合物的形成、凝血酶原激活和纤维蛋白生成三个基本过程。凝血酶原酶复合物的形成有内源性凝血和外源性凝血两条途径。
内源性凝血途径，当血液与带负电荷的胶原蛋白(皮肤血管外壁)或异体表面(如高岭土、玻璃等)接触时，因子Ⅻ就由酶原激活成Ⅻa，后者除能激活因子Ⅺ外，又同时使血浆前缓激肽释放酶激活。激活后的激肽释放酶在高分子量激肽原的促进下反过来又进一步使因子Ⅻ激活，但此时不再是接触激活而是肽键水解激活，使成为因子Ⅻf。这是一正反馈效应，不论Ⅻa或Ⅻf都具有相同的活力。激活后的Ⅻa在Ca2+存在下接着又使因子Ⅸ激活。活化的因子Ⅸa在Ca2+与磷脂存在下与因子Ⅷ形成复合物,使因子Ⅹ激活为因子Ⅹa。激活后的因子Ⅹ与Ca2+、磷脂及因子Ⅴ共同形成一复合物，后者最终使凝血酶原激活为凝血酶。活化的凝血酶能使可溶性纤维蛋白原转变成不溶性的纤维蛋白。本次采用的体外试管法测定凝血活性，原理也即家兔全血接触玻璃试管后，启动内源性凝血通路，最终导致血凝块的形成。
外源性凝血途径，体内组织损伤时释放出因子Ⅲ，也称为组织因子。在Ca2+存在下它能与血液中已活化的因子Ⅷ形成复合物，就能使因子Ⅹ激活，此后就与内源性激活途径的反应步骤相同。通过外源性途径血液凝固在10多秒钟内即可完成，而通过内源性途径则需数分钟。
银杏叶中含有天然活性黄酮及苦内酯等与人体健康有益的多种成份，具有溶解胆固醇，扩张血管的作用，对改善脑功能障碍、动脉硬化、高血压、眩晕、耳鸣、头痛、老年痴呆、记忆力减退等有明显效果。其防病、治病、健身的价值在明代《本草纲目》中早有记载。经国家卫生部门检测证明：饮用银杏茶可明显降低血清胆固醇、甘油三脂和低密度血脂蛋白，减少体内贮存脂肪的作用。对于高血脂的调节、高血压和冠心病等心脑血管系统疾病患者辅助性防治以及肥胖型人群的减肥等有良好的功效，是预防治疗老年痴呆的理想饮品。是目前世界公认的治、防心脑血管疾病最理想的药物成份。
猴头菌丝体中的活性物质最重要的是多糖及糖蛋白，目前国内外对猴头多糖的研究表明，猴头菌多糖具有多种生物活性和药理作用，能增强巨噬细胞的吞噬功能，促进溶血素的形成，抗白细胞下降，降血糖、抗凝血、抗血栓、抗突变和抗衰老等。因此，猴头菌多糖备受人们关注，成为近年来分子生物学、医药、食品科学等领域研究和开发应用的热点。
生物转化“菌丝体”是指利用菌丝体(包括真菌)的代谢功能，使有机物分解的生物化学反应过程。以适宜的培养基为营养，通过菌丝体的生长代谢和生命活动产生丰富的次生代谢产物。借鉴中医药组方思想，将单味中药、具有类似或协同作用的中药作为部分培养基进行菌丝体转化，目的是产生新化合物、增强功效或者降低单一药物不良作用。
据文献查询，猴头菌丝体未有抗凝血作用。银杏叶敛肺，平喘，活血化瘀，止痛，用于肺虚咳喘，冠心病，心绞痛，高血脂，抗凝固，有一定概率提高记忆力。
中国专利申请号为200710190182.3的专利申请公开了一种猴头菌转化银杏叶提取物的制备方法及用途，以猴头菌为出发菌株，进行一级种子培养和发酵培养，得到具有降低血糖的猴头菌发酵液；发酵培养基组成为：葡萄糖10-40g/l，麸皮1-5g/l，蛋白胨2-10g/l，玉米粉5-20g/l，MgSO4·7H200-1g/l和磷酸二氢钾0.1-2g/l，碳酸钙1-10g/l，0.2-5％的EGB，发酵培养的条件是：温度为20-35℃，搅拌速率80-200rpm，初始pH为4.0-7.5，通气量0.1:1-2:1。其用于预防或治疗糖尿病的药物或保健品。
猴头菌转发银杏叶提取物(EGB)工艺条件的研究，食品科学，2007，Vol.28,No.10，公开了猴头菌转化EGB的最适pH为6.0，温度为27℃，EGB添加量为0.5％，无需采用补加工艺。在20L发酵罐中扩大培养时，猴头菌转化EGB的最佳工艺条件为72h前通气量为8L/min，72h后为4.8L/min，转速为120r/min。其发酵培养基(单位：g/L)为：麸皮10，玉米粉10，葡萄糖20，蛋白胨4，磷酸二氢钾1.2，硫酸镁0.6。
上述两篇文献中载明的都是猴头菌转化银杏叶提取物的技术，一方面，银杏叶提取物的价格相比银杏叶更贵，另一方面，转化后得到的产物主要用于降血糖和抑制非酶糖基化反应。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种培养基、生物转化菌丝体、提取物及用途，所述提取物的制备方法简单，成本较低，产物用于制备抗凝血药物。
本发明所述培养基包括如下重量份的组分：
麦麸490～350份，玉米面140～100份，谷糠63～45份，白糖7～5份，银杏叶300～500份，水400～600份。
优选的，所述培养基包括如下重量份的组分：
麦麸420份，玉米面120份，谷糠54份，白糖6份，银杏叶400份，水500份。
本发明还提供一种生物转化菌丝体，制备方法为：将猴头菌类菌株接种至所述的培养基中，在20～27℃下，猴头菌培育30～40天，烘干，得到生物转化菌丝体。
本发明的猴头菌为猴头菌科真菌猴头菌(Hericiumerinaceum(Bull.exFr.)Pers.)。
所述生物转化菌丝体是猴头菌科真菌猴头菌(Hericiumerinaceum(Bull.exFr.)Pers.)的菌丝体与其附生含有银杏叶成份的固体培养基的干燥混合物。
本发明还提供一种提取物，制备方法为：
(1)将生物转化菌丝体进行水提，50-70℃下用水浸泡，水的重量为生物转化菌丝体重量的6～10倍，得到提取液；
(2)将上述提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在50-70℃条件下抽真空干燥，得到提取物。
优选的，水浸泡或抽真空干燥的温度为60℃。
本发明还提供一种提取物在制备抗凝血药物或保健食品中的用途。
猴头菌丝体具有较弱抗凝血作用，银杏叶的抗凝血活性在加工过程中大大损失。猴头菌是一种药用真菌，能很好地吸收培养基中营养，彻底转化培养基，产生新的活性物质及代谢物，为此，本发明将银杏叶加入到培养基中，并对培养基的组分和含量进行调配，猴头菌对银杏叶进行中药菌丝体转化，得到新的菌丝体，本发明对所得的生物转化菌丝体进行提取，得到的提取物进行了体外抗凝血实验，结果发现，水提样品以APTT为评价指标，体外抗凝血作用由强到弱为：生物转化菌丝体＞银杏叶药材≈猴头菌丝体＞空白对照，HD转化物体外抗凝血活性比银杏叶药材高5.548倍；比猴头菌丝体高7.137倍。该生物转化菌丝体提取物能显著增加凝血活性，具有显著的抗凝血作用，因此可应用于制备抗凝血药物或保健食品。
本发明低温水浸泡生物转化菌丝体，在50-70℃下水浸泡，无温度破坏，既能溶解有效成分但又不破坏有效成分；50-70℃减压浓缩，不会破坏有效成分，特别是活性酶类物质；为了不影响有关活性物质，本发明优选采用60℃条件下抽真空干燥。
具体实施方式
实施例1
一种生物转化菌丝体提取物，其制备方法包括如下步骤：
(1)取农副产品麦麸490g、玉米面140g、谷糠63g、白糖7g，以及中药材银杏叶粗粉(银杏叶)300g，混匀，加入约500g水拌匀，即得培养基。再装瓶、灭菌，接入猴头菌，在27℃条件下转化培养40天，取出菌丝体，烘干，即得生物转化菌丝体；
(2)取生物转化菌丝体，60℃水浸泡2次，每次浸泡2小时，水的重量为生物转化菌丝体重量的6倍；
(3)将提取后获得的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在60℃条件下抽真空干燥，即得提取物。
实施例2
一种生物转化菌丝体提取物，其制备方法包括如下步骤：
(1)取农副产品麦麸420g、玉米面120g、谷糠54g、白糖6g，以及中药材银杏叶粗粉(银杏叶)400g，混匀，加入约500g水拌匀，即得菌丝体培养基；再装瓶、灭菌，接入猴头菌，在20℃条件下转化培养35天，取出菌丝体，烘干，即得生物转化菌丝体；
(2)取生物转化菌丝体，60℃水浸泡3次，每次浸泡3小时，水的重量为生物转化菌丝体重量的8倍；
(3)将提取后获得的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在60℃条件下抽真空干燥，即得提取物。
实施例3
一种生物转化菌丝体提取物，其制备方法包括如下步骤：
(1)取农副产品麦麸350g、玉米面100g、谷糠45g、白糖5g，以及中药材银杏叶粗粉(银杏叶)500g，混匀，加入约500g水拌匀，即得菌丝体培养基；再装瓶、灭菌，接入猴头菌，在25℃条件下转化培养30天，取出菌丝体，烘干，即得生物转化菌丝体；
(2)取生物转化菌丝体，50℃水浸泡3次，每次浸泡4小时，水的重量为生物转化菌丝体重量的10倍；
(3)将提取后获得的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在70℃条件下抽真空干燥，即得提取物。
实施例4
银杏叶掺入比例对比试验
猴头菌丝体生物转化产业化培养已经很成熟，原料投料以干料计，比率固定为：麦麸70％、玉米粉20％、谷糠9％、白糖1％，本发明把中药材银杏叶作为培养基之一，中药材银杏叶参入的比率分别占30％、40％、50％，设计实验方案，总投料5000g，分别按上述实施例1、实施例2、实施例3配制培养基，加水混匀、灭菌、接种、培养，平行对照，培养条件完全一致，培养过程中观察菌丝体生长状况、生长周期、污染情况、生长速度，挖瓶后烘干称重计算收率，检测样品中的纤维素酶、麦角甾醇含量(考察转化是否彻底)、银杏总黄酮醇苷含量、萜类内酯含量，干燥后的样品分别标注为HY-1、HY-2、HY-3。试验结果统计如下表：
分组编号 HY-1 HY-2 HY-3
培养前物料总重(g) 5000g 5000g 5000g
培养过程中污染比率(％) 8.5％ 8.0％ 16.2％
生长周期(天) 34天 35天 40天
生长速度(mm/天) 4.70mm/天 4.57mm/天 4.00mm/天
纤维素酶含量(U/g) 178U/g 184U/g 142U/g
麦角甾醇含量(mg/g) 0.62mg/g 0.65mg/g 0.46mg/g
银杏叶总黄酮醇苷含量 0.20％ 0.40％ 0.42％
银杏叶萜类内酯含量 0.12％ 0.26％ 0.28％
试验结果表示：银杏叶占50％时污染率高、生长速度慢、生长周期长、纤维素酶麦角甾醇含量低，生物转化不彻底；而银杏叶占30％时生长速度较快、生长周期短，但银杏叶总黄酮醇苷、萜类内酯含量低；银杏叶占40％比率时最为合适，菌丝体生长情况较好，兼顾各优势，为最佳比率。
实施例5
提取物体外抗凝血效果比较试验
1.猴头菌丝体、生物转化菌丝体、银杏叶药材3种药材提取方法
分别称取猴头菌丝体、生物转化菌丝体、银杏叶药材3种药材3份，粉碎成10目～80目的粉末，60℃水浸泡3次，每次浸泡3小时，水的重量为样品重量的8倍；将提取后获得的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在60℃条件下抽真空干燥，即得提取物，取提取物加水溶解，定容，使相当于生药材量1g/mL药液。
猴头菌菌丝体为：《中国药典》2015年版，1614～1615页记载了猴头菌丝体，本发明所述的猴头菌丝体是该标准记载的猴头菌丝体。
2.人血浆的制备：用含3.8％柠檬酸钠的采血真空管收集人全血(全血：3.8％柠檬酸钠＝9:1)，摇匀，2500r/min离心10min，用滴管收集上层黄色液体，即血浆，分装成数管，密封，放入-20℃冰箱冷冻保存，用时解冻。
3.空白血浆的制备：取生理盐水5μL置于245μL血浆中，摇匀，即得。
4.药液及待测血浆处理方法
取1g/ml药液，过0.45μm微孔滤膜，精密吸取5μL药液，置于245μL血浆中，摇匀，用涡流混匀器振荡混合30秒，备用。
5.体外抗凝血试验PT及APTT测定结果
(1)按“体外抗凝血试验操作”测定各样品液PT和APTT，见表1。
表13种药材水提取人血浆体外抗凝血试验测定结果(n＝3)
对表1结果采用完全随机t检验LSD法，结果见表2。
表23种药材水提取人血浆体外抗凝血试验APTT和PT方差分析表
由表2结果可知，3种药材水提取PT无统计意义，而APTT有统计意义，再进一步进行两两比较的LSD检验，结果见表3。
表3APTT用LSD法多重比较(下三角为均值差,上三角为显著水平)
由表3结果可知，以APTT为评价指标，体外抗凝血作用由强到弱为：生物转化菌丝体＞银杏叶药材≈猴头菌丝体＞空白对照，HD转化物体外抗凝血活性比银杏叶药材高5.548倍；比猴头菌丝体高7.137倍。3样品抗凝血活性皆高于空白对照。
6、用50％醇提样品抗凝血活性比较情况。分别称取猴头菌丝体、生物转化菌丝体、银杏叶药材3种药材3份，粉碎成10目～80目的粉末，60℃50％乙醇浸泡3次，每次浸泡3小时，乙醇的重量为样品重量的8倍；将提取后获得的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在60℃条件下抽真空干燥，即得提取物，取提取物加水溶解，定容，使相当于生药材量1g/mL药液，过滤。
按“体外抗凝血试验操作”测定各样品液PT和APTT，见表4。
表43种药材50％醇提人血浆体外抗凝血试验测定结果(n＝3)
对表4结果采用完全随机t检验LSD法，结果见表5。
表53种药材50％醇提人血浆体外抗凝血试验APTT和PT方差分析表
由表5结果可知，3种药材50％醇提APTT没有统计学意义，PT有统计意义，再进一步进行两两比较的LSD检验，结果见表6。
表6APTT和PT用LSD法多重比较(下三角为均值差,上三角为显著水平)
由表6结果可知，以APTT为评价指标，体外抗凝血作用无统计学意义：银杏叶≈猴头菌丝体≈生物转化菌丝体≈空白对照；以PT为评价指标，体外抗凝血作用由强到弱为：生物转化菌丝体>空白对照>猴头菌丝体>银杏叶。
结论：醇提样品抗凝血活性不如水提，水提样品以APTT为评价指标，体外抗凝血作用由强到弱为：生物转化菌丝体＞银杏叶药材≈猴头菌丝体＞空白对照，HD转化物体外抗凝血活性比银杏叶药材高5.548倍；比猴头菌丝体高7.137倍。3样品抗凝血活性皆高于空白对照。
实施例6
取本发明实施例1作为实验例。
取下述文献得到的提取物作为对比例1，对比例1：中国专利申请号为200710190182.3的专利申请公开了一种猴头菌转化银杏叶提取物的制备方法及用途，发酵培养基组成为：葡萄糖40g/l，麸皮5g/l，蛋白胨10g/l，玉米粉20g/l，MgSO4·7H201g/l和磷酸二氢钾2g/l，碳酸钙10g/l，5g/l的EGB(银杏叶提取物)，按照200710190182.3文件中记载的方法得到发酵液，将发酵液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在60℃条件下抽真空干燥，即得提取物，作为对比例1的提取物。
取提取物作为对比例2，对比例2：将发酵培养基中的EGB换为银杏叶粗粉，其它条件和对比例2相同。
取提取物作为对比例3，对比例3：发酵培养基配方为：葡萄糖40g，麸皮5g，蛋白胨10g，玉米粉20g，MgSO4.7H201g和磷酸二氢钾2g，碳酸钙10g，5g的EGB，46.5g水，按照本发明实施例1的方法，将猴头菌接种至上述培养基中，在20～27℃条件下转化培养30～40天，取出菌丝体，烘干，即得生物转化菌丝体；取生物转化菌丝体，60℃水浸泡2次，每次浸泡2小时，水的重量为生物转化菌丝体重量的6倍；将提取后获得的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在60℃条件下抽真空干燥，即得提取物。
取提取物作为对比例4，对比例4：发酵培养基配方为：葡萄糖40g，麸皮5g，蛋白胨10g，玉米粉20g，MgSO4.7H201g和磷酸二氢钾2g，碳酸钙10g，25g的银杏叶粗粉，57g水，按照本发明实施例1的方法，将猴头菌接种至上述培养基中，在20～27℃条件下转化培养30～40天，取出菌丝体，烘干，即得生物转化菌丝体；取生物转化菌丝体，60℃水浸泡2次，每次浸泡2小时，水的重量为生物转化菌丝体重量的6倍；将提取后获得的提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在60℃条件下抽真空干燥，即得提取物。
按照实施例5的方法，将本发明实施例1和对比例1-4得到的提取物进行体外抗凝血效果比较试验。
1.5种药材提取方法
分别称取本发明实施例1、对比例1-4一共5种提取物3份，取提取物加水溶解，定容，使相当于生药材量1g/mL药液。
2.人血浆的制备：用含3.8％柠檬酸钠的采血真空管收集人全血(全血：3.8％柠檬酸钠＝9:1)，摇匀，2500r/min离心10min，用滴管收集上层黄色液体，即血浆，分装成数管，密封，放入-20℃冰箱冷冻保存，用时解冻。
3.空白血浆的制备：取生理盐水5μL置于245μL血浆中，摇匀，即得。
4.药液及待测血浆处理方法
取1g/ml药液，过0.45μm微孔滤膜，精密吸取5μL药液，置于245μL血浆中，摇匀，用涡流混匀器振荡混合30秒，备用。
得到体外抗凝血试验PT及APTT测定结果。
(1)按“体外抗凝血试验操作”测定各样品液PT和APTT，见表7。
表75种药材水提取物人血浆体外抗凝血试验测定结果(n＝3)
对表7结果采用完全随机t检验LSD法，结果见表8。
表85种药材水提取物人血浆体外抗凝血试验APTT和PT方差分析表
由表8结果可知，5种药材水提取PT无统计意义，而APTT有统计意义，再进一步进行两两比较的LSD检验，结果见表9。
表9APTT用LSD法多重比较(下三角为均值差,上三角为显著水平)
由表9结果可知，以APTT为评价指标，体外抗凝血作用由强到弱为：
实施例1＞对比例1≈对比例2≈对比例3≈对比例4＞空白对照(生理盐水)
本发明实施例得到的提取物＞对比例1≈对比例2≈对比例3≈对比例4＞空白对照，本发明实施例得到的提取物体外抗凝血活性高于对比例1-对比例4，5种样品抗凝血活性皆高于空白对照。

Claims (6)

1.一种培养基，其特征是，包括如下重量份的组分：
麦麸490～350份，玉米面140～100份，谷糠63～45份，白糖7～5份，银杏叶300～500份，水400～600份。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征是，所述培养基包括如下重量份的组分：
麦麸420份，玉米面120份，谷糠54份，白糖6份，银杏叶400份，水500份。
3.一种生物转化菌丝体，其特征是，制备方法为：将猴头菌类菌株接种至如权利要求1或2所述的培养基中，在20～27℃下，猴头菌培育30～40天，烘干，得到生物转化菌丝体。
4.一种提取物，其特征是，制备方法为：
（1）将如权利要求3所述的生物转化菌丝体进行水提，50-70℃下用水浸泡，水的重量为生物转化菌丝体重量的6～10倍，得到提取液；
（2）将上述提取液减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液在50-70℃条件下抽真空干燥，得到提取物。
5.如权利要求4所述的提取物，其特征是，水浸泡或抽真空干燥的温度为60℃。
6.一种如权利要求4或5所述的提取物在制备抗凝血药物或保健食品中的用途。
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