CN105669828A - 一种油菜花粉酶解肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种油菜花粉酶解肽采用超微粉碎法破壁，操作简单，无水添加，破壁率高，免除溶剂操作，有利于后序活性成分提取的制备方法。它是将油菜花粉去污洗干净、滤水，然后按一定比例加入低沸点的醇及其他有机溶剂进行回流三次萃取。采用特制的真空、微波、低温干燥设备相结合的方法对油菜花粉提取物进行干燥，保持相关活性成分不变，又能降低干燥温度，加快干燥速度。采用大孔吸附树脂C18反相硅胶柱层析-特制备色谱联用技术分离纯化，制得油菜花粉提取物的含量为90%的产品。进一步用我公司制备一种特定溶剂，进行重结晶提纯油菜花粉提取物的纯度达95%以上。通过正交试验确定油菜花粉提取化合物提取、萃取、干燥、纯化分离、重结晶的最佳工艺。本发明的制备方法具有工艺操作比较稳定，提取物收率比较高，纯度高，对环境无污染，适合现代化工业自动化生产的要求。

Description

一种油菜花粉酶解肽的制备方法

技术领域

本发明涉及油菜花粉酶解肽提取技术，具体地说，涉及一种油菜花粉酶解肽的制备方法。

背景技术

油菜，又叫油白菜，苦菜，拉丁文名：BrassicacampestrisL.十字花科、芸薹属植物，原产我国，其茎颜色深绿，帮如白菜，属十字花科白菜变种，花朵为黄色。农艺学上将植物中种子含油的多个物种统称油菜。目前油菜主要栽培（品种）类型为：白菜型油菜（Brassicarapa(campestris)L.），芥菜型油菜（BrassicajunceaL.），甘蓝型油菜（BrassicanapusL.）。油菜花粉含有丰富的功能性物质（包括蛋白质、维生素、微量元素、黄酮类化合物），这些物质协同作用于机体，调节机体的多种功能，平衡体内营养，增强新陈代谢，防止毛细血管通透性的障碍。花粉还能促进内分泌腺的发育，有提高和调节内分泌腺分泌功能，因此对由内分泌功能紊乱引起的疾病起到了治疗作用。油菜花粉益肾、固本、强腰，而且含黄酮醇较高，具有抗动脉粥样硬化、治疗静脉曲张性溃疡、降低胆固醇和抗辐射的作用。增强人体综合免疫功能：花粉多糖能激活巨噬细胞的吞噬活动，提高人体抗病能力。防衰老、美容作用：蜂花粉属营养性的美容化妆品，花粉中的VE、超氧化歧化酶（SOD）、硒等成分能滋润营养肌肤，恢复皮肤的弹性和光洁。花粉中的肌醇可使白发变黑，脱发渐生，保持头发乌黑亮丽。防治脑心血管疾病：花粉中的黄酮类化合物能有效清除血管壁上脂肪的沉积，从而起软化血管和降血脂的作用。防治前列腺疾病：花粉是前列腺炎的克星，以油菜花粉、荞麦花粉效果最佳。减肥：服用蜂花粉可以吸收足够的营养，造成饱食感。同时，花粉中的卵磷脂可燃烧过剩的脂肪，达到减肥的目的。调节肠胃功能：花粉有许多杀菌成分，能杀灭大肠杆菌等，并能防治便秘。保肝护肝：花粉中的黄酮类化合物同样可防止脂肪在肝上的沉积。调节神经系统，促进睡眠。辅助治疗其他疾病：花粉对贫血、糖尿病、改善记忆力、更年期障碍等有较好效果。

《中国药典》2005版中缺乏对油菜花粉酶解肽类成分的提取办法的记载，而文献报道提取油菜花粉酶解肽方法则丰要为醇提法和水提法。

《华中农业大学》2007油菜花粉谷蛋白酶解肽的制备及其抗肿瘤活性研究,《中国农业科学院》2007油菜蜂花粉中活性肽的制备及其抗氧化性的研究论文中，优选出60℃下，50％乙醇提取三次，每次2h的提取工艺。虽然其提取温度比较低，但是提取时间长，一共需要提取6个小时，能耗大，提取效率低。

《华中农业大学》2007油菜花粉谷蛋白酶解肽的制备及其抗肿瘤活性研究,《中国农业科学院》2007油菜蜂花粉中活性肽的制备及其抗氧化性的研究中，优选出了一种醇提方法，是用5-10目药材，加10倍量80％乙醇，回流提取3次，每次1h。同样显示出是提取次数多，时间长的缺点，一共需要提取3个小时。

综合上述文献，发现所用方法提取基本完全，但同时存在消耗溶剂多，提取次数多，纯度不高，活性不稳定，污染严重的缺点，为了更能节省溶剂和能源的消耗，减少环境污染，节约原材料，有必要改进油菜花粉酶解肽的提取及制备方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种节约原材料、提取效率高、纯度高、消耗溶剂少、无污染的油菜花粉酶解肽的制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种油菜花粉酶解肽的制备方法，包括如下步骤：将油菜花粉原料取洗干净油菜花粉，采用超微粉碎法破壁，置于植物提取罐中，加入乙醇浓度为60％，药材与溶剂的重量体积比为1：15，提取温度65℃，提取时问120min，提取液经过抽滤或离心，清液进行浓缩，二氯甲烷萃取制备后得稠膏，加入乙醇进行制备色谱分离，得到油菜花粉酶解肽。

在上述油菜花粉酶解肽的制备方法中，所述醇溶液优选为甲醇或乙醇溶液。

在上述油菜花粉酶解肽的制备方法中，所述乙醇溶液体积浓度优选为65％-75％。

在上述油菜花粉酶解肽的制备方法中，所用油菜花粉原料粗粉粒度优选为超微粉碎法破壁。分解提取效率高，温度低，所以有必要对油菜花粉进行超微粉碎法破壁，增加油菜花粉与溶剂接触的面积，提高油菜花粉酶解肽的提取率。

在上述油菜花粉酶解肽的制备方法中，油菜花粉与溶剂的重量体积比优选为1：15-1：20。

在上述油菜花粉酶解肽的制备方法中，超微粉碎法破壁。

在上述油菜花粉酶解肽的制备方法中，温度优选为60-70℃。

在上述油菜花粉酶解肽的制备方法中，提取时间优选为120-150min。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.该发明在提取过程中，利用超微粉碎法破壁的分解效应、机械效应及热效应等增强溶剂对油菜花粉的穿透力，有助于油菜花粉中有效成分的溶出，从而提高有效成分的提取率，节约原材料，降低提取温度，降低能耗，提高提取效率，减少对环境污染。

2．该发明的制备工艺中溶剂用量少，既节约溶剂又节约能源，降低生产成本，对环境零污染。

由于油菜花粉微波技术提取油菜花粉酶解肽在《中国药典》2005舨中缺乏含量测定项，所以参考文献报道，油菜花粉酶解肽主要肽元，并结合实验验证，确定油菜花粉酶解肽的质量指标以薯蓣肽元为对照品，采用的测定方法为分光光度法。具体方法为：取2g花粉的提取液，浓缩至干，10ml水溶解，用水饱和正丁醇萃取4次，洗涤萃取液，合并正丁醇液，浓缩至干用甲醇定容至10m1。取甲醇液0.5ml，水浴挥干，加高氯酸10ml，65℃水浴15min，冰水冷却终止反应，制得样品液。以高氯酸(分析纯)为空白，在409nm下测定吸光度。

本发明所说的油菜花粉酶解肽得率=(总酶解肽重量/投入的花粉重量)×100％

油菜花粉酶解肽提取率=(油菜花粉酶解肽提取物中的总酶解肽含量×酶解肽重量/投入的油菜花粉酶解肽含量×投入的花粉重量)×100％

下面通过具体实施例进一步阐述本发明的技术方案。

具体实施方式

以下实施例所用的油菜花粉酶解肽含量为3.06‰。

如下乙醇百分比均为体积百分比。

实施例1提取工艺条件的选择

(1)超微粉碎法破壁分解的时间对油菜花粉酶解肽提取效果的影响

实验方法：取油菜花粉500g纳米级超微粉碎法破壁，置于植物提取罐中，加入60％乙醇作为提取溶剂，花粉与溶剂的重量体积比为1：15，提取温度65℃，选择不同的分解时间提取一次，分解提取后的提取液经过抽滤或离心，清液进行浓缩，二氯甲烷萃取制备后得稠膏，干燥，即得油菜花粉提取物。考察不同提取时间下油菜花粉酶解肽的提取效果。结果如表1所示：

表1

时间提取率(％)

10h24.2

14h30.1

18h45.6

20h73.5

24h90.3

实验结果显示延长分解时间能增加酶解肽的提取率，24h时含量就已经达到最高。所以选取24h作为最佳提取时间。

(2)提取温度对油菜花粉酶解肽提取效果的影响

实验方法：取500g油菜花粉原料超微粉碎法破壁粉末，置于植物提取罐中，分解,加入60%乙醇作为提取溶剂，油菜花粉与溶剂的重量体积比为1：15，选择不同的提取温度提取一次，超声提取后的提取液经过抽滤或离心，清液进行浓缩，二氯甲烷萃取制备后得稠膏，干燥，即得油菜花粉提取物。考察不同提取时间下油菜花粉酶解肽的提取效果。结果如表2所示：

表2

温度提取率(％)

20℃58.5

30℃60.9

40℃60.9

50℃84.7

60℃87.8

实验结果显示，随着提取温度的升高，油菜花粉酶解肽的提取率也不断提高，综合考虑成本，故选取60℃作为最佳超声提取温度。

(3)提取溶剂对油菜花粉酶解肽提取效果的影响

实验方法：取500g油菜花粉超微粉碎法破壁粉末，置于植物提取罐中，加入60%乙醇作为提取溶剂，油菜花粉与溶剂的重量体积比为1：15，选择不同的提取溶剂提取一次，超声提取后的提取液经过抽滤或离心，清液进行浓缩，二氯甲烷萃取制备后得油菜花粉提取物稠膏，干燥，即得油菜花粉酶解肽提取物。考察不同提取时间下油菜花粉酶解肽的提取效果。结果如表3所示：

表3

溶剂提取率(％)

水55．6

30％乙醇63．7

40％乙醇70．9

50％乙醇76．5

60％乙醇87．4

70％乙醇88．3

甲醇78．4

实验结果显示，选择60％乙醇、70％乙醇和甲醇作为提取溶剂都具有较好的提取

效果。但甲醇毒性较大，不利于工业化生产，而50％乙醇提取出杂质相对较多，过滤比较困难，所以综合生产成本等因素，选取60％乙醇作为提取溶剂。

(4)提取溶剂体积对油菜花粉酶解肽提取效果的影响

实验方法：取500g油菜花粉原料纳米级粉末，置于植物提取罐中，加入60%乙醇作为提取溶剂，花粉与溶剂的重量体积比为1：15，选择不同的提取溶剂比例提取一次，超声提取后的提取液经过抽滤或离心，清液进行浓缩，二氯甲烷萃取制备后得稠膏，干燥，即得油菜花粉酶解肽提取物。考察不同提取时间下油菜花粉酶解肽的提取效果。结果如表4所示：

表4

溶剂提取率（%）

10倍88.6

15倍90.7

实验结果显示，使用油菜花粉与溶剂的重量体积比1：15的时候，提取率能得到较大的提高。因此选取1：15作为最佳油菜花粉与溶剂的重量体积比。

(5)油菜花粉目数对油菜花粉酶解肽提取效果的影响

实验方法：取500g油菜花粉超微粉碎法破壁粉末，置于植物提取罐中，加入60%乙醇作为提取溶剂，油菜花粉与溶剂的重量体积比为1：15，选择不同的提取细度提取一次，超声提取后的提取液经过抽滤或离心，清液进行浓缩，二氯甲烷萃取制备后得油菜花粉提取物稠膏，干燥，即得油菜花粉酶解肽提取物。考察不同提取时间下油菜花粉酶解肽的提取效果。结果如表5所示：

表5

超微粉碎法破壁级水磨提取率（%）

超微粉碎法破壁级无水90.8

超微粉碎法破壁级含水99.5

实验结果显示，利用经过超微粉碎法破壁级含水的油菜花粉进行提取比纳米级无水的提取率更高，所以选定超微粉碎法破壁含水作为最佳工艺。

最后，归纳超微粉碎法破壁法提取最佳提取工艺为：取超微粉碎法破壁的油菜花粉原料，置于植物提取罐中，加入乙醇浓度为60％，油菜花粉与溶剂的重量体积比为1：15，提取温度60℃，提取时间120min，提取后的提取液经过抽滤或离心，清液进行浓缩，二氯甲烷萃取制备后得稠膏，加入乙醇进行C18-制备色谱分离得到油菜花粉酶解肽。

实施例2

取500g取超微粉碎法破壁的油菜花粉原料，置于植物提取罐中，加入乙醇浓度为60％，油菜花粉与溶剂的重量体积比为1：15，提取温度60℃，提取时间120min，提取后的提取液经过抽滤或离心，清液进行浓缩，二氯甲烷萃取制备后得油菜花粉提取物稠膏，加入乙醇进行C18-制备色谱分离得到油菜花粉酶解肽稠膏，干燥，即得油菜花粉酶解肽。结果：干膏得率为8.5％，含量25.0％，提取率99.7％。

实施例3

同实施例2所示，不同的是：实施例2中药材与溶剂的重量体积比为1：20，而实施例3中药材与溶剂的重量体积比为1：10。结果：干膏得率为8.9％，含量16.7％，提取率91．7％。

实施例4

同实施例3所示，不同的是：实施例3油菜花粉粉碎达纳米级，而实施例4油菜花粉粉碎达纳米级。结果：干膏得率为8.9％，含量15.7％，提取率85.8％。

实施例5

同实施例4所示，不同的是：实施例4中乙醇浓度为60%，提取时间为24h，而实施例5中乙醇浓度为50％，提取时间为12h。结果：干膏得率为8.3％，含量15.7％，提取率79．6％。

实施例6

同实施例4所示，不同的是：实施例4中提取时间为12h，而实施例6中提取时间为8h。结果：干膏得率为9.5％，含量11.7％，提取率40.1％。

实施例7

取500g取超微粉碎法破壁的油菜花粉，置于植物提取罐中，加入乙醇浓度为60％，油菜花粉与溶剂的重量体积比为1：10，提取温度60℃，提取时间40min，提取后的提取液经过抽滤或离心，清液进行浓缩，二氯甲烷萃取制备后得油菜花粉提取物稠膏，加入乙醇进行C18-制备色谱分离得到油菜花粉酶解肽稠膏，干燥，即得油菜花粉酶解肽。结果：干膏得率为9.3％，含量18.7％，提取率73.4％,C18-制备色谱后纯度达95%以上。

实施例8

同实施例3所示，不同的是：实施例3使用植物提取一次，实施例8使用水浴热回流提取3次，每次60min。结果：干膏得率为9.4％，含量15.7％。

由以上实施例可知，超微粉碎法破壁分解提取油菜花粉，其最优条件为：超微粉碎法破壁的油菜花粉原料，置于植物提取罐中，加入乙醇浓度为60-80％，油菜花粉与溶剂的重量体积比为1：10-1：18，60-75℃，提取时间60-150min，提取液经过抽滤或离心，清液进行浓缩，二氯甲烷萃取制备后得稠膏，加入乙醇进行C18-制备色谱分离即得95%以上油菜花粉酶解肽。而常规回流提取则需要在较高提取温度下长时间和多次数地进行提取，才能达到本工艺一次提取的效果。因此，超微粉碎法破壁分解提取具有减少提取溶剂用量，降低提取温度，节约原材料，减少环境污染，不破坏药物的活性成分，提取油菜花粉酶解肽纯度高的特点。

Claims (1)

1.一种油菜花粉酶解肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：取洗干净油菜花粉原料，采用超微粉碎法破壁，置于植物提取罐中，加入乙醇浓度为60％，花粉与溶剂的重量体积比为1：15，提取温度65℃，提取时间120min，提取液经过抽滤或离心，清液进行浓缩，二氯甲烷萃取制备后得稠膏，加入乙醇进行制备色谱分离，得到油菜花粉酶解肽。