CN105660892A - 一种增加茶叶及其加工产品中egcg含量的方法 - Google Patents

一种增加茶叶及其加工产品中egcg含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种增加茶叶及其加工产品中EGCG含量的方法，包括以下步骤：步骤一、培养基的制备；步骤二、发酵制备酶液：培养基冷却后接种曲霉孢子悬液，在30℃条件下培养4～6天，提取酶液；对于液态发酵，发酵液直接过滤去除菌体即可得到粗酶液；对于固体培养基，发酵后向培养基中加入pH7.0的磷酸盐缓冲液，在20℃条件下，振荡速度180rpm浸提1h，过滤去除菌体得到粗酶液；步骤三、用酶处理茶叶或者茶叶提取物：向茶叶或者茶叶提取物中加入所述酶液，在固水比为1:5～1:30，温度10℃～70℃下进行酶反应；步骤四、测定EGCG含量变化。采用本发明后，茶叶或茶叶提取物中的EGCG含量大幅度提高。

Description

一种增加茶叶及其加工产品中EGCG含量的方法
技术领域
本发明涉及茶叶加工的技术领域，尤其涉及一种增加茶叶及其加工产品中EGCG含量的方法。
背景技术
茶叶在植物分类系统中属于山茶科，是一种重要的饮料作物，与咖啡、可可并称为世界三大饮料。茶叶中含有多种人体必需的营养成分如茶多酚、咖啡碱、氨基酸、茶色素、茶多糖等，这些成分具有较高的营养价值、药用作用及保健功能。其中，茶多酚是茶叶中的一组多酚类化合物，约占茶叶干重的20％～38％，组成成分包括黄烷醇类化合物、缩酸及缩酚类物质等。以儿茶素为主的黄烷醇类化合物占茶多酚总量的70～95％。其中EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)是儿茶素类化合物中的一种主要酯型儿茶素(约占儿茶素类总量的50％～60％)，是茶叶中茶多酚的主要组成成分，是儿茶素中活性最高、含量最多的功能成分。如，研究表明，EGCG是清除自由基、抗氧化能力最强的一种儿茶素。茶叶中儿茶素抗氧化活性强度的顺序依次为：EGCG>EGC>ECG>EC；此外，EGCG能够预防和治疗心脑血管疾病；能够增强免疫系统功能；抑制肝脂和胆固醇的增长；抑制肿瘤的生长；对痢疾、伤寒、金黄色葡萄球菌等细菌也有极强的抑制作用。现已被列为潜在的抗癌药物在中美等国被研究。
在茶叶及其提取物加工过程中，加热、氧化、酶分解和微生物发酵等常引起茶叶中EGCG的含量大量减少。Bradfield研究发现，茶叶经过长时间高温作用，其所含的EGCG会发生差向异构化作用，生成GCG；Yoku研究发现，用pH在6～8的水溶液提取绿茶，其EGCG含量显著降低，C、GCG等反式异构体增加。另外，茶叶中的EGCG在单宁酶作用下可发生水解而生成EGC和GA，在漆酶作用下EGCG发生氧化反应而降低。有鉴于此，本发明人研究和设计了一种增加茶叶及其加工产品中EGCG含量的方法，本案由此产生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种增加茶叶及其加工产品中EGCG含量的方法，通过向茶叶或其提取物中添加酶进行反应而增加其EGCG的含量。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题的技术方案是：
一种增加茶叶及其加工产品中EGCG含量的方法，包括以下步骤：
步骤一、培养基的制备：所述培养基按以下质量百分百的组分组成：0.5～70％的碳源，0.05％的氯化钾，0.01％的七水合硫酸镁，0.1％的柠檬酸三钠二水合物，0.1％的无水柠檬酸，0.1％的酵母提取物，0.1％的干酪素水解物，用1M的HCl把pH调到4.0；每个250mL锥形瓶中加入25mL培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min；
步骤二、发酵制备酶液：培养基冷却后接种曲霉孢子悬液，所述孢子悬液孢子含量为1×108个/ml，在30℃条件下培养4～6天，提取酶液；对于液态发酵，发酵液直接过滤去除菌体即可得到粗酶液；对于固体培养基，发酵后向培养基中加入pH7.0的磷酸盐缓冲液，在20℃条件下，振荡速度180rpm浸提1h，过滤去除菌体得到粗酶液；
步骤三、用酶处理茶叶或者茶叶提取物：向茶叶或者茶叶提取物中加入所述酶液，在固水比为1:5～1:30，温度10℃～70℃下进行酶反应；
步骤四、测定EGCG含量变化：采用液相色谱-质谱联用仪测定茶样品中EGCG的含量；其中，色谱柱NucleodurPFP规格为250×4.6mm；柱温35℃；流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液，洗脱梯度：0-1min，95％A和5％的B，1-6min，85％A和15％的B，6-20min，70％A和30％的B，20-25min，95％A和5％的B；进样量5.0μL，色谱流速0.5ml/min；质谱所用的离子源为AgilentJetStreamESI，负离子模式采集；干燥气温度300℃，干燥气流速10l/min，雾化气压力45psi，鞘气温度350℃，鞘气流速12l/min，毛细管电压3000V，喷嘴电压500V。
作为实施例的优选方式，所述碳源为果胶，所述果胶的质量百分含量为0.5％～2％。
作为实施例的优选方式，所述碳源为麦麸，所述麦麸的质量百分含量为2％～70％。
作为实施例的优选方式，所述碳源为蔗糖，所述蔗糖的质量百分含量为1％～4％。
本发明采用上述技术方案后，采用的培养基虽为常规培养基，但原料易得，成本低，结合本发明的酶处理工艺，可显著提高茶叶及其提取物中EGCG的含量，相对于现有技术的加工方法，做到了真正“物美价廉”的有益效果。
具体实施方式
本发明实施例中以黑曲霉进行发酵制备酶液提高茶叶中EGCG的含量为例说明本发明的工艺，但本发明不仅限用于增加茶叶中EGCG的含量，也适用于茶叶或添加了茶叶或其提取物的加工产品。
采用液相色谱-质谱联用仪测定茶样品中EGCG的含量；其中，色谱柱NucleodurPFP(250×4.6mm,5μm,Macherey-nagel)；柱温35℃；流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液，洗脱梯度：0-1min，95％A和5％的B，1-6min，85％A和15％的B，6-20min，70％A和30％的B，20-25min，95％A和5％的B；进样量5.0μL，色谱流速0.5ml/min。质谱所用的离子源为AgilentJetStreamESI，负离子模式采集；干燥气温度300℃，干燥气流速10l/min，雾化气压力45psi，鞘气温度350℃，鞘气流速12l/min，毛细管电压3000V，喷嘴电压500V。
实施例1：
步骤一、制备0.5％果胶培养基：培养基组成为：0.5％的果胶，0.05％的氯化钾，0.01％的七水合硫酸镁，0.1％的柠檬酸三钠二水合物，0.1％的无水柠檬酸，0.1％的酵母提取物，0.1％的干酪素水解物，用1M的HCl把pH调到4.0。每个250mL锥形瓶中加入25mL培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min。
步骤二、发酵制备粗酶液：培养基冷却后接种2mL黑曲霉孢子悬液(1×108个/ml)，在30℃条件下(振荡速度180rpm)培养4天，过滤去除菌体得到粗酶液。
步骤三、酶反应：称取1g(±1mg)粉状乌龙茶样品(过20目筛)，加入5mL上述酶液以及35mL水(对照茶样品加入5mL灭活的酶液及35mL水)振荡摇匀；10℃水浴下反应60min，沸水浴5min，过滤茶汤，并洗涤茶渣，定容至50mL。
步骤四、茶样品中EGCG含量的检测：用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为520.3mg/L，对照茶样品中EGCG的含量为516.4mg/L。
实施例2：
步骤一、制备1％果胶培养基：培养基组成为：1.0％的果胶，0.05％的氯化钾，0.01％的七水合硫酸镁，0.1％的柠檬酸三钠二水合物，0.1％的无水柠檬酸，0.1％的酵母提取物，0.1％的干酪素水解物，用1M的HCl把pH调到4.0。每个250mL锥形瓶中加入25mL培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min。
步骤二、发酵制备粗酶液：培养基冷却后接种2mL黑曲霉孢子悬液(1×108个/ml)，在30℃条件下(振荡速度180rpm)连续培养4天，过滤去除菌体可得到粗酶液。
步骤三、酶反应：称取1g(±1mg)粉状乌龙茶样品(过20目筛)，加入10mL上述酶液以及30mL水(对照茶样品加入10mL灭活的酶液及30mL水)，振荡摇匀；25℃水浴下反应60min，反应结束后沸水浴5min，过滤茶汤，并洗涤茶渣，定容至50mL。
步骤四、茶样品中EGCG含量的检测：用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为568.7mg/L，对照样茶品中EGCG的含量为516.4mg/L。
实施例3：
步骤一、制备1.5％果胶培养基：培养基组成为：1.5％的果胶，0.05％的氯化钾，0.01％的七水合硫酸镁，0.1％的柠檬酸三钠二水合物，0.1％的无水柠檬酸，0.1％的酵母提取物，0.1％的干酪素水解物，用1M的HCl把pH调到4.0。每个250mL锥形瓶中加入25mL培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min。
步骤二、发酵制备粗酶液：培养基冷却后接种2mL曲霉孢子悬液(1×108个/ml)，在30℃条件下(振荡速度180rpm)连续培养4天，过滤去除菌体即可得到粗酶液。
步骤三、酶反应：称取1g(±1mg)粉状乌龙茶样品(过20目筛)，加入20mL上述酶液以及20mL水(对照茶样品加入20mL灭活的酶液及20mL水)；40℃水浴下反应60min，反应结束后沸水浴5min，然后过滤茶汤，并洗涤茶渣，定容至50mL。
步骤四、茶样品中EGCG含量的检测：用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为618.6mg/L，对照茶样品中EGCG的含量为516.4mg/L。
实施例4：
步骤一、制备2％果胶培养基：培养基组成为：2.0％的果胶，0.05％的氯化钾，0.01％的七水合硫酸镁，0.1％的柠檬酸三钠二水合物，0.1％的无水柠檬酸，0.1％的酵母提取物，0.1％的干酪素水解物，用1M的HCl把pH调到4.0。每个250mL锥形瓶中加入25mL培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min。
步骤二、发酵制备粗酶液：培养基冷却后接种2mL曲霉孢子悬液(1×108个/ml)，在30℃条件下(振荡速度180rpm)连续培养4天，过滤去除菌体即可得到粗酶液。
步骤三、酶反应：称取1g(±1mg)粉状乌龙茶样品(过20目筛)，加入30mL酶液以及10mL水(对照茶样品加入30mL灭活的酶液及10mL水)，振荡摇匀；70℃水浴下反应60min，反应结束后沸水浴5min，过滤茶汤，并洗涤茶渣，定容至50mL。
步骤四、茶样品中EGCG含量的检测：用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为624.6mg/L，对照茶样品中EGCG的含量为516.4mg/L。
实施例5：
步骤一、制备2％麦麸培养基：每个250mL锥形瓶中加入1g麦麸(过40目筛)以及50mL盐溶液，121℃高压蒸汽灭菌20min。盐溶液组成(g/L)：硫酸铵1.0，硫酸镁5.0，七水合硫酸亚铁0.005，磷酸二氢钾5.0，pH4.8。
步骤二、发酵制备粗酶液：培养基冷却后接种2mL曲霉孢子悬液(1×108个/ml)，在30℃条件下190rpm培养6天，过滤去除菌体得到粗酶液。
步骤三、酶反应：称取1g(±1mg)粉状乌龙茶样品(过20目筛)，加入5mL麦麸培养基发酵的酶液以及35mL水(对照茶样品加入5mL灭活酶液及35mL水)，振荡摇匀；10℃水浴下反应60min，反应结束后沸水浴5min，过滤茶汤，并洗涤茶渣，定容至50mL。
步骤四、茶样品中EGCG含量的检测：用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为519.5mg/L，对照茶样品中EGCG的含量为516.4mg/L。
实施例6：
步骤一、制备36％麦麸培养基：每个250mL锥形瓶中加入12g麦麸(过40目筛)，加入21.3mL盐溶液，121℃高压蒸汽灭菌20min。其中盐溶液组成为(g/L)：硫酸铵1.0，硫酸镁5.0，七水合硫酸亚铁0.005，磷酸二氢钾5.0，pH4.8。
步骤二、发酵制备粗酶液：培养基冷却后接种2mL曲霉孢子悬液(1×108个/ml)，在30℃条件下连续培养6天，再向培养基中加入15mL磷酸盐缓冲液(pH7.0)，在20℃条件下(振荡速度180rpm)浸提1h，过滤去除菌体即得到粗酶液。
步骤三、酶反应：称取1g(±1mg)粉状乌龙茶样品(过20目筛)，加入10mL上述酶液以及30mL水(对照茶样品加入10mL灭活酶液及30mL水)，振荡摇匀；25℃水浴下反应60min，反应结束后沸水浴5min，过滤茶汤，并洗涤茶渣，定容至50mL。
步骤四、茶样品中EGCG含量的检测：用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为548.6mg/L，对照茶样品中EGCG的含量为516.2mg/L。
实施例7：
步骤一、制备54％麦麸培养基：在250mL锥形瓶中加入16g麦麸(过40目筛)以及10mL盐溶液，121℃高压蒸汽灭菌20min。其中，盐溶液配制(g/L)：硫酸铵1.0，硫酸镁5.0，七水合硫酸亚铁0.005，磷酸二氢钾5.0，加蒸馏水配制，调节pH4.8。
步骤二、发酵制备粗酶液：培养基冷却后接种2mL霉菌孢子悬液(1×108个/ml)，在30℃条件下连续培养6天，再向培养基中加入30mL磷酸盐缓冲液(pH7.0)，在20℃条件下(振荡速度180rpm)浸提1h，过滤去除菌体得到粗酶液。
步骤三、酶反应：称取1g(±1mg)粉状乌龙茶样品(过20目筛)，加入20mL上述酶液以及20mL水(对照茶样品加入20mL灭活的酶液及20mL水)，振荡摇匀；40℃水浴下反应60min，沸水浴5min，过滤茶汤，并洗涤茶渣，定容至50mL。
步骤四、茶样品中EGCG含量的检测：用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为631.5mg/L，对照茶样品中EGCG的含量为516.5mg/L。
实施例8：
步骤一、制备70％麦麸培养基：在250mL锥形瓶中20g麦麸(过40目筛)和9mL盐溶液，121℃高压蒸汽灭菌20min。盐溶液配制(g/L)：硫酸铵1.0，硫酸镁5.0，七水合硫酸亚铁0.005，磷酸二氢钾5.0，加蒸馏水配制，调节pH4.8。
步骤二、发酵制备粗酶液：培养基冷却后接种2mL曲霉孢子悬液(1×108个/ml)，在30℃条件下连续培养6天，向培养基中加入35mL磷酸盐缓冲液(pH7.0)，在20℃条件下(振荡速度180rpm)浸提1h，过滤去除菌体得到粗酶液。
步骤三、酶反应：称取1g(±1mg)粉状乌龙茶样品(过20目筛)，加入30mL酶液以及10mL水(对照茶样品加入30mL灭活的酶液及10mL水)，振荡摇匀；70℃水浴下反应60min，反应结束后沸水浴5min，过滤茶汤，并洗涤茶渣，定容至50mL。
步骤四、茶样品中EGCG含量的检测：用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为611.5mg/L，对照茶样品中EGCG的含量为516.3mg/L。
实施例9：
步骤一、制备1％蔗糖培养基：称取蔗糖10g，硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.5g，加水定容至1000mL。每个250mL锥形瓶中加入30mL培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min。
步骤二、发酵制备粗酶液：培养基冷却后接种2mL曲霉孢子悬液(1×108个/ml)，在30℃条件下(振荡速度180rpm)培养6天，过滤去除菌体即可得到粗酶液。
步骤三、酶反应：称取1g(±1mg)粉状乌龙茶样品(过20目筛)，加入5mL该酶液以及35mL水(对照茶样品加入5mL灭活酶液及35mL水)，振荡摇匀；10℃水浴下反应60min，反应结束后沸水浴5min，过滤茶汤，并洗涤茶渣，定容至50mL。
步骤四、茶样品中EGCG含量的检测：用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为529.3mg/L，对照茶样品中EGCG的含量为516.4mg/L。
实施例10：
步骤一、制备2％蔗糖培养基：称取蔗糖20g，硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.5g，加水定容至1000mL。每个250mL锥形瓶中加入30mL培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min。
步骤二、发酵制备粗酶液：培养基冷却后接种2mL曲霉孢子悬液(1×108个/ml)，在30℃条件下(振荡速度180rpm)连续培养6天，过滤去除菌体得到粗酶液。
步骤三、酶反应：称取1g(±1mg)粉状乌龙茶样品(过20目筛)，加入10mL酶液以及30mL水(对照茶样品加入10mL灭活酶液及30mL水)，振荡摇匀；25℃水浴下反应60min，反应结束后沸水浴5min，过滤茶汤，并洗涤茶渣，定容至50mL。
步骤四、茶样品中EGCG含量的检测：用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为545.7mg/L，对照茶样品中EGCG的含量为516.6mg/L。
实施例11：
步骤一、制备3％蔗糖培养基：称取蔗糖30g，硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.5g，加水定容至1000mL。每个250mL锥形瓶中加入30mL培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min。
步骤二、发酵制备粗酶液：培养基冷却后接种2mL孢子悬液(1×108个/ml)，在30℃、180rpm条件下振荡培养6天，过滤去除菌体即得到粗酶液。
步骤三、酶反应：称取1g(±1mg)粉状乌龙茶样品(过20目筛)，加入20mL酶液以及20mL水(对照茶样品加入20mL灭活的酶液及20mL水)，振荡摇匀；40℃水浴下反应60min，反应结束后沸水浴5min，然后过滤茶汤，并洗涤茶渣，定容至50mL。
步骤四、茶样品中EGCG含量的检测：用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为582.3mg/L，对照茶样品中EGCG的含量为516.4mg/L。
实施例12：
步骤一、制备4％蔗糖培养基：称取蔗糖40g，硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.5g，加水定容至1000mL。每个250mL锥形瓶中加入30mL培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min。
步骤二、发酵制备粗酶液：培养基冷却后接种2mL孢子悬液(1×108个/ml)，在30℃条件下(振荡速度180rpm)连续培养6天，过滤去除菌体即可得到粗酶液。
步骤三、酶反应：称取1g(±1mg)粉状乌龙茶样品(过20目筛)，加入30mL酶液以及10mL水(对照茶样品30mL灭活的酶液及10mL水)，振荡摇匀；70℃水浴下反应60min，反应结束后沸水浴5min，然后过滤茶汤，并洗涤茶渣，定容至50mL。
步骤四、茶样品中EGCG含量的检测：用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为596.7mg/L，对照茶样品中EGCG的含量为516.4mg/L。
为了进一步说明本发明的创造性，下面再列举采用其他培养基发酵的酶液处理茶叶的对比实施例进行比较，以说明本发明采用果胶、麦麸和蔗糖为碳源培养微生物所带来的技术效果。
对比实施例1：
步骤一、制备2％葡萄糖培养基：称取去皮的马铃薯150g，切成小块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加葡萄糖10g，融化后补足水至1000mL。每个250mL锥形瓶中加入30mL培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min。
步骤二、发酵制备粗酶液：培养基冷却后接种2mL曲霉孢子悬液(1×108个/ml)，在30℃条件下(振荡速度180rpm)连续培养6天，过滤去除菌体得到粗酶液。
步骤三、酶反应：称取1g(±1mg)粉状乌龙茶样品(过20目筛)，加入5mL该酶液以及35mL水(对照茶样品加入5mL灭活酶液及35mL水)，振荡摇匀；10℃水浴下反应60min，沸水浴5min，过滤茶汤，并洗涤茶渣，定容至50mL。
步骤四、茶样品中EGCG含量的检测：用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为442.0mg/L，对照茶样品中EGCG的含量为516.4mg/L。
对比实施例2：
步骤一、制备2％葡萄糖培养基：称取去皮的马铃薯200g，切成小块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加葡萄糖20g，融化后补足水至1000mL。每个250mL锥形瓶中加入30mL培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min。
步骤二、发酵制备粗酶液：培养基冷却后接种2mL孢子悬液(1×108个/ml)，在30℃条件下(振荡速度180rpm)连续培养6天，过滤去除菌体即可得到粗酶液。
步骤三、酶反应：称取1g(±1mg)粉状乌龙茶样品(过20目筛)，加入15mL酶液以及25mL水(对照茶样品加入15mL灭活的酶液及25mL水)，振荡摇匀；30℃水浴下反应60min，沸水浴5min，过滤茶汤，并洗涤茶渣，定容至50mL。
步骤四、茶样品中EGCG含量的检测：用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为138.0mg/L，对照样品中EGCG的含量为516.4mg/L。
对比实施例3：
步骤一、制备3％葡萄糖培养基：称取去皮的马铃薯250g，切成小块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加葡萄糖30g，融化后补足水至1000mL。每个250mL锥形瓶中加入30mL培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min。
步骤二、发酵制备粗酶液：培养基冷却后接种2mL孢子悬液(1×108个/ml)，在30℃条件下(振荡速度180rpm)连续培养6天，过滤去除菌体即可得到粗酶液。
步骤三、酶反应：称取1g(±1mg)粉状乌龙茶样品(过20目筛)，加入30mL酶液以及10mL水(对照茶样品加入30mL灭活的酶液及10mL水)，振荡摇匀；70℃水浴下反应60min，沸水浴5min，然后过滤茶汤，并洗涤茶渣，定容至50mL。
步骤四、茶样品中EGCG含量的检测：用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为112.7mg/L，对照茶样品中EGCG的含量为516.4mg/L。
对比实施例4：
步骤一、制备25％柚皮粉培养基：250mL锥形瓶中加入柚皮粉(过20目筛)3g，硫酸铵1g，水8mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。
步骤二、发酵制备粗酶液：培养基冷却后接种2mL黑曲霉孢子悬液(1×108个/ml)，在30℃条件下培养6天，向培养基中加入30mL磷酸盐缓冲液(pH7.0)，20℃条件下振荡浸提1h，过滤去除菌体及柚皮粉得到粗酶液。
步骤三、酶反应：称取1g(±1mg)粉状乌龙茶样品(过20目筛)，加入5mL酶液以及35mL水(对照茶样品加入5mL灭活酶液及35mL水)，振荡摇匀；10℃水浴下反应60min，反应结束后沸水浴5min，过滤茶汤，并洗涤茶渣，定容至50mL。
步骤四、茶样品中EGCG含量的检测：用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为512.6mg/L，对照茶样品中EGCG的含量为516.4mg/L。
对比实施例5：
步骤一、制备31.1％柚皮粉培养基：250mL锥形瓶加入柚皮粉(过20目筛)5g，硫酸铵1g，水8mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。
步骤二、发酵制备粗酶液：培养基冷却后接种2mL曲霉孢子悬液(1×108个/ml)，在30℃条件下培养6天，向培养基中加入30mL磷酸盐缓冲液(pH7.0)，在20℃条件下振荡浸提1h，过滤去除残渣即得到粗酶液。
步骤三、酶反应：称取1g(±1mg)粉状乌龙茶样品(过20目筛)，加入15mL酶液以及25mL水(对照茶样品加入15mL灭活的酶液及25mL水)，振荡摇匀；30℃水浴下反应60min，沸水浴5min，然后过滤茶汤，并洗涤茶渣，定容至50mL。
步骤四、茶样品中EGCG含量的检测：用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为500.1mg/L，对照茶样品中EGCG的含量为516.4mg/L。
对比实施例6：
步骤一、制备50％柚皮粉培养基：250mL锥形瓶中加入柚皮粉(过20目筛)7g，硫酸铵1g，水8mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。
步骤二、发酵制备粗酶液：培养基冷却后接种2mL曲霉孢子悬液(1×108个/ml)，在30℃条件下连续培养6天，向培养基中加入30mL磷酸盐缓冲液(pH7.0)，在20℃条件下振荡浸提1h，过滤得到粗酶液。
步骤三、酶反应：称取1g(±1mg)粉状乌龙茶样品(过20目筛)，加入30mL酶液以及10mL水(对照茶样品加入30mL灭活酶液及10mL水)，振荡摇匀；70℃水浴下反应60min，反应结束后沸水浴5min，过滤茶汤，并洗涤茶渣，定容至50mL。
步骤四、茶样品中EGCG含量的检测：用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为489.6mg/L，对照茶样品中EGCG的含量为516.4mg/L。
对比实施例7：
步骤一、制备23％茶叶梗培养基：每个250mL锥形瓶中加入茶叶梗(粉碎过20目筛)3g，盐溶液10mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。盐溶液配制(％，w/w)：氯化铵5.0、α-乳糖5.0、七水合硫酸镁0.1、磷酸二氢钾0.1、氯化钠0.1，加蒸馏水配制，调节pH6.0。
步骤二、发酵制备粗酶液：培养基冷却后接种2mL曲霉孢子悬液(1×108个/ml)，在30℃条件下培养4天，向培养基中加入30mL磷酸盐缓冲液(pH7.0)，在20℃条件下震荡180rpm浸提1h，过滤去除菌体得到粗酶液。
步骤三、酶反应：称取1g(±1mg)粉状乌龙茶样品(过20目筛)，加入5mL酶液以及35mL水(对照茶样品加入5mL灭活酶液及35mL水)，振荡摇匀；10℃水浴下反应60min，后沸水浴5min，然后过滤茶汤，并洗涤茶渣，定容至50mL。
步骤四、茶样品中EGCG含量的检测：用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为375.8mg/L，对照茶样品中EGCG的含量为516.4mg/L。
对比实施例8：
步骤一、制备33％茶叶梗培养基：每个250mL锥形瓶中加入茶叶梗(粉碎过20目筛)5g，盐溶液10mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。盐溶液配制(％，w/w)：氯化铵5.0、α-乳糖5.0、七水合硫酸镁0.1、磷酸二氢钾0.1、氯化钠0.1，加蒸馏水配制，调节pH6.0。
步骤二、发酵制备粗酶液：培养基冷却后接种2mL孢子悬液(1×108个/ml)，在30℃条件下连续培养4天，向培养基中加入30mL磷酸盐缓冲液(pH7.0)，在20℃条件下(振荡速度180rpm)浸提1h，过滤去除菌体得到粗酶液。
步骤三、酶反应：称取1g(±1mg)粉状乌龙茶样品(过20目筛)，加入15mL酶液以及25mL水(对照茶样品加入15mL灭活的酶液及25mL水)，振荡摇匀；30℃水浴下反应60min，沸水浴5min，然后过滤茶汤，并洗涤茶渣，定容至50mL。
步骤四、茶样品中EGCG含量的检测：用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为45.7mg/L，对照茶样品中EGCG的含量为516.4mg/L。
对比实施例9：
步骤一、制备41％茶叶梗培养基：每个250mL锥形瓶中加入茶叶梗(粉碎过20目筛)7g，盐溶液10mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。其中，盐溶液配制(％，w/w)：氯化铵5.0、α-乳糖5.0、七水合硫酸镁0.1、磷酸二氢钾0.1、氯化钠0.1，加蒸馏水配制，调节pH6.0。
步骤二、发酵制备粗酶液：培养基冷却后接种2mL曲霉孢子悬液(1×108个/ml)，在30℃条件下培养4天，向培养基中加入30mL磷酸盐缓冲液(pH7.0)，在20℃条件下振荡浸提1h，过滤去除菌体得到粗酶液。
步骤三、酶反应：称取1g(±1mg)粉状乌龙茶样品(过20目筛)，加入30mL酶液以及10mL水(对照茶样品加入30mL灭活酶液及10mL水)，振荡摇匀；70℃水浴下反应60min，沸水浴5min，然后过滤茶汤，并洗涤茶渣，定容至50mL。
步骤四、茶样品中EGCG含量的检测：用LC-MS检测加酶茶样品中EGCG的含量为9.4mg/L，对照茶样品中EGCG的含量为516.4mg/L。
如表1所示，为本发明实施例及对比实施例乌龙茶经不同发酵液处理后EGCG的含量变化。
表1乌龙茶经不同发酵液处理后EGCG的含量变化
本发明采用上述技术方案后，即用果胶、麦麸和蔗糖为碳源发酵制备的粗酶液处理茶叶或者茶叶提取物，即可明显增加茶叶及其加工产品中EGCG含量，当然，本发明的果胶、麦麸、柚皮和蔗糖等可以作为唯一碳源，也可以相互组合配制混合碳源。本发明不需要复杂的设备，操作简便，工艺成本低。以上所述，仅为本发明实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，如果依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (4)

1.一种增加茶叶及其加工产品中EGCG含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、培养基的制备：所述培养基按以下质量百分百的组分组成：0.5～70％的碳源，0.05％的氯化钾，0.01％的七水合硫酸镁，0.1％的柠檬酸三钠二水合物，0.1％的无水柠檬酸，0.1％的酵母提取物，0.1％的干酪素水解物，用1M的HCl把pH调到4.0；每个250mL锥形瓶中加入25mL培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min；
步骤二、发酵制备酶液：培养基冷却后接种曲霉孢子悬液，所述孢子悬液孢子含量为1×108个/ml，在30℃条件下培养4～6天，提取酶液；对于液态发酵，发酵液直接过滤去除菌体即可得到粗酶液；对于固体培养基，发酵后向培养基中加入pH7.0的磷酸盐缓冲液，在20℃条件下，振荡速度180rpm浸提1h，过滤去除菌体得到粗酶液；
步骤三、用酶处理茶叶或者茶叶提取物：向茶叶或者茶叶提取物中加入所述酶液，在固水比为1:5～1:30，温度10℃～70℃下进行酶反应；
步骤四、测定EGCG含量变化：采用液相色谱-质谱联用仪测定茶样品中EGCG的含量；其中，色谱柱NucleodurPFP规格为250×4.6mm；柱温35℃；流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液，洗脱梯度：0-1min，95％A和5％的B，1-6min，85％A和15％的B，6-20min，70％A和30％的B，20-25min，95％A和5％的B；进样量5.0μL，色谱流速0.5ml/min；质谱所用的离子源为AgilentJetStreamESI，负离子模式采集；干燥气温度300℃，干燥气流速10l/min，雾化气压力45psi，鞘气温度350℃，鞘气流速12l/min，毛细管电压3000V，喷嘴电压500V。
2.如权利要求1所述的一种增加茶叶及其加工产品中EGCG含量的方法，其特征在于：所述碳源为果胶，所述果胶的质量百分含量为0.5％～2％。
3.如权利要求1所述的一种增加茶叶及其加工产品中EGCG含量的方法，其特征在于：所述碳源为麦麸，所述麦麸的质量百分含量为2％～70％。
4.如权利要求1所述的一种增加茶叶及其加工产品中EGCG含量的方法，其特征在于：所述碳源为蔗糖，所述蔗糖的质量百分含量为1％～4％。
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JIN-HUA QIN 等: "Change in Tea Polyphenol and Purine Alkaloid Composition during Solid-State Fungal Fermentation of Postfermented Tea", 《J. AGRIC.FOOD CHEM.》 *

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