CN105659068B - 用于细胞的细胞类型的无标识确定的体外方法 - Google Patents

Abstract

发明涉及用于生物样本中的细胞(10)的细胞类型的无标记确定的体外方法，其中显微镜装置(14)检测(S1)细胞(10)相对于载板(16)的高度轮廓(18)。方法的特征在于由细胞分析装置(13)进行以下步骤：在检测到的高度轮廓(18，S2)的基础上确定细胞(10)的细胞区划(12，12'，12”)，在确定出的细胞区划(12，12'，12”，S3)的基础上确定预定的定量细胞特征，在确定出的定量细胞特征(S3)的基础上确定细胞(10)的细胞类型。发明还涉及相应设计的细胞分析装置(13)和相应的显微装置(14)。

Description

用于细胞的细胞类型的无标识确定的体外方法

技术领域

本发明涉及用于使用显微镜装置进行的细胞的细胞类型的无标记确定的方法。

背景技术

确定细胞并给它们分配细胞类型是细胞学中非常重要的。血细胞组成部分、即红细胞、血小板和白细胞在例如血液检查中被确定和定量。白血球的数量(白细胞计数，WBC)的确定应该能够区分用于全面诊断的白细胞的基本种群。白细胞根据颗粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和非颗粒细胞(淋巴细胞、单核细胞)来区分。除粒度之外细胞还关于细胞核的破碎(无破碎：单个核细胞，即淋巴细胞和单核细胞；多形核细胞：嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞)和细胞尺寸而不同。染色被用于颗粒细胞、特别是嗜酸性和嗜碱性粒细胞的区分。细胞种群传统上通过全自动血液分析仪或通过显微镜来评价。全自动分析仪必须根据固定的算法(在例如阻抗、散射光和吸收测量的帮助下)来分析种群。然而，这常常导致在例如病理样本的情况下显示出的错误消息。在下一步骤中，显微镜传统上作为用于由血液分析仪不正确地确定的细胞的验证方法而发生。该步骤是费力且成本密集的，因为它除样本制备之外还要求手工评价、显微镜和手工执行的进一步的工作。

除细胞的形态之外确定细胞体积也可能是重要的。归因于由颗粒和多形核引起的散射，这传统上仅在非颗粒红细胞和血小板中进行。因此，照例，这不能执行用于白细胞。

为了例如执行定量血细胞诊断，血液分析仪可以省却并且而是各单一个细胞可以使用显微镜来检查。这允许了血球计数独立于固定的评价算法和旗标被确定。然而该途径的缺陷是与利用血液分析仪比较低的样本处理量和将显微镜载玻片上细胞固定不动并染色的持续努力。此外，这些染色还具有仅有限的再现性并且展现出对湿度、染色寿命、温度等的高依赖性。纯显微镜的缺陷是与血液分析仪中使用的流式细胞术相比使细胞体积定量。

从US 8406498已知可直接确定白细胞的区分的成像流式细胞术。然而，在该情况中也使用染色以区分嗜酸性和嗜碱性粒细胞。因此在这里也产生上面提到的缺陷。

发明内容

因而发明的潜在的一个目的是提供用于区分细胞的更高效且更牢靠的方法。

该目的通过如独立权利要求所要求保护的发明性方法、发明性细胞分析装置和显微镜装置来实现。发明的有利发展由从属权利要求给出。

用于生物样本中的细胞的细胞类型的无标记确定的发明性体外方法在显微镜装置和细胞分析装置的帮助下执行。显微镜装置是使用它可以很大程度放大地看到非常小的物体的装置，并且包括例如光学显微镜、扫描电子显微镜、相位对比显微镜、数字全息显微镜或具有超声波传感器的显微镜(例如声学显微镜)。显微镜装置检测细胞相对于载板的高度轮廓(profile)。高度轮廓是描述细胞的位置和高度的轮廓，即提供形貌信息。

细胞分析装置、即适于电子数据处理并设计成处理高度轮廓的数据的装置或装置组成部件执行发明性方法中的以下步骤：

-使用检测到的高度轮廓来确定细胞的细胞区划(compartment)，

-使用确定出的细胞区划来确定预定的定量细胞特征，和

-使用确定出的定量细胞特征来确定细胞的细胞类型。

在本发明的背景下，细胞区划是指由生物膜包围的细胞区域。细胞区划因而将在下文中是指例如线粒体、细胞核、液泡、细胞质或颗粒(granule)，其中颗粒、即细胞的可见的粒状沉积是指细胞区划，并且多个颗粒是指多个细胞区划。发明性方法提供了用于确定细胞类型的牢靠且无标记的方法。发明性方法同样适合于确定细胞的细胞类型并确定异质性细胞悬浮液的细胞。省却细胞的染色处理的能力意味着细胞的确定不受染料的物理性质的影响。与传统的预分析不一样，当执行发明性方法时可以省却变圆缓冲液(roundingbuffer)(例如，稀释的SDS缓冲溶液)的使用。这几乎完全防止了细胞的变圆和假象的发生。因此可以在血液分析期间防止例如由红细胞形成棘红细胞(echinocyte)。因为染色过程已省却，所以方法还允许高的样本处理量并允许独立于固定的评价算法或二元状态指示器的细胞的定性和/或定量确定。具有高样本处理量的显微镜因而能够实现并且传统的血液分析仪可以省却。

如果，根据发明性方法的进一步实施例，使用高度轮廓来确定预定定量细胞特征，那么这导致较高的分辨率和随之导致细胞类型的更加准确的确定。可替代地，可以使用可以不是使用高度轮廓来确定的而是例如使用强度(intensity)、极化(polarization)或荧光性(fluorescence)来确定细胞类型的附加定量细胞特征。

此外，对于细胞特性的确定的特别优选的改进可以被实现在于细胞区划通过确定细胞体积、确定第一细胞区划、例如细胞核并确定另一细胞区划来查明。确定细胞区划可以包括例如将细胞区划分段。这构成了发明性方法的特别优选的实施例。第一区划的区域可以例如在当确定第二区划时忽略。

在发明性方法的进一步的实施例中，定量细胞特征可以描述细胞体积、细胞区划的体积、细胞面积、细胞区划的面积、细胞体积与细胞核体积的比率、细胞面积与细胞核面积的比率、细胞区划的直径、细胞区划的圆度、细胞区划的周长、细胞区划的数量和/或使用多个细胞的各个高度轮廓和/或使用多个细胞区划的高度轮廓确定出的细胞特征的统计特征。这使得能够实现增加发明性方法的应用可能性的大量间接特性。

在发明性方法的特别优选的实施例中，定量细胞特征描述了使用多个细胞的各个高度轮廓和/或使用多个细胞区划的高度轮廓确定的细胞特征的统计特征。这使得能够实现在细胞的分类中的较高分辨率和提高的可区分性、特别是在传统方法的基础上难以区分的不同细胞之间。统计特征优选是相同细胞区划的直径上的变化、例如颗粒的直径的变化，和/或细胞区划的平均直径、特别是作为细胞区划的颗粒的平均直径。

此外，可以使用基于多个细胞的统计特征。例如，大量作为细胞的例如白细胞的细胞核的平均直径可以与被检查的细胞的细胞核的直径有关。

高度轮廓优选地用于检查细胞特征，尽管在进一步的实施例中可以检测附加信息，并且这可以被附加地提供作为显微镜方法的功能。例如，强度分布、极化或荧光性对比也可以用于使得能够实现更好的区分。

根据其中细胞类型使用确定出的定量细胞特征与进一步确定出的定量细胞特征的组合来确定的发明性方法的进一步实施例中，实现了在包括难以区分的多个不同细胞类型的异质性细胞混合的区分中的特别良好的结果。

细胞的细胞类型优选地在使用细胞区划的数量和细胞面积与细胞区划的面积的比率的组合的第一分类步骤和使用细胞区划的直径上的变化与细胞区划的平均直径的组合的进一步分类步骤中确定。发明性方法的该实施例特别地用复杂的细胞悬浮液分析、例如用例如区分白细胞的血球分类计数(differential blood count)证明了自身。

高度轮廓优选地通过将参考波叠加在物体波上、例如借助于相位对比显微镜记录所得到的干涉图和/或数学重建来检测。发明性方法的该特别有利的实施例特别适于确定定量特征；它主要有利于无标记血球分类分析。通过相位对比显微镜得到的图像可以特别好地再现并且具有高分辨率。

数字全息显微镜的使用特别有利，因为它允许物体的相位信息被定量地获取。根据发明性方法的进一步的实施例，高度轮廓因此借助于数字全息显微镜、干涉相位显微镜或定量相位显微镜来确定。这些显微镜方法允许特别高的轴向分辨率、即在显微镜的光轴的方向上的分辨率。数字全息显微镜允许z方向上的达1nm的分辨率。这对应于与利用其他已知光学显微方法(例如共聚焦显微镜)相比高100至1,000系数的精度。细胞类型的更准确的确定因此由于高度轮廓的精确确定而是可能的。

如果方法用一个或多个未染色和/或未干燥的细胞(多个)来执行则实现了进一步的优点。因为细胞的活力不受发明性方法的影响，所以通过方法确定的细胞可以继续用于在得出确定方法的结论之后影响(impact)分析。

根据进一步的示例性实施例，发明性方法可以包括利用标记进行的细胞的表型(phenotyping)和/或表达用于细胞的进一步分配的预定受体。这使得能够实现确定出的细胞的广泛的分子生物学检查。

如果根据使用全血液样本的进一步实施例执行和/或生物样本包括血细胞、白细胞、嗜酸性和/或嗜碱性粒细胞，则发明性方法得到特别的相关性。这主要在血液学中确定血球计数时使用。

在进一步的实施例中，细胞类型可以被确定以区分嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和/或单核细胞，和/或包括确定细胞功能性，特别是确定细胞、例如血小板的激活状态和/或细胞、例如变形红细胞和/或病原体影响的细胞的检测。

根据发明性方法的进一步实施例，细胞类型的确定可以包括细胞的细胞阶段的确定、特别是用于区分细胞年龄、细胞的生理或形态状态或者细胞的活动状态。这允许了例如细胞的激活处理的图像序列被记录。

上面提出的目的还通过被设定为执行方法的上述实施例中一个或多个的细胞分析装置、例如微芯片或微控制器来实现。

上面提出的目的还通过包括上述细胞分析装置的实施例的用于生物样本的细胞的细胞类型的无标记确定的显微镜装置来实现。显微镜装置优选地包括数字全息显微镜。

附图说明

将通过具体示例性实施例参照附图更详细地再次说明发明。图示示例是优选的示例性实施例。有着相同功能的元件在多个附图中具有相同的附图标记，其中：

图1示出有关白细胞种群的五个基本的细胞类型的草图，

图2示出有关发明性方法的实施例的示意草图，

图3示出根据发明性方法的一个实施例的细胞区划的确定和预定的定量细胞特征的确定的示意图，

图4a、图4b示出用于参照预定的定量细胞特征来确定细胞的细胞类型的示意草图。

具体实施方式

在发明性体外方法的帮助下，生物样本中的细胞的细胞类型可以以无标记(marker-free)方式来确定。在这里无标记意味着细胞不必用例如荧光性染料或放射性粒子来标记。生物样本可以例如包括动物或植物细胞、细菌细胞和/或原生动物的样本。优选地是全血液样本，包括例如血细胞10、例如白细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞。为了清楚起见，不同的示例性细胞类型在图1和图2、图3、图4a和图4b中用以下附图标记来标识：嗜酸性粒细胞10'、嗜碱性粒细胞10”、嗜中性粒细胞10”'、淋巴细胞10””和单核细胞””'。然而，为了易读性起见，附图标记10被用于示例性实施例的以下描述中的各细胞类型。

在图1的示例中，例如，示出了在小血球计数的情况下区分出的五种基本的白细胞。白细胞包括颗粒细胞10、例如嗜酸性粒细胞10、嗜碱性粒细胞10和嗜中性粒细胞10。非颗粒细胞10包括淋巴细胞10和单核细胞10。图1示出各细胞类型的例如一个细胞10。示例性非颗粒细胞10各具有细胞核12。余下的示例性粒细胞10具有不规则分叶(lobed)的细胞核12、换言之是多形核的。所有颗粒细胞10的共同之处在于它们在其内部具有例如多个颗粒12”。为了清楚起见，这些细胞中的颗粒12”中的仅一些在图1中用附图标记标识。白细胞10还在其细胞尺寸上不同。

细胞核12'和颗粒12”仅仅以示例的方式被提到作为该示例性实施例中的细胞区划12。可替代的细胞区划12例如是线粒体、液泡、细胞质或内质网。

图2示意性地示出发明性方法的示例性实施例的原理。图2示出被设计成精确地确定细胞的形貌、即高度信息的显微镜装置14。高度信息的分辨率为至少1微米、优选100纳米或小于100纳米、特别优选10纳米或小于10纳米。如图2的实施例中那样，显微镜装置14优选地包括数字全息显微镜。

数字全息显微镜(DHM)、也称作干涉相位显微镜的特征在于它可以在扫描中定量地检测物体的强度以及相位。不是如显微镜中传统的那样为此目的记录归因于光在物体上的吸收和散射而产生的强度分布。而是，记录产生于物体波和参考波的叠加的波前。物体的强度和相位信息可以在计算机的帮助下从中重建。

该显微镜方法适于检查生物样本，因为这些生物样本对于可见光是基本上透明的而不用进一步的样本制备并因此在传统显微镜中具有低对比度。记录相位信息使得能够非常精确地检测细胞的形态并在该信息的帮助下进行细胞的区分。

与传统上通过物镜(objective)中的相位环和聚光镜(condenser)中的环形孔口实施的传统相位对比显微镜相比，DHM具有可以定量地确定相位的优点。因此，也称作定量相位对比显微镜。它只是使得能够实现物体的高度轮廓的可再现性重建的相位的定量，并且只是由此可以自动地确定细胞类型。

应该参照如下的事实，光的相移由通过物体的光路长度、即物体的几何厚度来确定，以及折射率在这方面发挥作用。为了从相位信息获得真实的几何高度轮廓，样本的折射率必须是已知的。然而，在细胞的显微镜的优选应用中，可以假定很大程度上恒定且已知的折射率，由此相位信息可以直接转换成高度轮廓。可替代地，相位信息可以以不同波长来记录并因此作为结果可以计算出反射率的效果。

还应该注意的是，相位信息仅在360°的一个相位角度被唯一地确定。例如10°的测得的相移可以在现实中对应于370°、730°等的相移。唯一性范围相应地受限于光的波长。在选取的应用中，该限制可以同样在细胞的显微镜检查中忽略，因为生物细胞不具有陡边并因此邻接像素的相位值被提供作为连接条件。

在显微镜装置14的帮助下，检测各个细胞10的高度轮廓18(方法步骤S1)，并且这例如从数字全息图、高度轮廓图或干涉图确定。如果显微镜装置14包括例如声学显微镜，则高度轮廓可以从声谱图确定。方法步骤S1包括例如记录全息图、物体的相位和/或强度信息的迭代重建和/或相位信息至高度轮廓的转换。

载板16上的两个细胞10在这里以示例的方式示出。检测高度轮廓18包括检测细胞外形轮廓、即细胞表面的相对于载板16的高度轮廓。载板16可以包括例如载玻片或者本领域技术人员所熟悉的用于显微镜检查的另一基板。例如由聚合物制成的连续带材也可以用于高处理量显微镜，并且该带材可以在物镜的下方被连续地拉动。图2还示出执行方法步骤S2和S3的细胞分析装置13。

在这里所描述的示例性实施例中，示例性细胞10被确定，例如白细胞被区分开，并且这是例如基于细胞10的重建的相位信息。为此目的，首先使用检测到的高度轮廓18来确定细胞10的一个或多个细胞区划(S2)。在图2的示例中，左手侧的第一示例性细胞10的高度轮廓18示出了例如指向于多形细胞核12'的存在的两个明显升高。另外，例如，可以看到高度轮廓18的三个较小升高，并且这些升高指向三个颗粒12”。与这相比，第二细胞10的高度轮廓18指向单个核细胞核12'和四个颗粒12”。在进一步的方法步骤S3中使用确定出的细胞区划12来确定预定的定量细胞特征，例如细胞区划12中的一个的数量或者细胞区划12中的一个的直径。接着使用定性细胞特征来确定细胞10的细胞类型(S3)。在图2的示例中，使用高度轮廓18来确定例如嗜酸性粒细胞10(在图面中的左侧)和嗜碱性粒细胞10(在图面中的右侧)。

图3示出细胞区划12的确定(S2)的示意图。图面的最顶端示出用于此目的的在载板16上的细胞10的示例性高度轮廓18。在第一步骤中，例如，为此目的确定细胞10的细胞体积。用于使用高度轮廓来确定细胞体积的方法对于本领域技术人员来说是从现有技术已知的(例如，跨越细胞的整个面积的高度的积分或总和)。细胞的面积可以例如在吸收对比度或高度轮廓中的阈值的基础上发生。

在进一步的中间步骤S2a(参见图3中的中间图示)中，指示出细胞区划12中的一个的、在本示例中是作为第一细胞区划12的细胞核12'的后续分段。分段在用于该细胞区划12的高度信息的基础上发生。分段可以例如通过由相位对比方法产生的干涉图的提供而发生。当使用可替代的显微镜装置14时，高度轮廓的提供可以包括例如激光、筛分或联合超声波的扫描。图3的中间图示示出了两种辅助线20，利用两个竖直辅助线20限制高度轮廓18的描述示例性第一细胞区划12'的分段并且利用水平辅助线20标记出例如描述了第一细胞区划12'的高度50％的值的预定阈值。对于细胞10的余下部分，该阈值例如从分段区域的平均高度并且例如最大高度计算出，以便由此确定例如细胞区划12或进一步的细胞区划12的直径及其数量。本领域技术人员可以使用用于将第一细胞区划12分段的多种标准方法，诸如，例如，在具有图像点和高度值的矩阵的帮助下确定平均高度。另外，可以在计算中考虑描述了载板16的倾斜平面的角度。

换言之，不同的细胞区划12例如可以用不同的阈值或选择标准来分段。为了确定进一步的细胞区划12，不进一步考虑第一区划的面积。如果例如第一细胞区划12是细胞核12'并且如果第二细胞区划是颗粒12”或多个颗粒12”，则可以例如在第二分段处理中假定在细胞核12'的部位没有颗粒12”。

方法步骤S2b(图3的底部)示出细胞区划12的确定。为此目的，可以通过确定进一步的基线22并入例如进一步的对比机制。该进一步的基线22可以例如代表用于进一步的细胞区划12的进一步的阈值。在本示例中，阈值例如被选取成确定一个或多个颗粒作为细胞区划12”。由此可以确定例如颗粒的数量、直径和/或平均尺寸。可替代地或另外地，可以确定例如每个细胞面积的细胞区划12”的数量。

在本示例性实施例中，定量细胞特征以示例的方式通过细胞核的数量、细胞面积与细胞核的面积的比率、颗粒的平均直径及颗粒的直径上的变化来确定。可替代地或另外地，例如细胞体积、细胞区划的体积、细胞面积、细胞区划的面积、细胞体积与细胞核体积的比率可以借助于定量细胞特征来检测。图4a和图4b示出使用确定出的细胞特征进行的细胞10的细胞类型的确定。图4a示出用于给细胞10或多个细胞10分类的矩阵，其纵坐标Y表示例如参考区划12的数量、例如细胞核12'的分叶的品质，并且其横坐标X表示例如细胞面积与细胞核的面积的比率。附加的虚线辅助线20被示出以说明分类。如果示例性细胞混合物的细胞10根据所述示例性定量细胞特征在矩阵中被分类，那么可以清楚地确定出存在的淋巴细胞10、单核细胞10和嗜中性粒细胞10。进一步的簇例如通过嗜碱性粒细胞10和嗜酸性粒细胞10形成。

示例性粒细胞可以早在图示步骤S3a中清楚地彼此区分开。在区分示例性嗜碱性粒细胞10和嗜酸性粒细胞10上的改进可以通过根据进一步的定量细胞特征的进一步的分类来实现。这示出在图4b中。已证明，如果示例性的两个进一步的定量细胞特征描述了使用多个细胞10的各个高度轮廓确定出的细胞特征的统计特征，则在这方面证明是特别有利的。在图4b的示例中，在纵坐标Y上绘制出例如颗粒的直径上的变化，而在横坐标X上绘制出颗粒的平均直径。以虚线的方式意在也辅助这里的分类的矩阵清楚地示出了细胞10的分隔。

上述示例性实施例可以例如为了确定细胞10的细胞功能性而发生，特别是作为例如白细胞和/或非外周血细胞和/或病原体感染的细胞10的功能性的确定。白细胞的功能性可以例如使用体积上的改变、颗粒的数量上的改变和/或细胞核上的改变来确定。非外周血细胞10的示例是例如骨髓细胞和未成熟细胞。所描述的方法也可以例如在例如感染的情况中的灌洗(lavage)的过程或在感染的情况中的脑脊液的检查期间发生。这也使得能够实现寄生虫感染的无标记确定，诸如，例如，在限定的细胞周期阶段(其中期望早期诊断)确定红细胞中的疟疾寄生虫。

可替代地或另外地，细胞类型的确定可以包括细胞10的细胞阶段的确定，特别是为了细胞年龄、例如颗粒嗜中性粒细胞的年龄的区分，其中，例如，在例如与成熟的、圆形嗜中性粒细胞相比年轻的棒状嗜中性粒细胞的情况中在分类矩阵中发生移位。也可以例如在病理血液诊断的检测的背景下归因于例如缺铁症而通过嗜中性粒细胞的过度分段核(over-segmented nuclei)来确定细胞10的生理或形态状态。进一步的示例是例如变形的红细胞、例如存在例如镰状细胞贫血时的棘红细胞的检测。进一步的示例是在红细胞的尺寸分布的背景下的细胞类型的确定以区分网织红细胞(reticulocyte)、即年轻的红细胞。也可以在所描述的发明性方法的背景下执行例如静息的和/或激活的血小板的通过在形态上的改变进行的区分。

用于创建血球分类计数(differential blood count)的当前使用的途径可以通过发明性方法无标记地执行。用于创建血球分类计数的示例性过程包括例如确定细胞尺寸、细胞的成熟状态、即细胞的年龄、核血浆比率(core plasma ratio)、细胞质内含物(cytoplasmic inclusion)的检测和染色质结构(chromatin structure)的检测。

上面提到的示例性实施例阐明了在通过显微镜装置检测到的高度轮廓18的帮助下监测细胞10的至少一个细胞区划12并且使用确定出的细胞区划12和/或高度轮廓18来确定定量细胞特征的发明性原理。

理想地，自动的且无标记的显微镜技术被用于使诸如例如将细胞10染色等的样本制备步骤最小化，并且此外用于使得能够实现定量细胞特征的无标记确定、例如细胞10体积确定。干涉显微镜或数字全息显微镜优选地使用，并且这使得例如能够实现例如白细胞10的无标记血球分类计数检查，因为它可以使用例如粒度、细胞核形态和细胞体积来区分例如嗜酸性和嗜碱性粒细胞10。这同时构成了在例如白细胞种群的区分上的最大挑战。

不同细胞类型可以在例如细胞10的形态的基础上进行区分。虽然例如淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞可以由于例如其不同的尺寸和细胞和形态而非常容易地区分，但增加的需求置于例如嗜酸性和嗜碱性粒细胞的区分上。

借助于例如数字全息显微镜(DHM)的形貌信息被用于区分。在第一步骤中，在高度信息的基础上将细胞区划12、例如细胞核12'分段。接着从例如分段区域的平均高度并且例如最大高度对于细胞10的余下部分计算出阈值(例如，50％)以便由此确定例如颗粒的直径及其数量(图3)。接着可以从该参数导出区分(图4a、图4b)。例如，细胞核12'的尺寸和形式可以用于区分例如淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性和嗜碱性粒细胞(图4a)。以下定量细胞特征以示例的方式用于此：细胞10的体积与细胞核12'的体积的比率，例如多形细胞核12'的数量和/或体积，关于例如颗粒的数量、直径和粒径分布的信息，其接着用于区分例如嗜酸性和嗜碱性粒细胞(参见图4b)。

干涉显微镜、也称作数字全息显微镜(DHM)的特征在于它可以在扫描中定量地检测物体的强度以及相位。为此目的，检测产生于物体波与参考波的叠加的波前，而不是如显微镜中传统的那样检测物体的图像。物体的强度信息和相位信息可以在细胞分析装置、例如计算机的帮助下由此重建。

这些显微镜方法适于生物样本的检查，因为它们对于可见光是基本上透明的而不用进一步的样本制备并因此在传统显微镜中具有较低对比度。通过记录相位信息能够非常精确地检测细胞10的形态并且能够在该信息的帮助下进行细胞10的区分。

例如白细胞的基于例如多个细胞10的重建的相位信息的区分可以在没有必要将细胞10染色的情况下执行，并且因而能够用新鲜的未干燥的细胞来工作。作为结果，避免了在干燥和染色期间由处理样本的不同方式所产生的不必要的假象。图像可以被再现并且归因于自动计算机辅助图像处理可以更容易区分。处理步骤的数量被最小化。节省了成本和时间并且作为结果使得可靠且快速的诊断成为可能。

因此与血液分析仪相比可以省却在预分析期间例如变圆缓冲液(roundingbuffer)(即，高度稀释的SDS缓冲溶液)的使用。变圆缓冲液将导致细胞的变圆，然而适于利用流式细胞术的散射光测量的该细胞变圆同时导致假象。例如红细胞是非常敏感的并且形成棘红细胞。

发明包括以下方面：

1.一种用于区分血细胞的方法，基于：

a)记录物体的干涉图，

b)物体的相位信息的重建，和

c)处理相位图像以区分不同的血细胞。

2.一种用于区分血细胞的设备，包括：

a)数字全息显微镜，

b)用于计算物体的相位信息的重建软件，和

c)自动的图像处理，以区分各种血细胞。

用于进一步的独立方面的特征包括：

-通过使参考波叠加在物体波上进行的干涉图的发展

-使用相位信息以便例如确定完整细胞10或细胞10的单个分段的体积，

-使用未染色且未干燥的血细胞，

-待区分的示例性血细胞例如是白细胞，

-待区分的示例性白细胞例如是嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，

-细胞体积与细胞核体积的比率例如被用于区分，

-细胞区划12的、例如多个颗粒的直径例如被用于区分，

-细胞区划的、例如颗粒的数量例如别用于区分，

-区分例如在例如首先在细胞核体积的基础上并接着例如在颗粒信息的基础上的多阶段处理中实现，

-例如干涉显微镜与用例如包括例如抗体和纳米粒子的标记进行的免疫分型(immunophenotyping)的组合，纳米粒子例如是包括例如金、镁或二氧化硅的对比粒子；另外地或可替代地，与例如用于细胞类型的进一步区分的限定的受体的表达。

发明包括超越例如嗜酸性和嗜碱性粒细胞的示例性区分的以下方面：

-例如直接在血液血浆中、优选接近体外条件的例如多个细胞10的显微镜；例如枸橼酸盐血液、肝素化血液、EDTA血液以防止血液凝固，

-没有标记的例如颗粒细胞10的激活可以在显微镜下进行检查(例如，在以示例的方式由粒细胞10排放的例如颗粒12”上的改变)，

-例如颗粒嗜中性粒细胞的例如年龄的区分可以在没有标记的情况下实现(“左移”对应于年轻的强核嗜中性粒细胞)，

-归因于例如缺铁症而通过例如嗜中性粒细胞的过度分段核进行的病理血液诊断的检测(用词：“右移”)，

-例如变形的红细胞(例如棘红细胞、镰状细胞贫血)的检测，

-例如用于网织红细胞(年轻的红细胞)的区分的红细胞的尺寸分布，

-归因于形态上的改变的静息和激活的血小板的区分，

-例如非外周血细胞(例如骨髓；未成熟细胞)、灌洗(感染)脑脊液(感染)的显微镜，

-寄生虫感染(例如疟疾、即限定的细胞周期阶段中的红细胞中的寄生虫；需要早期诊断)的无标记确定。

血球分类计数中的当前过程因而可以使用例如干涉显微镜14无标记地执行；例如细胞尺寸、成熟度、核血浆比率、细胞质内含物、染色质结构。

Claims (15)

1.一种用于生物样本中的细胞(10)的细胞类型的无标记确定的体外方法，其特征在于进行以下步骤：

利用显微镜装置(14)检测(S1)所述细胞(10)相对于载板(16)的高度轮廓(18)；由所述细胞分析装置(13)使用所检测到的高度轮廓(18，S2)来确定所述细胞(10)的细胞区划(12，12'，12”)，

由所述细胞分析装置(13)使用所确定出的细胞区划(12，12'，12”，S3)来确定预定的定量细胞特征，其中所述预定的定量细胞特征对应于已知的细胞类型，以及

由所述细胞分析装置(13)使用所确定出的定量细胞特征来确定所述细胞(10)的所述细胞类型，其中所述细胞类型选自如下组，所述组由由血小板、红细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和/或单核细胞组成。

2.如权利要求1所述的方法，

其特征在于

所述定量细胞特征描述细胞体积、所述细胞区划(12，12'，12”)的体积、细胞面积、所述细胞区划(12，12'，12”)的面积、细胞体积与细胞核体积的比率、细胞面积与细胞核面积的比率、所述细胞区划(12，12'，12”)的直径、圆度或周长、所述细胞(10)的细胞区划(12，12'，12”)的数量、和/或使用多个细胞(10)的各个高度轮廓(18)确定出的细胞特征的统计特征。

3.如权利要求1或2所述的方法，

其特征在于

所述细胞类型(S3)使用所确定出的定量细胞特征与进一步确定出的定量细胞特征的组合来确定。

4.如权利要求1或2所述的方法，

其特征在于

所述细胞(10，S3)的所述细胞类型在使用所述细胞区划(12，12'，12”)的数量和所述细胞的面积与所述细胞区划(12，12'，12”)的面积的比率的组合的所述细胞(10)的第一分类步骤中确定，并且包括使用另一细胞区划(12，12'，12”)的直径上的变化与所述细胞区划(12，12'，12”)的平均直径的组合的进一步的分类步骤。

5.如权利要求1或2所述的方法，

其特征在于

所述高度轮廓(18)通过使参考波叠加在物体波上、记录所得到的干涉图和/或数学重建来确定。

6.如权利要求1或2所述的方法，

其特征在于

所述高度轮廓(18)借助于数字全息显微镜、干涉相位显微镜或定量相位显微镜来检测。

7.如权利要求1或2所述的方法，

其特征在于

所述方法用未染色和/或未干燥的细胞(10)来执行。

8.如权利要求1或2所述的方法，

其特征在于以下步骤：

用标记将所述细胞(10)进行表型，和/或

表达用于所述细胞(10)的进一步区分的预定受体。

9.如权利要求1或2所述的方法，

其特征在于

所述方法使用全血液样本来执行，和/或所述生物样本包括血细胞、白细胞、嗜酸性和/或嗜碱性粒细胞。

10.如权利要求1或2所述的方法，

其特征在于

确定所述细胞类型(S3)包括确定细胞(10)的细胞功能性，和/或细胞(10)的检测。

11.如权利要求10所述的方法，

其特征在于

确定细胞(10)的细胞功能性包括确定细胞(10)的激活状态。

12.如权利要求10所述的方法，

其特征在于

细胞(10)的检测包括变形的红细胞和/或病原体感染的细胞(10)的检测。

13.如权利要求1或2所述的方法，

其特征在于

确定所述细胞类型(S3)包括确定所述细胞(10)的细胞阶段。

14.如权利要求13所述的方法，

其特征在于

确定所述细胞(10)的细胞阶段包括区分细胞年龄、所述细胞(10)的生理或形态状态、或所述细胞(10)的活动状态。

15.一种用于生物样本的细胞(10)的细胞类型的无标记确定的显微镜装置(14)，包括被设计成执行权利要求1至14中任一项所述的方法的细胞分析装置(13)。