CN103328921A - 单镜头全视场反射相显微镜 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种全视场反射相显微镜。在优选的实施方案中，本发明能够结合应用低相干干涉技术和离轴数字全息显微镜技术(DHM)。当使用低相干光源提供一种深度选择测量方法时，基于反射的离轴数字全息显微镜技术(DHM)给出了细胞动力学的高敏感度和单镜头成像。系统的实施方案使用参考臂中的衍射光栅来产生超过整个视场的均匀对比度干涉图像，即使是低相干光源。由于具有改善的路径长度敏感度，本发明适用于在活细胞中对膜动力学进行全视场测量，所述测量具有亚纳米级的敏感度。

Description

单镜头全视场反射相显微镜
联邦政府资助的研究或发展的声明
本发明为国家中心针对美国国立卫生研究院(P41-RR02594-18)以及美国国家科学基金会(DBI-0754339)的研究资源进行研究。
相关申请
本申请要求保护2011年1月25日申请的美国专利申请第61/436,026号的优先权。上述申请的全部内容在此通过引证并入本文。
背景技术
生物微观流变学是针对活细胞力学性能的定量研究科学。力学性能的变化是持续细胞生理过程的固有指标，例如增加某些癌细胞的弹性，疟疾感染红血球细胞膜刚性的变化，以及细胞间粘附性的变化。由于细胞膜流变学特性的测量也可以间接地提供细胞内部结构的信息，因此它是有利的。现有技术中存在大量不同的技术用于评估活细胞细胞膜的流变学特性。这些技术包括原子力显微镜(AFM)、光镊和磁镊技术、吸管抽吸技术、电场变形技术、以及全视场投射相位显微镜。许多这样的方法应用了大形变技术，该技术能够引起非线性响应。针对点测量技术(例如AFM)，对细胞膜大表面积进行探测的扫描时间为几分钟，因而妨碍了在更大的表面积上对高速细胞膜动力学的研究。透射相位显微镜已经成功的应用于对血红细胞细胞膜流变学特性的测量，其中血红细胞具有二维双层骨架。但是，大多数种类的细胞具有复杂的三维内部细胞结构，致使大多数上文提到的技术不适用于对细胞膜以及细胞整体性质的结合进行探测，其中细胞膜和细胞整体性质的结合很难解耦。
因而在测量复杂的生物系统以及其他科学与工业计量学应用中，需要进一步改进现有的相位显微镜技术。
发明内容
本发明内容涉及全视场基于反射的相位显微镜。本发明系统和方法优选的实施方案包括：在一般细胞型中对小特性结构的测量，例如等离子体和/或核膜的动力学。例如与血红细胞相比，这些细胞由于三维细胞骨架的存在而非常稳定，因而显示了相应的细胞膜波动远远小于用透射相位显微镜进行检测的波动。在这方面，基于反射的光学方法能够给出优于基于传输的光学技术的2n/Δn的灵敏度测量的优势。优选的系统和方法利用来自光源的部分光束来进行光照，这些光束也用于照射用于测量的材料。来自光源的选定衍射级的光束被耦合到二维检测器阵列上，其中所述二维检测器阵列沿着材料的选定视场或者图像场的图像。该方法给出材料全视场干涉图像。
低相干干涉测量法被用于对感兴趣的选定深度的材料内部反射信号进行取样。在过去，基于反射纤维显微镜装置的谱域和时域光学相干断层扫描法(OCT)在限定其的用途时具有局限性。在此之前，例如已经应用了基于谱域光学相干断层扫描法(OCT)和线光源的定量相位显微镜。线场反射相位显微镜通过使用低相干光源和聚焦光栅成功的获得了具有亚纳米轴向分辨率的细胞膜表面形态。应用线场方法，显示了每1kHz帧频具有沿着线光源的过百个数据点。第一全视场相敏OCT被记载使用扫频光源OCT装置，需要波长为1024的编码图像来形成一种大容量图像。但是，采样率(25ms每波长积分时间)不足以用来研究细胞动力学。
由于需要获得多个图像，以往尝试了对基于限定了时间分辨率(1.25秒)的相移干涉技术的时域反射相位显微镜进行应用。这是一种尝试，通过使用具有低相干光源的离轴数字全息技术来得到单镜头全视场相图，但是参考镜面的倾斜导致干涉对比不均匀，进而阻碍了全视场成像。
因此，本发明提供了首次单镜头全视场反射相显微镜，该技术基于低相干光源和离轴干涉测量法。所述的低相干光源可以是脉冲激光、超发光二极管或者一种时间和/或空间低相干光源，例如金属卤化物灯(非相干光)。该系统提供了参考光束的波前倾斜，因此其对通过整体视场(或者成像场)的样品光束进行干涉。对单镜头干涉图像进行处理来确定光束的光学相位，该光束为通过进行检测的样品反射回来的光束，给出样品的表面形貌，不需要点阵或一维扫描。由于单镜头干涉图像被要求对样品相位进行恢复，从细胞和相机帧速率返回的光束的量决定了表面成像的速度。因此，本发明提供了例如用于观测HeLa细胞中细胞膜运动的1kHz全视场成像，其中例如细胞膜运动与热敏波动有关。
本发明的一个优选实施方案提供了一种定量反射相位显微镜技术，该技术基于剖视面光学相干断层扫描技术以及离轴数字全息技术。该系统能够通过应用参考臂中的衍射光栅为离轴干涉法提供倾斜于参考光束的所需要的角度。全视场光源允许单镜头相位测量在所关心表面上的多个点，以及能够通过使用自相位参考法来消除共模噪声，所述共模噪声由于使用区分参考臂的干涉系统而产生。在这一全视场反射相显微镜中，自相位参考消除的相位噪声，减低到
Figure BPA0000175246660000041
。由于具有如此高的相位灵敏度，该系统能够消除例如视场中的细胞表面热运动，其中所述的热运动能够为大约100微微米至150纳米之间。全视场反射相位显微镜的一种应用是使用对等离子或细胞膜的波动来估算细胞膜的力学性能，或者估算细胞骨架或细胞核骨架的粘弹性性能。这些在细胞力学性能中的变化能够作为非侵入性生物标记物来测量一般细胞型的病理生理学。该系统也能够给出细胞能动性的全视场以及多细胞成像，包括单个哺乳动物细胞中动作电位驱动的细胞膜运动。
本发明优选的实施方案能够用在与工业测量有关的应用程序中，例如小型设备制造工艺，又例如集成电路。
附图说明
附图1A-1B包括一种全视场单镜头反射相位显微技术的示意图，该技术使用光栅、空间滤波器，其中：Ti：蓝宝石光源，其中SMF：单模光纤、Li：第i个球面镜片、BSi：第i个光束分离器、G：衍射光栅、Si：第i个空间滤波器；并且其中附图1B显示了一种具有平坦表面的样品的干涉图像。
附图2A-2E包括一种通过单镜头全视场反射相显微镜测量的40微米直径的聚苯乙烯微球表面形态；附图2A是初始干涉图像，附图2B是附图2A的二维傅里叶变换的振幅组分；附图2C是附图2A的空间滤波图像；附图2D是附图2C的逆傅里叶变换的相位组分；以及附图2E是附图2D的展开相图。
附图3A所示的是一种用于确定FF-RPM灵敏度的系统装置。
附图3B是一种检测的相位波动(弧度)，作为施加电压的函数，其中M±：第i个镜面，且PZT：锆钛酸铅。
附图4A-4B是相干门的位置，分别用于双程透射和反射相位成像。
附图4C是HeLa细胞的双程透射显微图像。
附图4D是附图4C中方框内区域的单镜头反射相图。
附图5A-5B是细胞膜波动测量的系统和结果；其中附图5A是相干门的位置，其中将样品倾斜一定角度，允许能够同时获得细胞膜波动和通过盖玻片的背景相位；并且，附图5B是细胞膜波动的功率谱密度，该密度作为频率的函数针对三种不同的组：蓝色，放置福尔马林；绿色，正常；以及红色，CytoD处理的HeLa细胞。
附图5C所示的是一种根据本发明优选的实施方案来进行全帧反射和/或透射显微镜的方法。
附图6A是一种相位显微镜系统，该系统使用了空间低相干光源，例如金属卤化物灯。
附图6B是通过附图6A所示的系统检测的干涉图像。
附图7A-7C是具有作为空间低相干光源的金属卤化物灯的反射相位显微镜系统，在参考光路中分别使用光栅和空间滤波器，并且相应地由此获得的图像。
附图8A-8C是根据本发明优选的实施方案的一种噪声消除方法。
附图9A-9C所示的是使用空间低相干光源的球体表面的相图。
附图10A和10B所示的是系统稳定性的测量。
具体实施方式
附图1A是本发明优选的实施方式的原理图，该原理图给出了单镜头全视场反射相显微镜(FF-RPM)。将来自锁模Ti的光束：蓝宝石激光(中心波长，Xc＝800nm)，耦合到用于传递并且用于光谱展宽的单模光纤15上。光谱宽度半值宽度，测量在光纤输出上的Δλ为50nm，其在一种具有折射率的典型培养基上产生4μm的双程相干长度，n，等于1.33。样品光束，沿着第一光路进行传输通过透镜L2、L3、L4，以及水浸物镜60*L5(NA＝1.2)，经样品表面24反射，并且透镜L6和L15在高速互补金属氧化物半导体(CMOS)相机上形成样品图像。所述相机可以是一种像素化图像检测器20，将其耦合到能够处理图像的数据处理器或者计算机22上，将图像提供给显示器26或者存储器28用来进一步处理和存储图像。所述计算机能够耦合到平移台25和40上，所述平移台能够控制样品和参考镜面的位置，所述样品和参考镜面位于三个正交方向上以及相对于来自光源入射光的方向成一定角度取向。参考光束通过使用光束分离器BS2在其返回路径上转到第三光路12上。部分通过BS2返回的参考光束使用空间滤波器SI进行阻断。另一方面，转向的光束通过透镜L11-L14，并且在第三光束分离器BS3作用下与返回的样品光束在第四光路27结合。针对离轴干涉法，将衍射光栅G(50)引到其中一个共轭平面中。由于有多个衍射级，通过移动在透镜L12的傅里叶平面中的空间滤波器S2(60)，只有第一衍射级能够被选出。因此，衍射参考光束对样品光束进行干涉，该样品光束是沿着路径29在图像平面中呈一定角度。人们注意到衍射光栅周期以及在光栅与相机之间的放大倍数为离轴干涉提供了针对参考光束的需要角度偏差。此外，这种方法提供了穿过整个参考光束波前的相同的路径长度，而不是现有的系统中用于离轴干涉法的仅将参考镜面进行倾斜。
换句话说，由于光栅和相机能够满足成像条件，那么从光栅上任一点到相机上对应的像素间测量得到的光学路径长度是恒定的。因此，这一条件给出了穿过整个视场的单色条纹可见度。人们注意到，所述系统能够在双程透射模式和反射模式中得到定量的相图，所述图像通过分别移动在载玻片上或者是在细胞膜上的相干门(参见附图4A中的400)来得到。
附图1B是样品平坦表面上测量的干涉图像。空间条纹是直的，并且当样品平坦时是等距分布的。在CMOS相机上的总测量强度可以写为：
Figure BPA0000175246660000081
其中IR和Is(x，y)分别是参考和样品光束强度分布。μ和υ代表沿x轴和y轴的空间条纹频率，并且
Figure BPA0000175246660000082
是与研究样品有关的空间变化相位。也能够得到一种无条纹的图像，该图像代表了在Eq.(1)中的DC部分，由于使用平移台25将相干门移出样品。通过从最初的干涉图像中消除无条纹图像，产生干涉项。
附图2A所示的是通过全视场反射相显微镜记录的2-D干涉图像的干涉部分，使用40微米的微球体作为样品。所述条纹通过对微球反射的样品光束波前修饰进行变化，其中所述的条纹是直的并且是针对平坦样品等距分布的。为了选出研究的样品形态，对2-D干涉图像的干涉部分进行Hilbert变换，从而产生返回的样品光束的振幅和相位。对于相位成像Hilbert变换应用的更为详细的信息，参见2006年3月24日公开的美国第11/389,670号专利，该专利的全部内容作为参考内容引入本申请。在过去，这一方法已经用于在透射型定量相位显微镜中得到样品的振幅和相位信息。对于透射相位显微镜的更多的信息，参见2008年7月10日公开的美国第12/218,029号专利，该专利的全部内容作为参考内容引入本申请。
附图2B是附图2A中干涉图像2-D傅里叶变换的振幅。更为具体的，1st和-lst阶分量分别在第一和第三象限中显示。首先，剪切或者选取傅里叶图像中的1st阶分量，将上述分量转移到傅里叶平面的中心(参见附图2C)，然后进行傅里叶逆变换。傅里叶逆变换图像的相位(附图2D)给出了样品光束波前的光学相位。通过展开2-D空间相位，得到如附图2E所示的不具有2丌相位模糊度的样品表面形态。
活细胞内的细胞膜波动通常为约纳米级或者更小；这些微小细胞膜波动的测量要求发展具有高信号-噪声比(SNR)的定量相位显微镜技术。全视场RPM灵敏度的测量能够以最小可检测的轴向运动方面进行阐述；附图3A是用于测量灵敏度的装置。把全视场光源的光射到两个表面上；镜面或者反射镜MI被安装到平移台200上，并且镜面或者反射镜M2被耦合到锆钛酸铅(PZT)制动器202上。
为了消除参考光路对样品光路的独立机械或者热波动所产生的共模噪声，可以使用自相位参考法。因为在全视场光源中所有点的相位同时得到，所以视场中的每一个点都与任意其他的点分享同一干涉噪声。这一方法将照向反射镜MI的部分光束测量的相位作为参考相位，表示共模噪声。通过将这一参考相位从M2上后续点的相位中消除，所述共模噪声被消除从而得到进表面M2的实际波动。
为了证明共模相位噪声的消除，PZT制动器在400Hz的频率下驱动，但是PZT驱动电压的振幅在0.02-5伏特间变化。在1微秒间隔下持续时间为1秒作用下，同时得到M1和M2的单镜头相图。通过M2测量相位的时间波动来计算时间公率谱密度(PSD)，同时选择400Hz时的PSD平方根来确定轴向运动信号。附图3B是作为PZT驱动电压函数的400Hz时测量的轴向运动；图像适用于14.5mrad/V曲线。附图3B也表示了噪声分布，对该噪声分布进行估算是通过对395-405Hz的PSD平方根取平均值获得的，其中不包含400Hz频率的PSD值。最大噪声仅为
Figure BPA0000175246660000101
相当于
Figure BPA0000175246660000102
这是由于相位变化
Figure BPA0000175246660000103
与轴向位置变化Δ1线性相关：
Figure BPA0000175246660000104
其中n是介质折射率(通常n＝1.33).
为了证明活细胞额高速定量成像，HeLa细胞测量前在盖玻片上培养2天并且浸入到标准培养基中(达尔伯克(氏)改良伊戈尔(氏)培养基)。正如前面所述的，所述装置能够取得透射相图以及反射相图。附图4A和4B所示的是分别用于双程透射相位成像以及全视场反射相位成像的相干门400、402的位置。在双程透视相位成像中，照明光束穿过细胞，由玻璃表面反射器404反射，并随后再次穿过细胞。测量的透射相位差
Figure BPA0000175246660000109
与光学厚度(OT)目关：
Figure BPA0000175246660000105
其中是在培养基和细胞质之间的折射率差的平均值，同时h是细胞高度。附图4C所示的是活HeLa细胞对应的透射相图。通过对Eq.(2)中的
Figure BPA0000175246660000107
以及
Figure BPA0000175246660000108
进行取代来粗略估计细胞的高度使其为8.5μm。
针对全视场反射相位成像，焦平面以及相干门移动到具有门402的细胞表面406上。由于来自不相干门区域的反响散射光对干涉无作用，在相干门内的细胞表面的全视场相位信息(参见附图4D)根据附图4B的描述进行收集。在这种情况下，反射相位差
Figure BPA0000175246660000111
直接与高度差Δh(x，y)相关：
Figure BPA0000175246660000112
其中nm是培养基的折射率，并且通常为1.335.
当对Eqs.(3)与(4)进行比较，反射式成像的优势是明显的。例如，反射相图中10毫弧度的相位变化相当于0.5纳米，但是在传输中的相同相位变化相当于20纳米。换句话说，假设透视和反射模式测量的相位灵敏度是相同的，反射相位成像的高分辨率(或者测量灵敏度)比透射测量的高分辨率(或者测量灵敏度)超过40倍
Figure BPA0000175246660000113
。此外，反射相图能够揭示独立于细胞内折射率分布的细胞表面形态，这是由于其仅仅依赖于介质的折射率，所述折射率能够通过常规折射仪进行准确测量。
正如前面介绍过的，细胞膜波动是整体细胞状态的固有指标，并且用于估测与人红细胞中疟疾感染不同阶段的细胞膜机械特性。但是对于具有复杂内部结构的真核细胞，现有的全视场反射相显微镜通过有效地选择来消除内部细胞结构的作用能够选择性的测量细胞膜波动。HeLa细胞中的细胞膜波动在不同的细胞状态下进行测量。更为具体的，考虑(i)活的常规HeLa细胞的样品，(ii)一种用2％多聚甲醛处理后的放置HeL a细胞样品，以及(iii)用8nM细胞松弛素-D处理的HeLa细胞样品，其中细胞松弛素-D抑制肌动蛋白聚合。图像采集的帧速率设置为1KHz，并且对每个细胞进行持续时间为1秒作用的数据记录。
如附图5A所示，进行测量的样品通过平移台倾斜或旋转一个角度502，从而同时获得细胞膜波动以及来自盖玻片的背景相位。通过减去在盖玻片上观测的背景相位变化，来消除共模机械噪声。对细胞表面随时间的波动进行检测，并计算每个细胞细胞膜运动的PSD值。平移台也能够将样品移到任意三个正交方向504中。附图5B所示的是每个细胞群的平均PSD值。在本发明研究中使用的，正常、放置、和细胞松弛素-D处理的细胞数量分别为N＝22、20和33。对放置细胞的PSD值进行测量发现放置细胞比正常细胞更小且更平坦，这表明细胞膜在化学放置后变的更硬。另一方面，测量的细胞松弛素-D处理的细胞的PSD值比正常细胞的值更大，这表明由于肌动蛋白聚合的抑制使细胞膜变的更柔软。
附图5C说明了根据本发明用于测量样品的处理程序500。光源，例如激光14，产生信号(单镜头)510，将耦合520到样品和参考42上。平移台40能够放置530与相干门有关的样品24。图像在选定的帧速率下进行检测540并且记录550，优选至少为20帧每秒，或者为至少30帧每秒或更多的更快的动态过程。对该图像进行处理560，包括在傅里叶平面570中图像数据的位置。对图像进行解相位580，并且消除噪声分量590用来显示和记录样品的定量数据。
附图6A中显示的是具有空间低相干光源的全视场反射相显微镜(FF-RPM)，并且没有光栅。可以使用一种宽带光源，例如金属卤化物灯600。附图6B是一种干涉图像，该图像通过使用附图6A系统的相机获得，所述图像具有圆形图案。
在附图7A中显示的是本发明的一个优选的实施方案，该实施方案使用具有光栅705和空间滤波器707的FF-RPM。附图7B是一种干涉图像，该图像通过使用附图7A和附图7C所示系统的相机得到，所述图像显示了附图7B的指示区域的放大视图，其中L1-L6是透镜，OL1和OL2是物镜，BS1-BS3是分光器IP：图像平面，以及FP：傅里叶平面。宽带光源，如金属卤化物灯700，提供了成像光源和激光光源702，其中成像光源为具有600nm中心波长的X-Cite120(mfr.EXFO，加拿大)，并且激光光源702是一种具有632nm发射波长的二级管激光器(埃德蒙光学)。
空间非干涉光源700(金属卤化物灯)发出的光束被分成两束；从样品反射的样品光束750，同时引导该光束750穿过分束器752和754到达相机20。参考光束760用分束器762和反射镜764、766被引导至相20。用于成像的空间和时间上的非相干光(例如，金属卤化物灯)包括成像光源。通过样品反射的光聚焦到成像平面(IP)上，其中成像平面在L1和L3之间。在IP上的样品图像聚焦到相机上。
从参考镜面反射的光束聚焦到L2和L4之间的光栅705上。光栅的图像聚焦到相机上，但是只有第1阶衍射光束被传递。
如果将光栅移动到L2和L4之间(参见附图6A)，通过相机得到干涉条纹的靶心(参见附图6B)。在附图7A中插入光栅705和空间滤波器707，入射到相机上的衍射参考光束具有角度710，因此通过相机20得到具有多个条纹的干涉图像(参见附图7B)。附图7C是附图7B指示区域720的放大图。
附图7A所示的激光702(空间和时间上的相干光源)用于监测系统的机械噪声。激光702的功能通过附图8A-8C中的参考体系来描述。用于从具有多个条纹的干涉图像中出检索相位信息的变换(Hilbert变换)，能够使用与所述空间相干光源相关的相同的方法。
附图8A-8C显示了用于共模噪声消除的系统。附图8A所示的是用于监测机械(共模)噪声的成像光束和激光光束的详细组态。附图8B是干涉图像的示意图。附图8C是样品形态的侧视图。由于系统的机械不稳定性，干涉图像的条纹随着时间的推移而移动。为了对机械噪声进行补偿，使用激光光束来监测机械噪声。激光光束与成像光束具有相同的光路(参见附图8A)。但是，该光束横向稍微偏移约50μm。当成像光束从样品表面(例如，细胞)反射时，激光光束照射到玻璃(基板)表面。因此，检测器能够在同一图像中同时观察到来自样品表面的干涉条纹和来自玻璃基板的干涉条纹(参见附图8B)。附图8C是样品侧视图。通过低相干成像光源的相干门，只有来自有限深度的相干门反射的成像光束形成了干涉条纹，此时玻璃基板反射的激光光束产生与光程差无关的干涉条纹。
附图9A-9C显示了10μm聚苯乙烯微球的相图。附图9A是一次干涉图像，其中附图9(a-1)和附图9(a-2)是矩形所指区域的放大。附图9B是相图，其中伪色彩显示了用弧度表示的相位。附图9C是微球的表面形态。
附图9A是一次干涉图像。将相干门调节到微球表面。通过微球表面成像光束的反射，得到干涉条纹(参见附图9(a-2))，以及通过玻璃基板激光光束的反射的干涉条纹(参见附图9(a-1))。经过Hilbert变换，得到如附图9B所示的全视场相图。微球图像可被剪切和处理给出二维相位展开，从而重新得到微球表面形态。
附图10A显示了共模噪声消除的结果，其中显示了在玻璃基板960上的微球表面950用激光观测的相位波动，以及共模噪声消减970之后通过系统观测的微球表面真实相位波动。附图10B是微球真实相位波动的放大。放大图为附图1A中相同部分的线970的详细尺度。
上文详细叙述了共模噪声消除的结果。在这个实施例中，在12秒内，33毫秒间隔(30Hz)，对干涉图像进行记录，从而得到相图的时序数据。在微球表面以及玻璃表面上的纤维原始数据波动超过3弧度。但是，微球表面和玻璃表面的波动趋势是相似的，因为这一波动的来源是样品臂和参考臂路径长度的整体波动。通过从微球波动中消除玻璃波动，得到在微球上的非常稳定的时序相位。剩余不稳定性为52毫弧度(标准偏差)，其相当于1.8纳米的高分辨率。需要注意的是，一旦消除了一个微球中的玻璃表面运动，需要考虑成像光束和激光光束之间的波长比。波长比为1.05，此时玻璃相位波动乘以系数1.05表明其已从微球相位波动被消除。
因此，本发明优选的实施方式应用了具有空间非相干光源的FF-RPM，从而得到纳米级z-分辨率的样品表面形态。相比于具有空间相干光源的系统，具有空间非相干光源的系统的优势在于图像不存在斑点噪声。
尽管本发明已经通过结合具体的方法和装置进行描述，但是本领域技术人员应当理解，本发明描述了与实施例等效的装置和方法的应用，而不是将权利要求书中的权利要求作为对本发明范围的限制。

Claims (60)

1.一种用于相测量的系统，包括；
光源：
一种待测量材料，该材料被放置用于接受来自光源的光束；
一种光学系统，该系统用于区分来自光源光束的衍射级；
一种成像检测器，该成像检测器用来检测来自光学系统光束和来自材料光束的衍射级从而给出材料的相图。
2.根据权利要求1所述的系统，其中来自光源的光束通过材料传播。
3.根据权利要求1所述的系统，其中来自光源的光束被材料表面反射。
4.根据权利要求1所述的系统，进一步包括一种平移台，该平移台用于相对于材料放置相干门。
5.根据权利要求1所述的系统，其中所述低相干光源包括一种激光。
6.根据权利要求1所述的系统，其中所述光源包括一种宽带光源。
7.根据权利要求1所述的系统，进一步包括参考光路，该参考光路以一定角度入射到成像检测器表面，所述角度与通过材料入射到其表面的光束有关。
8.根据权利要求1所述的系统，其中所述光学系统包括一种空间滤波器，该空间滤波器传递从光栅接收的单级光束。
9.根据权利要求1所述的系统，其中所述光学系统包括一种光栅。
10.根据权利要求7所述的系统，其中参考光路对反射光束的衍射级进行区分。
11.根据权利要求1所述的系统，进一步包括种空间滤波器。
12.根据权利要求1所述的系统，进一步包括一种与成像检测器耦合的数据处理器。
13.根据权利要求12所述的系统，进一步包括一种显示装置，所述显示装置用于显示材料的定量相图。
14.根据权利要求12所述的系统，进一步包括一种用于存储图像数据的存储器。
15.根据权利要求1所述的系统，进一步包括一种制动器，所述制动器提供了光源和待成像材料之间的相对运动。
16.根据权利要求1所述的系统，进一步包括一种平移台。
17.根据权利要求16所述的系统，其中平移台将材料设定为与入射光轴有关的倾斜角度。
18.根据权利要求1所述的系统，其中光束被材料反射。
19.根据权利要求7所述的系统，其中参考光路包括一种反射器。
20.根据权利要求1所述的系统，其中所述材料被放置在反射表面上。
21.根据权利要求1所述的系统，其中光束分离器将光束区分到参考路径和成像路径上，其中成像路径上包括用于成像的材料。
22.根据权利要求1所述的系统，进一步包括相对于材料放置的相干门。
23.根据权利要求22所述的系统，其中相干门被放置用于提供材料透射图像。
24.根据权利要求22所述的系统，其中相干门被放置用于提供材料反射图像。
25.一种用于相显微镜的方法，包括：
将光束从低相干光源传递到待检测材料上，所述材料沿着光学耦合在光源上的第一光路放置；
将光束传递到光学耦合在光源上的参考物上；
区分来自参考物的光束衍射级；以及
用成像检测器检测所述光束，检测的光束包括沿着第一轴线定向的通过材料的光束，以及沿着第二轴线定向的划分了衍射级的光束，该光束对应于第一轴线层一定角度从而形成干涉图案。
26.根据权利要求25所述的方法，进一步包括使来自光源的光束进行透射通过材料。
27.根据权利要求25所述的方法，进一步包括使来自光源的光束通过材料表面进行反射。
28.根据权利要求25所述的方法，进一步包括使用平移台相对于材料放置相关门。
29.根据权利要求25所述的方法，其中所述低相干光源包括一种激光。
30.根据权利要求25所述的方法，其中所述光源包括一种宽带光源。
31.根据权利要求25所述的方法，其中参考光路以一定角度入射到成像检测器表面，所述角度与通过材料入射到其表面的光束有关。
32.根据权利要求25所述的方法，进一步包括使用空间滤波器来传递从光栅接收光的单一衍射级。
33.根据权利要求25所述的方法，进一步包括通过数据处理器来处理图像数据，其中数据处理器接收来自图像检测器的图像数据。
34.根据权利要求25所述的方法，进一步包括在显示装置上显示图像数据。
35.根据权利要求25所述的方法，进一步包括将图像数据存储到存储器中。
36.根据权利要求25所述的方法，进一步包括对图像数据进行Hilbert转换从而给出相图。
37.根据权利要求25所述的方法，进一步包括将材料以一定角度相对于入射光轴进行设定。
38.根据权利要求25所述的方法，进一步包括使生物样品成像。
39.根据权利要求25所述的方法，进一步包括使运动的细胞结构成像。
40.反射相显微镜的系统，包括：
一种低相干光源；
一种待检测的样品，该样品沿着光学耦合在光源上的第一光路放置；
一种光学耦合到光源上的参考反射器；
一种光学系统，用于提供一种衍射级的光束；
一种成像检测器，对通过样品和参考光路的光束进行检测。
41.根据权利要求40所述的系统，其中来自光源的光束通过样品传播。
42.根据权利要求40所述的系统，其中来自光源的光被样品表面反射。
43.根据权利要求40所述的系统，进一步包括平移台从而放置于样品相关的相干门。
44.根据权利要求40所述的系统，其中所述低相干光源包括一种激光。
45.根据权利要求40所述的系统，其中所述光源包括一种宽带光源。
46.根据权利要求40所述的系统，其中参考光路以一定角度入射到成像检测器表面，所述角度与通过材料入射到其表面的光束有关。
47.根据权利要求40所述的系统，其中所述光学系统包括一种光栅和一种空间滤波器。
48.根据权利要求47所述的系统，其中所述空间滤波器透射从光栅接收的单一衍射级光束。
49.根据权利要求40所述的系统，其中所述系统用于消除轴干涉。
50.根据权利要求40所述的系统，其中光学系统应用第一衍射级的光束来干扰样品反射的光。
51.根据权利要求40所述的系统，其中样品放置在反射镜上使之能够相对于入射光成一定角度进行倾斜。
52.根据权利要求40所述的系统，其中使来自光源的光被透射通过样品，从样品支撑表面反射并且通过样品从而成像。
53.根据权利要求40所述的系统，进一步包括放置在样品外的相关门，从而得到无条纹图像。
54.根据权利要求40所述的系统，其中光学系统选自傅里叶图像中的第一衍射级分量，并且使所述分量在傅里叶平面中进行移动。
55.根据权利要求54所述的系统，其中所述系统得到一种傅里叶逆变换图像。
56.根据权利要求40所述的系统，进一步包括一种数据处理器，其中相位展开所述图像。
57.根据权利要求40所述的系统，其中所述的图像包括全视场定量相图。
58.根据权利要求40所述的系统，其中进一步包括安装在平移台上的第一镜面，以及与制动器耦合的第二镜面，从而消除图像中的噪声。
59.根据权利要求58所述的系统，其中将共模相位噪声从图像中消除。
60.根据权利要求40所述的系统，其中所述系统确定了样品的功率谱密度。
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