CN105639591B - 一种利用酶制剂提升氨基酸得率的酱油酿造方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用酶制剂提高氨基酸得率的酱油酿造方法，包括将米曲霉和/或酱油曲霉与熟黄豆以及淀粉性辅料混合后发酵制成酱油大曲；将所得的酱油大曲与盐水混合制成酱醪，然后晒露发酵得酱油；其中，在所述的酱醪中添加制曲原料总重量的3％～10％酶制剂，该酶制剂由黑曲霉与脱盐酱渣发酵而得，其酸性蛋白酶活力在2000U/g以上。本发明的方法通过在发酵时添加酶制剂，弥补米曲霉和/或酱油曲霉中缺少的酶系，提高酱醪中酸性蛋白酶活力，提高天然油中氨基酸含量，促进美拉德反应的发生，提升酱油风味。

Description

一种利用酶制剂提升氨基酸得率的酱油酿造方法

技术领域

本发明涉及酱油酿造方法，具体涉及一种利用酶制剂提升氨基酸得率的酱油酿造方法。

背景技术

在广式酱油行业内的现行酿造工艺里，生产出的生酱油(天然油)通常分为头抽酱油和二抽酱油。头抽酱油简称头油，为酱油大曲和盐水的稀态混合物，即酱醪，经晒露发酵半年后所直接抽出的生酱油。由于酱油大曲中含有大量酶系，其能够将酱醪中的大豆蛋白质分解成小分子氨基酸，将淀粉分解成糖类，从而赋予头油鲜味和甜味。酱醪抽出头油后剩下的酱渣为头油渣，为制备二抽酱油的原料之一。二抽酱油简称二油，为在头油渣中补加盐水或者三油，然后继续晒露发酵1至2个月后抽出的生酱油。

在酱油酿造的曲霉菌主要为酱油曲霉和米曲霉。由于米曲霉的酶活高于酱油曲霉，所以在实际生产中，多数企业都是单一采用米曲霉，如沪酿3.042米曲霉，进行酱油酿造。米曲霉所产的酶系主要为中性蛋白酶，而淀粉酶、酸性蛋白酶和纤维素酶等的活性较低，影响了蛋白质和淀粉的分解和风味物质的产生，原料利用率低。黑曲霉的酸性蛋白酶活力高，可补充米曲霉所产酶系的不足，但是若采用黑曲霉和米曲霉混合制曲，二者间存在竞争，会相互制约，反而影响大曲的酶活力，无法获得理想的发酵效果。行业中常以添加酶制剂的方式来弥补酱油曲霉和/或米曲霉酱油酿造中酶系的不足。如CN201210002012.9中公开的蛋白酶制剂就应用于二抽酱油的酿造。不过，该蛋白酶制剂的制备时间长，而且所得酶制剂的酸性蛋白酶活力仅为750～1000U/g干基，酶系活力并不高，将其应用于酱油酿造对氨基酸含量和酱油风味的提升并不明显。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用酶制剂提升氨基酸得率的酱油酿造方法，该方法通过在发酵时添加酶制剂，弥补米曲霉和/或酱油曲霉中缺少的酶系，提高酱醪中酸性蛋白酶活力，提高天然油中氨基酸含量，促进美拉德反应的发生，提升酱油风味。

为实现上述第一个目的，本发明采用的技术方案为：一种利用酶制剂提升氨基酸得率的酱油酿造方法，其特征在于包括：将米曲霉和/或酱油曲霉与熟黄豆以及淀粉性辅料混合后发酵制成酱油大曲；将所得的酱油大曲与盐水混合制成酱醪，然后晒露发酵得酱油；其中，在所述的酱醪中添加3％～10％酶制剂，该酶制剂由黑曲霉与脱盐酱渣发酵而得，其酸性蛋白酶活力在2000U/g以上。

优选地，所述的酶制剂的酸性蛋白酶活力在3000U/g以上。

当酶制剂的酸性蛋白酶活力在3000U/g以上时，酱油发酵时所需要添加的酶制剂的量较少，酱油生产成本较低。

作为本发明的一个实施方式：在晒露发酵过程中，分别在酱醪的初始配置阶段和发酵的第15天添加酶制剂。

作为本发明的一个实施方式：所述的酱醪的初始配置阶段和发酵第15天时添加的酶制剂的质量比为0.43～2.33:1，优选为1.5:1。

优选地，所述酶制剂的添加量为制曲原料总重量的10％。

本发明所述的淀粉性辅料优选为面粉。

本发明所述的酶制剂采用以下方法制备而成：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为50～60％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲总重的0.4～0.6‰的黑曲霉，以及重量为种曲总重的40～50％的水，得到发酵原料；

步骤3：将所得的发酵原料发酵20～40h，得到酶制剂。

本发明单独采用黑曲霉作为酶制剂中的菌种。由于酶制剂在酱油制备过程中将被添加到酸性的环境中，故选用分泌酸性蛋白酶为主的黑曲霉能够优化酶制剂的使用效果。本发明采用的脱盐酱渣为在使用米曲霉和/或酱油曲霉进行的酱油酿造工艺中，酱醪抽出三油后的余下的酱渣经脱盐干燥处理所得。由于脱盐酱渣含有未被米曲霉和酱油曲霉的酶系分解的蛋白质，用其作为培养基对黑曲霉进行驯化，可促使黑曲霉产生大量能分解黄豆中蛋白质的酶系，尤其是酸性蛋白酶。

由于用于制备发酵原料的脱盐酱渣中含有8～10g/100g的盐分，而盐分会抑制黑曲霉的活性，因此在制备发酵原料时，需要加入一定量的水，以稀释发酵原料中的盐。在现有的制备酶制剂的工艺中，通常向发酵原料中加入重量为种曲重量的50～60％的水。一般认为，在酶制剂培养基中加入的水越多，培养基中的盐浓度越低，也就越有利于黑曲霉的生长代谢。然而，发明人经过多次对比实验后发现，当加水量高于50％时，所得到的酶制剂的酸性蛋白酶活力反而有所下降。这可能是因为当加水量过大，高水分与低盐的环境易使杂菌生长，并抑制黑曲霉的代谢产酶；此外，过多的水分导致发酵原料的结块，也不利于黑曲霉的代谢产酶。

本发明的方法与现有技术相比，所加入的麸皮的量更大。麸皮的作用是使脱盐酱渣的质地变得松散，以使黑曲霉能够更均匀地分布在酶制剂中，且作用面积增加。然而，当麸皮的添加比例过大时，培养基中蛋白质原料减少，菌种产生的酸性蛋白酶的量也随之减少。发明人通过比对试验，发现当麸皮的添加量为脱盐酱渣和麸皮的总重量的50～60％时，所得到的酶制剂的酸性蛋白酶活力较高。进一步地，优选为50～55％。

在大生产通风制曲过程中，为保证黑曲霉成为优势菌，抑制杂菌生长，本发明所述的步骤3采用分段发酵法进行发酵。分段发酵法指在发酵的不同时间段，采用不同的发酵温度进行发酵，具体如下：

第一阶段发酵：发酵的0～6h时间段，控制发酵原料的料温在28～30℃之间；

第二阶段发酵：发酵的6h～18h，控制发酵原料的料温在30～40℃之间；

第三阶段发酵：发酵的18h～30h，控制发酵原料的料温在30～32℃之间。

优选地，所述的第二阶段发酵的料温控制在35～40℃之间，更优选地在37～39℃之间。

在分段发酵中，第一阶段发酵温度较低，控制在28～30℃范围内，抑制杂菌生长，保证黑曲霉成为优势菌种。第二阶段将发酵温度控制在黑曲霉生长繁殖的适宜温度范围内，使黑曲霉生长旺盛。第三阶段降低大曲温度至黑曲霉产酶适宜温度30～32℃，使黑曲霉大量分泌酸性蛋白酶。

本发明的方法还可以作以下改进：在与麸皮混合前，先使用粉碎机将所述的脱盐酱渣粉碎成5～30目的颗粒。

当酱渣的颗粒度较小时，黑曲霉的作用面积增加，因此发酵的效果更好，所得的酶制剂的酸性蛋白酶活力也就更高。然而，当酱渣的颗粒度过小时，粉碎与过筛的难度将增加，导致生产成本的增加。因此，酱渣的颗粒度为5～30目较为适宜。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明在酱醪中添加由黑曲霉与脱盐酱渣发酵制得的高酶活的酶制剂，酶制剂中含有淀粉酶、酸性蛋白酶和纤维素酶等，增加酱醪中酶系种类，有利于黄豆中蛋白质和淀粉的分解，使酱醪含有高浓度的还原糖和氨基酸等产物，为发酵后期的乳酸发酵、酒精发酵、美拉德反应和酯化反应等提供了有利的前提条件，从而提高了酱油中氨基酸得率，提升了风味。

(2)本发明中分两次添加酶制剂，能够提高天然油中头油和二油中的氨基酸态氮含量。

(3)本发明提供的酶制剂具有很强的酶活力，酸性蛋白酶活力能达到高于2000U/g干基，是现有技术的两倍以上，为酱醪提供高活力的酸性蛋白酶，有利于黄豆蛋白质的分解。

(4)本发明的酶制剂制备方法简单，且发酵时间比现有技术的短，能够提高生产效率，节省生产成本。

(5)本发明采用脱盐酱渣驯化黑曲霉，提高头油渣中的蛋白质的利用率及淀粉质原料的利用率。

具体实施方式

下面通过比较例和实施例，对本发明进行进一步的说明。

本文的实施例和比较例所使用的黑曲霉为：A.S 3.350；

在下文的实验例、比较例和实施例中，使用国标GB/T 5009.39-2003中所述的方法，测定所得的头油和二油的氨基酸态氮含量；使用SB/T10317-1999中所述的方法，测定酶制剂的酸性蛋白酶活力。所述的风味鉴评为独立的鉴评人员针对所得的头油进行试吃鉴评，并针对色泽、香气、滋味三方面进行打分评价。色泽方面满分为20分，香气方面满分为40分，滋味方面满分为40分。

下文的实验例为酶制剂的制备参数的优化实验。实验例1为辅料比例、加水量和颗粒度的初步优化，实验例2为在实验例1的基础上进行的进一步优化，实验例3为制备温度和时间的初步优化，实验例4为在实验例3基础上进行的进一步优化。

实验例1

1.辅料比例对酶制剂酸性蛋白酶活力的影响

脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲，其中分别调整麸皮的比例为30％、40％、50％、60％，黑曲霉接种量为0.5‰，加水量为种曲总重的50％，培养温度为：0～6h控温28℃，6h～18h控温35℃，18h时经第二次松曲，降低大曲温度至30℃，分别测定酶制剂酸性蛋白酶活力。

表1麸皮比例对酶制剂酶活力的影响

百分比(％)	30	40	50	60
					酸性蛋白酶活力(U/g)	242	536	927	761

由表1可见，在麸皮添加比例小于50％时，随着添加比例的增加，酶制剂酸性蛋白酶的活力上升，主要是麸皮松散，增加了黑曲霉的作用面积，当辅料添加比例大于50％时，培养基中蛋白质原料的减少，菌种产生的酸性蛋白酶的量也随之减少，因此麸皮的添加比例为50-60％。

2.加水量对酶制剂酸性蛋白酶活力影响

脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲，脱盐酱渣和麸皮的比例是1﹕1，黑曲霉接种量为0.5‰，加水量分别为种曲总重的30％、35％、40％、45％、50％，培养温度为：0～6h控温28℃，6h～18h控温35℃，18h时经第二次松曲，降低大曲温度至30℃，测定酶制剂中酸性蛋白酶活力。

表2加水量对酶活力的影响

由表2可见，加水量在30％-40％之间，随着加水量的增加，酶制剂中酸性蛋白酶的活力上升；因头油渣经过脱盐后盐分为8-10g/100mL，在培养基中加入水越多，培养基中的盐分越低，利于菌种的生长代谢。

加水量大于40％，随着加水量的增加，酶制剂中酸性蛋白酶的活力下降，因加水量越大，盐分降低，在高水分与低盐环境下使杂菌的生长，黑曲霉的代谢被抑制，且曲料结块，不利于菌种代谢。在加水量为50％时，酶制剂中的酸性蛋白酶的活力达到最大，因此酶制剂制备中加水量应为40～45％。

3.颗粒度对酶制剂酸性蛋白酶活力的影响

将脱盐酱渣用粉碎机粉碎，通过用不同目数筛过筛得到不同颗粒度的酱渣来确定制备酶制剂的适宜颗粒度。脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲，脱盐酱渣和麸皮的比例是1﹕1，黑曲霉接种量为0.5‰，加水量分别为种曲总重的50％，培养温度为：0～6h控温28℃，6h～18h控温35℃，18h时经第二次松曲，降低大曲温度至30℃，测定酶制剂的酸性蛋白酶活力。

表3颗粒度对酶制剂酶活力的影响

标准筛目数	0	5	10	20	30
						酸性蛋白酶活力(U/g)	1009	1978	2984	3570	3981

由表3可以看出：脱盐酱渣颗粒度越小，对应酶制剂酸性蛋白酶活越高，主要是因为颗粒度越小，利于黑曲霉的作用面积与酶系的分布。若再进一步减小酱渣颗粒度，则增加粉碎与过筛的难度，故生产中酱渣适宜颗粒度为5～30目。

实验例2

1.辅料比例对酶制剂酸性蛋白酶活力的影响

脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲，其中分别调整麸皮的比例来确定适宜的培养基配比。调整麸皮的比例为50％、52％、55％、58％、60％，黑曲霉接种量为0.5‰，加水量为种曲总重的40％，培养温度为：0～6h控温28℃，6h～18h控温40℃，18h时经第二次松曲，降低大曲温度至30℃，分别测定酶制剂酸性蛋白酶活力。

表4麸皮比例对酶制剂酶活力的影响

由表4可知，在麸皮添加比例为52％时，酶制剂酸性酶活达最高值，因此麸皮的添加比例优选为50～55％。

2.加水量对酶制剂酸性蛋白酶活力的影响

通过调整加水量来确定制备酶制剂的最佳加水量：脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲，脱盐酱渣和麸皮的比例是1﹕1，黑曲霉接种量为0.5‰，加水量分别为种曲总量的40％、42％、45％、48％、50％，培养温度为：0～6h控温28℃，6h～18h控温40℃，18h时经第二次松曲，降低大曲温度至30℃，测定酶制剂中酸性蛋白酶活力。

表5加水量对酶活力的影响

由表5可知，加水量为40％、42％、45％、48％时，酸性蛋白酶活性均在3700U/g以上，因此，加水量优选为40～48％。在加水量为40％时，酶制剂酸性酶活达最高值，因此酶制剂制备中最佳加水量应为40％。

实验例3

1.酶制剂6h～18h时的制备温度的确定

在大生产通风制曲过程中，为保证黑曲霉成为优势菌种，减少细菌的产生，在前期0～6h控温28～30℃，6h～18h是大曲生长最为旺盛的阶段，18h时要经过第二次松曲，降低大曲温度至黑曲霉产酶适宜温度30～32℃。故需通过调整6～18h之间的温度来确定制备酶制剂的适宜温度：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲，脱盐酱渣和麸皮的比例是1﹕1，黑曲霉接种量为0.5‰，加水量为种曲总重的50％，培养温度为：0～6h控温28℃，6h～18h之间培养温度分别为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，8h时经第二次松曲，降低大曲温度至30℃，测定所得的酶制剂中的酸性蛋白酶活力。

表6培养温度对酶活力的影响

由表6可以看出：培养温度在35℃和40℃时，酶制剂的酸性蛋白酶活较高，随着温度的继续上升，酶活下降，可能的原因是：40℃～45℃是细菌生长繁殖的最佳温度，细菌的繁殖抑制了菌种的代谢。故酶制剂的培养温度为35-40℃。

2.酶制剂培养时间的确定

通过调整制曲时间来确定制备酶制剂的最佳培养时间：脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲，脱盐酱渣和麸皮的比例是1﹕1，黑曲霉接种量为0.5‰，加水量为种曲总重的40％，培养温度为：0～6h控温28℃，6h～18h控温35℃，18h时经第二次松曲，降低大曲温度至30℃，总培养时间分别为20h、25h、30h、35h、40h，分别测定酶制剂中酸性蛋白酶活力。

表7培养时间对酶活力的影响

由表7可以看出：培养时间为30h，酶制曲酸性蛋白酶活最高，随着温度的继续上升，酶活下降，故最佳培养时间为30h。

实验例4

酶制剂6h～18h时的制备温度的确定

通过调整制曲温度来确定制备酶制剂在发酵时间为6h～18h的最佳培养温度：脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲，脱盐酱渣和麸皮的比例是48﹕52，黑曲霉接种量为0.5‰，加水量为种曲总重的40％，培养温度为：0～6h控温28℃，6h～18h的培养温度分别为35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃，18h时经第二次松曲，降低大曲温度至30℃，共培养30h，测定酶制剂中酸性蛋白酶活力。

表8培养温度对酶活力的影响

由表8可知：培养温度控制在38℃时，酶制剂酸性蛋白酶活力达最高值，但生产通风较难控制，故最佳培养温度可控制在37～39℃。

下文结合实施例，对上文的实验例进行总结，并对酶制剂的制作方法和使用酶制剂酿造酱油的方法进行进一步的说明。

实施例1～27为酶制剂的制备方法的实施例。

实施例1

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣用粉碎机粉碎并过滤，滤网目数为20目；将过滤后的脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲总重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为50％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的50％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温30℃，6h～18h控温35℃，18h时经第二次松曲，降低大曲温度至32℃。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为3570U/g干基。

实施例2

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣用粉碎机粉碎并过滤，滤网目数为30目；将过滤后的脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲总重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为50％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的50％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温30℃，6h～18h控温35℃，18h时经第二次松曲，降低大曲温度至32℃。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为3981U/g干基。

实施例3

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲总重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为50％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的40％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温28℃，6h～18h控温40℃，18h时经第二次松曲，降低大曲温度至30℃。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为3854U/g干基。

实施例4

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为52％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的40％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温28℃，6h～18h控温40℃，18h时经第二次松曲，降低大曲温度至30℃。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为3967U/g干基。

实施例5

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为55％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的40％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温28℃，6h～18h控温40℃，18h时经第二次松曲，降低大曲温度至30℃。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为3741U/g干基。

实施例6

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为58％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的40％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温28℃，6h～18h控温40℃，18h时经第二次松曲，降低大曲温度至30℃。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为3554U/g干基。

实施例7

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为60％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的40％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温28℃，6h～18h控温40℃，18h时经第二次松曲，降低大曲温度至30℃。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为3328U/g干基。

实施例8

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为50％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的40％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温29℃，6h～18h控温40℃，18h时经第二次松曲，降低大曲温度至31℃。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为4132U/g干基。

实施例9

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为50％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的42％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温29℃，6h～18h控温40℃，18h时经第二次松曲，降低大曲温度至31℃。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为3985U/g干基。

实施例10

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为50％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的45％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温29℃，6h～18h控温40℃，18h时经第二次松曲，降低大曲温度至31℃。。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为3854U/g干基。

实施例11

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为50％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的48％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温29℃，6h～18h控温40℃，18h时经第二次松曲，降低大曲温度至31℃。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为3765U/g干基。

实施例12

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为50％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的50％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温29℃，6h～18h控温40℃，18h时经第二次松曲，降低大曲温度至31℃。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为3451U/g干基。

实施例13

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为50％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的50％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温28℃，6h～18h控温30℃，18h时经第二次松曲，调整大曲温度至30℃。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为2725U/g干基。

实施例14

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为50％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的50％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温28℃，6h～18h控温35℃，18h时经第二次松曲，调整大曲温度至30℃。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为3875U/g干基。

实施例15

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为51％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的49％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发发酵温度为：0～6h控温28℃，6h～18h控温40℃，18h时经第二次松曲，调整大曲温度至30℃。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为3987U/g干基。

实施例16

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为50％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的50％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：发酵温度为：0～6h控温28℃，6h～18h控温45℃，18h时经第二次松曲，调整大曲温度至30℃。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为2842U/g干基。

实施例17

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为50％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的40％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温30℃，6h～18h控温35℃，18h时经第二次松曲，调整大曲温度至32℃，总培养时间为20h。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为2987U/g干基。

实施例18

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为50％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的40％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温30℃，6h～18h控温35℃，18h时经第二次松曲，调整大曲温度至32℃，总培养时间为25h。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为3542U/g干基。

实施例19

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为50％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的40％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温30℃，6h～18h控温35℃，18h时经第二次松曲，调整大曲温度至32℃，总培养时间为30h。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为4105U/g干基。

实施例20

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为50％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的40％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温30℃，6h～18h控温35℃，18h时经第二次松曲，调整大曲温度至32℃，总培养时间为35h。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为3874U/g干基。

实施例21

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为50％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的40％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温30℃，6h～18h控温35℃，18h时经第二次松曲，调整大曲温度至32℃，总培养时间为40h。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为3542U/g干基。

实施例22

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为52％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的40％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温28℃，6h～18h控温35℃，18h时经第二次松曲，调整大曲温度至30℃，总培养时间为30h。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为4502U/g干基。

实施例23

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为52％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的40％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温28℃，6h～18h控温36℃，18h时经第二次松曲，调整大曲温度至30℃，总培养时间为30h。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为4687U/g干基。

实施例24

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为52％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的40％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温28℃，6h～18h控温37℃，18h时经第二次松曲，调整大曲温度至30℃，总培养时间为30h。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为4951U/g干基。

实施例25

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为52％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的40％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温28℃，6h～18h控温38℃，18h时经第二次松曲，调整大曲温度至30℃，总培养时间为30h。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为3542U/g干基。

实施例26

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为52％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的40％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温28℃，6h～18h控温39℃，18h时经第二次松曲，调整大曲温度至30℃，总培养时间为30h。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为4962U/g干基。

实施例27

一种制备酶制剂的方法，该方法包括：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为52％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲重量的0.5‰的黑曲霉，以及重量为种曲重量的40％的水，得到发酵原料；

步骤3：对发酵原料进行发酵；发酵温度为：0～6h控温28℃，6h～18h控温40℃，18h时经第二次松曲，调整大曲温度至30℃，总培养时间为30h。

所制成的酶制剂的酸性蛋白酶活力为4835U/g干基。

实施例28～37以及比较例1～4为使用本发明的酶制剂酿造酱油的方法的实施例和比较例。

实施例28

米曲霉与熟黄豆以及面粉混合，于28～38℃及湿度85％的条件下，培养45h，制成酱油大曲；大豆与面粉之间的质量比为1﹕0.3～0.5，米曲霉的接种量为大豆质量的0.03％～0.08％(w/w)。取等量的酱油大曲与盐水制成酱醪，在酱醪中添加酱醪总质量的3％的实施例1的酶制剂，混合均匀，然后在40℃下晒露发酵180天，出头油，淋油后20天出二油。测定所得的酱油的氨基酸态氮含量，将实验结果记录于表9；对酱油进行风味鉴评，并将鉴评结果记录于表10。

实施例29

与实施例28不同的是：在酱醪中添加酱醪总质量的5％的实施例3的酶制剂，混合均匀。测定所得的天然油的氨基酸态氮含量，将实验结果记录于表9；对天然油进行风味鉴评，并将鉴评结果记录于表10。

实施例30

与实施例28不同的是：在酱醪中添加酱醪总质量的8％的实施例8的酶制剂，混合均匀。测定所得的天然油的氨基酸态氮含量，将实验结果记录于表9；对天然油进行风味鉴评，并将鉴评结果记录于表10。

实施例31

与实施例28不同的是：在酱醪中添加酱醪总质量的10％的实施例13的酶制剂，混合均匀。测定所得的天然油的氨基酸态氮含量，将实验结果记录于表9；对天然油进行风味鉴评，并将鉴评结果记录于表10。

实施例32

与实施例28不同的是：在酱醪中添加酱醪总质量的15％的实施例18的酶制剂，混合均匀。测定所得的天然油的氨基酸态氮含量，将实验结果记录于表9；对天然油进行风味鉴评，并将鉴评结果记录于表10。

实施例33

米曲霉与熟黄豆以及面粉混合，于28～38℃及湿度85％的条件下，培养45h，制成酱油大曲；大豆与面粉之间的质量比为1﹕0.3～0.5，米曲霉的接种量为大豆质量的0.03％～0.08％(w/w)。取等量的酱油大曲与盐水制成酱醪，在酱醪中添加酱醪总质量的7％的实施例22的酶制剂，混合均匀，然后晒露发酵180天，出头油；其中，在第15天发酵时再添加3％的酶制剂；得到头油后，向头油渣中淋加盐水，20天出二油。测定所得的头油和二油的氨基酸态氮含量，并将实验结果记录于表11。

实施例34

与实施例33不同的是：在酱醪中添加酱醪总质量的6％的实施例25的酶制剂，混合均匀，然后晒露发酵180天，出头油；其中，在第15天发酵时再添加4％的酶制剂。测定所得的头油和二油的氨基酸态氮含量，并将实验结果记录于表11。

实施例35

与实施例33不同的是：在酱醪中添加酱醪总质量的5％的实施例2的酶制剂，混合均匀，然后晒露发酵180天，出头油；其中，在第15天发酵时再添加5％的酶制剂。测定所得的头油和二油的氨基酸态氮含量，并将实验结果记录于表11。

实施例36

与实施例33不同的是：在酱醪中添加酱醪总质量的4％的实施例6的酶制剂，混合均匀，然后晒露发酵180天，出头油；其中，在第15天发酵时再添加6％的酶制剂。测定所得的头油和二油的氨基酸态氮含量，并将实验结果记录于表11。

实施例37

与实施例33不同的是：在酱醪中添加酱醪总质量的3％的实施例11的酶制剂，混合均匀，然后晒露发酵180天，出头油；其中，在第15天发酵时再添加7％的酶制剂。测定所得的头油和二油的氨基酸态氮含量，并将实验结果记录于表11。

比较例1

米曲霉与熟黄豆以及面粉混合，于28～38℃及湿度85％的条件下，培养45h，制成酱油大曲；大豆与面粉之间的质量比为1﹕0.3～0.5，米曲霉的接种量为大豆质量的0.03％～0.08％(w/w)。取等量的酱油大曲与盐水制成酱醪，然后晒露发酵180天，出头油，淋油后20天出二油。测定所得的酱油的氨基酸态氮含量，将实验结果记录于表9；对酱油进行风味鉴评，并将鉴评结果记录于表10。

比较例2

米曲霉与熟黄豆以及面粉混合，于28～38℃及湿度85％的条件下，培养45h，制成酱油大曲；大豆与面粉之间的质量比为1﹕0.3～0.5，米曲霉的接种量为大豆质量的0.03％～0.08％(w/w)。取等量的酱油大曲与盐水制成酱醪，在酱醪中添加酱醪总质量的10％的实施例22的酶制剂，混合均匀，然后晒露发酵180天，出头油；得到头油后，向头油渣中淋加盐水，20天出二油。测定所得的头油和二油的氨基酸态氮含量，并将实验结果记录于表11。

比较例3

米曲霉与熟黄豆以及面粉混合，于28～38℃及湿度85％的条件下，培养45h，制成酱油大曲；大豆与面粉之间的质量比为1﹕0.3～0.5，米曲霉的接种量为大豆质量的0.03％～0.08％(w/w)。取等量的酱油大曲与盐水制成酱醪，混合均匀，然后晒露发酵180天，出头油；其中，在第15天发酵时再添加酱醪总质量的10％的实施例22的酶制剂；得到头油后，向头油渣中淋加盐水，20天出二油。测定所得的头油和二油的氨基酸态氮含量，并将实验结果记录于表11。

比较例4

米曲霉与熟黄豆以及面粉混合，于28～38℃及湿度85％的条件下，培养45h，制成酱油大曲；大豆与面粉之间的质量比为1﹕0.3～0.5，米曲霉的接种量为大豆质量的0.03％～0.08％(w/w)。取等量的酱油大曲与盐水制成酱醪，混合均匀，而后晒露发酵180天，出头油，淋油后20天出二油。测定所得的酱油的氨基酸态氮含量，将实验结果记录于表9；对酱油进行风味鉴评，并将鉴评结果记录于表10。

表9

由表9可知：天然油的氨基酸态氮随着酶制剂添加量的增加而增加；相对于对照组，在酶制剂添加量为3％～10％时，天然油的氨基酸态氮升高明显，继续增大酶制剂添加量至15％，天然油的氨基酸态氮上升幅度减小，且成本增加。故酶制剂最佳添加量为10％

表10

	比较例4	实施例28	实施例29	实施例30	实施例31	实施例32
							色泽	10	13	14	16	16	17
香气	28	30	32	35	36	37
							滋味	28	28	33	37	37	37
总分	68	71	79	88	89	91

由表10可知：天然油风味随着酶制剂添加量的增加而提升；相对于对照组，在酶制剂添加量为3％～8％时，天然油的风味提升明显，若继续提升酶制剂添加量，天然油风味提升幅度较小。

综上所述，酶制剂的最佳添加量为10％。

表11

由表11可知，酶制剂分两次加较一次性加天然油氨基酸高，在初始阶段添加6％酶制剂，在发酵第15天时添加4％的酶制剂，头油和二油的氨基酸态氮达最高值。

Claims (8)

1.一种利用酶制剂提高氨基酸得率的酱油酿造方法，其特征在于包括：将米曲霉和/或酱油曲霉与熟黄豆以及淀粉性辅料混合后发酵制成酱油大曲；将所得的酱油大曲与盐水混合制成酱醪，然后晒露发酵得酱油；其中，在所述的酱醪中添加制曲原料总重量的3％～10％酶制剂，该酶制剂由黑曲霉与脱盐酱渣发酵而得，其酸性蛋白酶活力在2000U/g以上；在所述的晒露发酵过程中，分别在所述的酱醪的初始配置阶段和发酵的第15天添加所述的酶制剂；所述的酶制剂的制备方法为：

步骤1：将脱盐酱渣和麸皮均匀混合，制成种曲；以所述种曲的重量百分比为100％计，所述的麸皮的重量百分比为50～60％；

步骤2：在混合过程中加入接种量为种曲总重的0.4～0.6‰的黑曲霉，以及重量为种曲总重的40～50％的水，得到发酵原料；

步骤3：将所得的发酵原料发酵20～40h，得到酶制剂。

2.根据权利要求1所述的利用酶制剂提高氨基酸得率的酱油酿造方法，其特征在于：所述的酶制剂的酸性蛋白酶活力在3000U/g以上。

3.根据权利要求1所述的利用酶制剂提高氨基酸得率的酱油酿造方法，其特征在于：在所述的酱醪的初始配置阶段和发酵第15天时添加的酶制剂的质量比为0.43～2.33:1。

4.根据权利要求3所述的利用酶制剂提高氨基酸得率的酱油酿造方法，其特征在于：在所述的酱醪的初始配置阶段和发酵第15天时添加的酶制剂的质量比为1.5:1。

5.根据权利要求1至4中任意一项所述的利用酶制剂提高氨基酸得率的酱油酿造方法，其特征在于：所述的酶制剂的添加量为制曲原料总重量的10％。

6.根据权利要求5所述的利用酶制剂提高氨基酸得率的酱油酿造方法，其特征在于：所述的步骤1中添加的麸皮的重量百分比为50～55％。

7.根据权利要求6所述的利用酶制剂提高氨基酸得率的酱油酿造方法，其特征在于：所述的步骤3采用分段发酵法进行发酵，包括：

第一阶段发酵：发酵的0～6h时间段，控制所述的发酵原料的料温在28～30℃之间；

第二阶段发酵：发酵的6h～18h，控制所述的发酵原料的料温在30～40℃之间；

第三阶段发酵：发酵的18h～30h，控制所述的发酵原料的料温在30～32℃之间。

8.根据权利要求6所述的利用酶制剂提高氨基酸得率的酱油酿造方法，其特征在于：所述步骤1中，在与麸皮混合前，先使用粉碎机将所述的脱盐酱渣粉碎成5～30目的颗粒。