CN105622710A - 15-羟基雷公藤内酯酮的提取纯化方法 - Google Patents

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阙慧卿
钱丽萍
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Abstract

本发明公开了一种15-羟基雷公藤内酯酮的提取纯化方法，其以雷公藤的根心、根皮、茎和叶为原料，经粉碎、浸泡、渗漉、萃取、硅胶柱层析分离纯化、重结晶等多个步骤，可提取得到纯度达99%以上的15-羟基雷公藤内酯酮，且其得率约为9×10-5，比现有文献报道的提取工艺提高近80倍，为15-羟基雷公藤内酯酮的化学结构、药理作用等研究提供物质基础。

Description

15-羟基雷公藤内酯酮的提取纯化方法
技术领域
本发明属于中医药研究技术领域，具体涉及一种15-羟基雷公藤内酯酮的提取纯化方法。
背景技术
雷公藤（TripterygiumwillfordiiHook.f）系卫矛科雷公藤属植物，以全根或去皮根木质部入药。雷公藤具有活血化瘀、清热解毒、消肿散结、祛风除湿、杀虫止血的作用，临床用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肾炎、强制性脊柱炎等，但其有大毒，且其临床有效剂量与中毒剂量相近，这使雷公藤的全药应用至今未能得到广泛推广。
为了充分发挥雷公藤的药用功效，国内外学者已从雷公藤属植物中分离出几十种化学成分，主要有二萜、三萜、倍半萜、生物碱、苷类、糖类和醇类等。其中，雷公藤内酯酮（Triptonide），又叫雷公藤羰内酯、雷公藤酮，是从雷公藤中分离得到的二萜类化合物，其具有抗炎、免疫抑制、抗新生血管等多种功效，是雷公藤药物活性成分的一个重要的研究方向。
发明内容
本发明的目的在于提供一种15-羟基雷公藤内酯酮的提取纯化方法，所得15-羟基雷公藤内酯酮的纯度高，可为雷公藤内酯酮的化学结构、药理作用等研究提供物质基础。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种15-羟基雷公藤内酯酮的提取纯化方法，其包括以下步骤：
1）将雷公藤粉碎，过20目筛，加其重量5倍体积的乙醇浸泡20-24h后，在雷公藤中加入其重量30-35倍体积的乙醇作为渗滤液，每500mL收集一次，将其浓缩至干，加1mL三氯甲烷溶解后采用TLC对其进行定性检测，直至检测为阴性时停止渗漉，然后将渗漉液合并、浓缩，得乙醇浓缩液；
2）按体积比1:1.5将所得乙醇浓缩液加乙酸乙酯萃取5-6次，每次萃取过程中需振摇20次，每次萃取后将收集的乙酸乙酯溶液浓缩，采用TLC对其进行定性检测，直至检测为阴性时停止萃取然后将萃取得到的乙酸乙酯溶液合并、浓缩，经微波干燥制得干粉；
3）将所得干粉加等体积乙酸乙酯溶解后，按干粉与硅胶的重量比为1:80进行湿法上柱，采用硅胶柱层析进行分离，将乙酸乙酯与石油醚按体积比2.2:2.8混合作为洗脱剂进行洗脱，每500mL洗脱液收集一份，经浓缩后采用TLC对浓缩液进行定性检测，合并含有相同成分的浓缩液，回收溶剂后微波干燥，得粗提干粉；
4）将所得粗提干粉加等体积三氯甲烷溶解后，按粗提干粉与硅胶的重量比为1:120进行湿法上柱，采用硅胶柱层析进行分离，将三氯甲烷与甲醇混合作为洗脱剂，按混合比例99:1、98:2、97:3、96:4进行梯度洗脱，每200mL洗脱液收集一份，经浓缩后采用TLC对浓缩液进行定性检测，合并含有相同成分的浓缩液，回收溶剂至干，得精提物；
5）将所得精提物加二氯甲烷溶解后，在二氯甲烷和乙醚的混合液中重结晶3-5次，得无色针状结晶，即为所述15-羟基雷公藤内酯酮。
步骤1）所述雷公藤包含雷公藤植株的根心、根皮、茎和叶中的任意一种或几种。
步骤2）所述微波干燥的功率为500W，频率为2450MHz，温度为40℃，干燥时间为30-40min。
步骤3）所述微波干燥的功率为500W，频率为2450MHz，温度为40℃，干燥时间为10min。
所得15-羟基雷公藤内酯酮的结构式为：
，
mp217~219℃，HR-MS[M+H]+：375.1459，分子式C20H23O7（计算值：375.1442）[α]：+123（c0.05，CHCl2）。与Kedde试剂显紫红色反应，：218nm。IR（cm-1）：3550，3010，2980，1780，1760，1720，1430，1295，1250，908。MSm/z：374，358，343，330，315，301，259，255，206，149，105，55。1H-NMR（CDCl3）δ：1.13（s，20-CH3），1.32，1.59（m，1-Hα,β），1.39（s，16-CH3），1.43（s，17-CH3），2.15（m，2-Hβ），2.19，1.98（m，6-Hα,β），2.33（br，2-Hα），2.78（br，5-H），3.38（d，J=5Hz，7-H），3.85（d，J=3Hz，12-H），4.03（d，J=3Hz，11-H），4.89（m，19-H2），5.39（s，1H，15-OH）。13C-NMR（CDCl3）δ：30.9（1-C），17.3（2-C），125.39（3-C），159.3（4-C），40.3（5-C），23.5（6-C），60.29（7-C），60.99（8-C），65.39（9-C），36.0（10-C），56.38（11-C），59.99（12-C），66.8（13-C），198.0（14-C），63.39（15-C），18.3（16-C），19.80（17-C），173.30（18-C），70.3（19-C），13.69（20-C）。
本发明的显著优点在于：按本发明提取纯化方法制得的15-羟基雷公藤内酯酮纯度可达99%，且其得率约为9×10-5，比现有文献报道的提取工艺提高近80倍，可为阐明雷公藤中的化学成分、药理作用等研究提供科学的依据和物质基础，也可为临床应用雷公藤提供科学的依据。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
一种15-羟基雷公藤内酯酮的提取纯化方法，其包括以下步骤：
1）将10kg包含茎和叶的雷公藤植株粉碎，过20目筛，加其重量5倍体积的乙醇浸泡20h后，在雷公藤中加入其重量30倍体积的乙醇作为渗滤液，每500mL收集一次，将其浓缩至干，加1mL三氯甲烷溶解后采用TLC对其进行定性检测，直至检测为阴性时停止渗漉，然后将渗漉液合并、浓缩，得乙醇浓缩液；
2）按体积比1:1.5将所得乙醇浓缩液加乙酸乙酯进行萃取，每次萃取过程中需振摇20次，每次萃取后将收集的乙酸乙酯溶液浓缩，采用TLC对其进行定性检测，萃取5次后检测萃取液为阴性，停止萃取，然后将萃取得到的乙酸乙酯溶液合并、浓缩，经微波干燥制得干粉，微波干燥的功率为500W，频率为2450MHz，温度为40℃，干燥时间为30min；
3）将所得干粉加等体积乙酸乙酯溶解后，按干粉与硅胶的重量比为1:80进行湿法上柱，采用硅胶柱层析进行分离，将乙酸乙酯与石油醚按体积比2.2:2.8混合作为洗脱剂进行洗脱，每500mL洗脱液收集一份，经浓缩后采用TLC对浓缩液进行定性检测，合并含有相同成分的浓缩液，回收溶剂后微波干燥得粗提干粉，微波干燥的功率为500W，频率为2450MHz，温度为40℃，干燥时间为10min；
4）将所得粗提干粉加等体积三氯甲烷溶解后，按粗提干粉与硅胶的重量比为1:120进行湿法上柱，采用硅胶柱层析进行分离，将三氯甲烷与甲醇混合作为洗脱剂，按混合比例99:1、98:2、97:3、96:4进行梯度洗脱，每200mL洗脱液收集一份，经浓缩后采用TLC对浓缩液进行定性检测，合并含有相同成分的浓缩液，回收溶剂至干，得精提物；
5）将从三氯甲烷与甲醇混合比例为97:3的部分得到的精提物加二氯甲烷溶解后，在二氯甲烷和乙醚的混合液中重结晶3次，得15-羟基雷公藤内酯酮的无色针状结晶0.93g，其纯度为99.1%。
本实施例柱层析分离过程中所用硅胶经预先活化为I级，即于105℃烘箱中干燥5h。
实施例2
一种15-羟基雷公藤内酯酮的提取纯化方法，其包括以下步骤：
1）将10kg包含根心、根皮、茎和叶的雷公藤粉碎，过20目筛，加其重量5倍体积的乙醇浸泡22h后，在雷公藤中加入其重量32倍体积的乙醇作为渗滤液，每500mL收集一次，将其浓缩至干，加1mL三氯甲烷溶解后采用TLC对其进行定性检测，直至检测为阴性时停止渗漉，然后将渗漉液合并、浓缩，得乙醇浓缩液；
2）按体积比1:1.5将所得乙醇浓缩液加乙酸乙酯进行萃取，每次萃取过程中需振摇20次，每次萃取后将收集的乙酸乙酯溶液浓缩，采用TLC对其进行定性检测，萃取5次后检测萃取液为阴性，停止萃取，然后将萃取得到的乙酸乙酯溶液合并、浓缩，经微波干燥制得干粉，微波干燥的功率为500W，频率为2450MHz，温度为40℃，干燥时间为35min；
3）将所得干粉加等体积乙酸乙酯溶解后，按干粉与硅胶的重量比为1:80进行湿法上柱，采用硅胶柱层析进行分离，将乙酸乙酯与石油醚按体积比2:3混合作为洗脱剂进行洗脱，每500mL洗脱液收集一份，经浓缩后采用TLC对浓缩液进行定性检测，合并含有相同成分的浓缩液，回收溶剂后微波干燥得粗提干粉，微波干燥的功率为500W，频率为2450MHz，温度为40℃，干燥时间为10min；
4）将所得粗提干粉加等体积三氯甲烷溶解后，按粗提干粉与硅胶的重量比为1:120进行湿法上柱，采用硅胶柱层析进行分离，将三氯甲烷与甲醇混合作为洗脱剂，按混合比例100:0、99:1、98:2、97:3、96:4进行梯度洗脱，每200mL洗脱液收集一份，经浓缩后采用TLC对浓缩液进行定性检测，合并含有相同成分的浓缩液，回收溶剂至干，得精提物；
5）将从三氯甲烷与甲醇混合比例为98:2的部分得到的精提物加二氯甲烷溶解后，在二氯甲烷和乙醚的混合液中重结晶3次，得15-羟基雷公藤内酯酮的无色针状结晶0.98g，其纯度为99.5%。
本实施例柱层析分离过程中所用硅胶经预先活化为I级，即于105℃烘箱中干燥3h。
实施例3
一种15-羟基雷公藤内酯酮的提取纯化方法，其包括以下步骤：
1）将10kg雷公藤叶粉碎，过20目筛，加其重量5倍体积的乙醇浸泡24h后，在雷公藤中加入其重量35倍体积的乙醇作为渗滤液，每500mL收集一次，将其浓缩至干，加1mL三氯甲烷溶解后采用TLC对其进行定性检测，直至检测为阴性时停止渗漉，然后将渗漉液合并、浓缩，得乙醇浓缩液；
2）按体积比1:1.5将所得乙醇浓缩液加乙酸乙酯进行萃取，每次萃取过程中需振摇20次，每次萃取后将收集的乙酸乙酯溶液浓缩，采用TLC对其进行定性检测，萃取6次后检测萃取液为阴性，停止萃取，然后将萃取得到的乙酸乙酯溶液合并、浓缩，经微波干燥制得干粉，微波干燥的功率为500W，频率为2450MHz，温度为40℃，干燥时间为40min；
3）将所得干粉加等体积乙酸乙酯溶解后，按干粉与硅胶的重量比为1:80进行湿法上柱，采用硅胶柱层析进行分离，将乙酸乙酯与石油醚按体积比2:3混合作为洗脱剂进行洗脱，每500mL洗脱液收集一份，经浓缩后采用TLC对浓缩液进行定性检测，合并含有相同成分的浓缩液，回收溶剂后微波干燥得粗提干粉，微波干燥的功率为500W，频率为2450MHz，温度为40℃，干燥时间为10min；
4）将所得粗提干粉加等体积三氯甲烷溶解后，按粗提干粉与硅胶的重量比为1:120进行湿法上柱，采用硅胶柱层析进行分离，将三氯甲烷与甲醇混合作为洗脱剂，按混合比例100:0、99:1、98:2、97:3、96:4进行梯度洗脱，每200mL洗脱液收集一份，经浓缩后采用TLC对浓缩液进行定性检测，合并含有相同成分的浓缩液，回收溶剂至干，得精提物；
5）将从三氯甲烷与甲醇混合比例为99:1的部分得到的精提物加二氯甲烷溶解后，在二氯甲烷和乙醚的混合液中重结晶3次，得15-羟基雷公藤内酯酮的无色针状结晶0.95g，其纯度为99.3%。
本实施例柱层析分离过程中所用硅胶为常规市售硅胶。
按本发明加工方法制得的15-羟基雷公藤内酯酮，其纯度可达99%以上，且得率约为9×10-5比现有文献报道的提取工艺提高近80倍，可为15-羟基雷公藤内酯酮的化学结构、药理作用等研究提供物质基础。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (9)

1.一种15-羟基雷公藤内酯酮的提取纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）将雷公藤粉碎，过20目筛，加其重量5倍体积的乙醇浸泡20-24h后进行渗漉，然后将渗漉液合并、浓缩，得乙醇浓缩液；
2）按体积比1:1.5将所得乙醇浓缩液加乙酸乙酯萃取5-6次，然后将萃取得到的乙酸乙酯溶液合并、浓缩，经微波干燥制得干粉；
3）将所得干粉加等体积乙酸乙酯溶解后，采用硅胶柱层析进行分离，将乙酸乙酯与石油醚按体积比2.2:2.8混合作为洗脱剂进行洗脱，每500mL洗脱液收集一份，经浓缩后采用TLC对浓缩液进行定性检测，合并含有相同成分的浓缩液，回收溶剂后微波干燥，得粗提干粉；
4）将所得粗提干粉加等体积三氯甲烷溶解后，采用硅胶柱层析进行分离，将三氯甲烷与甲醇混合作为洗脱剂进行梯度洗脱，每200mL洗脱液收集一份，经浓缩后采用TLC对浓缩液进行定性检测，合并含有相同成分的浓缩液，回收溶剂至干，得精提物；
5）将所得精提物加二氯甲烷溶解后，在二氯甲烷和乙醚的混合液中重结晶3-5次，得无色针状结晶，即为所述15-羟基雷公藤内酯酮。
2.根据权利要求1所述15-羟基雷公藤内酯酮的提取纯化方法，其特征在于：步骤1）所述雷公藤包含雷公藤植株的根心、根皮、茎和叶中的任意一种或几种。
3.根据权利要求1所述15-羟基雷公藤内酯酮的提取纯化方法，其特征在于：步骤1）所述渗漉是加入雷公藤重量30-35倍体积的乙醇作为渗滤液，每500mL收集一次，将其浓缩至干，加1mL三氯甲烷溶解后采用TLC对其进行定性检测，直至检测为阴性时停止渗漉。
4.根据权利要求1所述15-羟基雷公藤内酯酮的提取纯化方法，其特征在于：步骤2）每次萃取的过程中需振摇20次，每次萃取后将收集的乙酸乙酯溶液浓缩，采用TLC对其进行定性检测，直至检测为阴性时停止萃取。
5.根据权利要求1所述15-羟基雷公藤内酯酮的提取纯化方法，其特征在于：步骤2）所述微波干燥的功率为500W，频率为2450MHz，温度为40℃，干燥时间为30-40min。
6.根据权利要求1所述15-羟基雷公藤内酯酮的提取纯化方法，其特征在于：步骤3）中干粉与硅胶柱层析所用硅胶的重量比为1:80；采用湿法上柱。
7.根据权利要求1所述15-羟基雷公藤内酯酮的提取纯化方法，其特征在于：步骤3）所述微波干燥的功率为500W，频率为2450MHz，温度为40℃，干燥时间为10min。
8.根据权利要求1所述15-羟基雷公藤内酯酮的提取纯化方法，其特征在于：步骤4）中粗提干粉与硅胶柱层析所用硅胶的重量比为1:120；采用湿法上柱。
9.根据权利要求1所述15-羟基雷公藤内酯酮的提取纯化方法，其特征在于：步骤4）梯度洗脱中三氯甲烷与甲醇的混合比例依次为99:1、98:2、97:3、96:4。
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