CN105616434A - 满天星异荭草苷在制备治疗免疫性肝纤维化药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中药活性成分满天星异荭草苷在制备治疗免疫性肝纤维化药物中的应用研究。首次对满天星异荭草苷治疗免疫性肝纤维化进行了研究，通过动物实验表明，满天星异荭草苷可作用于免疫性肝损伤的多个环节或多个靶点，主要通过NF-κB信号转导通路达到作用。可有效的抑制脂质过氧化反应、减轻肝组织病理损伤、抑制胶原沉积、抑制基质金属蛋白酶、阻断NF-κB信号转导通路，使肝损伤明显减轻，对防治肝损伤具有独特优势。满天星异荭草苷对猪血清引起的肝损伤具有明显抑制作用，是治疗免疫性肝纤维化的一种非常有潜在价值的新药。
Description
技术领域
本发明涉及中药满天星提取物的用途，具体地说是以满天星异荭草苷为原料在制备治疗免疫性肝纤维化药物中的应用。
背景技术
肝纤维化(fibrosisofliver)是多种原因引起的慢性肝损害所致的病理改变，主要表现为肝内细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）成分过度异常地沉积，并影响肝脏的功能，是慢性肝病发展到肝硬化必经阶段。肝纤维化具有可逆性，然而当其发展成肝硬化则很难逆转，因此逆转和治疗肝纤维化显得非常重要。
猪血清作为一种异种血清通过免疫反应可造成免疫性损伤。研究发现，大鼠腹腔注射猪血清使得其中的抗原物质经腹腔内吸收产生相应抗体，形成抗原抗体复合物沉积于肝细胞中，引起慢性免疫性炎症反应，ECM在肝内过度沉积导致肝纤维化发生，猪血清建立的大鼠免疫性肝纤维化模型肝纤维化持久且致纤维化的过程中对肝细胞损伤较小，并且该动物模型形成较稳定，其分子机制与人类肝纤维化有一定相似性，因而，是研究肝纤维化较理想的动物模型。目前，临床对免疫性肝纤维化的治疗仍没有明确的方案和有效治疗药物。近些年来，国内外大量研究表明天然药物和中药在治疗免疫性肝纤维化方面显示出了可靠疗效和较少不良反应的特点。因此采用现代化技术从天然药物和中药中开发治疗免疫性肝纤维化的新药具有重要意义。
满天星（GypsophilaelegansBieb），又名丝石竹、霞草等，是石竹科石头花属植物[1]，是广西壮民族地区抗肝脏疾病习用草药，其主要活性成分之一满天星异荭草苷（isoorientin-2″-O-α-L-arabinopyranosyl，IOA）对猪血清诱导的肝损伤的作用尚无报道。
发明内容
本发明的目的是从天然药物和中药中开发治疗免疫性肝纤维化的新药，挖掘草药满天星的新用途。
本发明是基于发明人的实验研究而完成的。研究分两大部分：
一、满天星异荭草苷的制备
提取方法：干燥的满天星10kg粉碎后，用80L的75%乙醇回流提取3次，合并3次乙醇提取液，回收乙醇，得到乙醇提取物315.7g。乙醇提取物加入630ml蒸馏水摇匀成悬浮液，接着分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，萃取方法简述如下：首先，用630ml石油醚萃取，弃石油醚液；接着，用630ml乙酸乙酯萃取，弃乙酸乙酯液；最后，用630ml正丁醇萃取，回收正丁醇，得正丁醇萃取物177.6g。
纯化方法：正丁醇萃取物上D101型大孔树脂，先用5倍量水洗脱后，再用10倍量90%的甲醇洗脱，回收甲醇，得粗提物。将粗提物溶于甲醇，与等量硅胶拌样，上样于硅胶柱，以甲醇-乙酸乙脂-水不同比例即3：3：2；4：3：2；5：3：2；6：3：2；7：3：2；8：3：2；9：3：2；10：3：2，进行梯度洗脱。薄层色谱跟踪，合并相似馏分。合并用比例为4：3：2；5：3：2；6：3：2；7：3：2的甲醇-乙酸乙脂-水洗脱的馏分，再经3次硅胶柱层析后再次合并相似馏分，回收洗脱剂，得淡棕色结晶28.3mg。
二、满天星异荭草苷治疗免疫性肝纤维化药效学实验
将SD雄性大鼠以猪血清诱导大鼠免疫性肝纤维化模型，观察满天星异荭草苷治疗免疫性肝纤维化的作用。结果表明满天星异荭草苷能明显降低肝组织白细胞介素-1（IL-1），人肿瘤坏死因子-α（TNF-α），转化生长因子-β1（TGF-β1），升高白细胞介素-10（IL-10），含量，降低肝组织及血清丙二醛（MDA）的水平，显著提高肝组织及血清超氧化物歧化酶（SOD）的活性，提示满天星异荭草苷具有抗脂质过氧化反应的作用；此外，满天星异荭草苷可明显降低血清透明质酸（HA），层粘连蛋白（LN），羟脯氨酸（Hyp），Ⅲ型前胶原氨基端肽（PⅢNP），Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ），IV型胶原（Col-IV）的含量，说明满天星异荭草苷具有抑制胶原沉积的作用。
通过病理学检查显示，正常组大鼠肝小叶结构清晰且完整，肝细胞索以中央静脉为中心，向四周呈放射状排列，肝细胞未见变性、无炎细胞浸润,未见病理性改变,只有极少量细小的蓝色纤维。模型组大鼠汇管区炎性细胞、坏死细胞增多，肝小叶结构紊乱,细胞索排列紊乱，纤维间隔增厚，成纤维细胞大量增生，大量纤维生成，并可见假小叶形成。满天星异荭草苷组大鼠可观察到肝组织病理损伤比模型模型组明显减轻。
免疫组化法测定大鼠肝细胞核转录因子-κBp50（NF-κBp50）、TNF-α、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）和细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的表达，结果表明，与模型组比较，满天星异荭草苷可明显抑制NF-κBp50蛋白、ICAM-1、TIMP-1、TNF-α蛋白的表达，升高MMP-9蛋白的表达。
RT-PCR法检测肝组织Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）、Ⅲ型胶原（Col-Ⅲ）、细胞核转录因子-κBp65（NF-κBp65）、核因子κB抑制蛋白α亚基（IκB-α）和转化生长因子-β1（TGF-β1）mRNA的表达，结果表明，与模型组比较，满天星异荭草苷可明显抑制Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、NF-κBp65、IκB-α、TGF-β1mRNA的表达。
Westernblot法检测肝组织NF-κBp65、磷酸化NF-κBp65、NF-κBp50、IκB-α、磷酸化IκB-α、核因子κB抑制物激酶β（IKK-β）、Col-Ⅰ蛋白的表达，结果表明，与模型组比较，满天星异荭草苷可明显抑制肝组织NF-κBp65、磷酸化NF-κBp65、NF-κBp50、IκB-α、磷酸化IκB-α、IKK-β、Col-Ⅰ蛋白的表达。
结论：满天星异荭草苷可应用于治疗免疫性肝脏炎症；满天星异荭草苷可应用于治疗免疫性慢性肝损伤；满天星异荭草苷可应用于治疗免疫性肝纤维化。
总之，本发明首次对满天星异荭草苷治疗免疫性肝损伤进行了研究，实验表明，满天星异荭草苷可作用于免疫性肝损伤的多个环节或多个靶点，主要通过NF-κB信号转导通路达到作用。可有效的抑制脂质过氧化反应、减轻肝组织病理损伤、抑制胶原沉积、调节基质金属蛋白酶的活性、阻断NF-κB信号转导通路，使肝损伤明显减轻，对防治肝损伤具有独特优势。满天星异荭草苷对猪血清引起的肝损伤具有明显抑制作用，是治疗免疫性肝纤维化的一种非常有潜在价值的新药。
具体实施方式
一、满天星异荭草苷的制备
提取方法：干燥的满天星10kg粉碎后，用80L的75%乙醇回流提取3次，合并3次乙醇提取液，回收乙醇，得到乙醇提取物315.7g。乙醇提取物加入630ml蒸馏水摇匀成悬浮液，接着分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，萃取方法简述如下：首先，用630ml石油醚萃取，弃石油醚液；接着，用630ml乙酸乙酯萃取，弃乙酸乙酯液；最后，用630ml正丁醇萃取，回收正丁醇，得正丁醇萃取物177.6g。
纯化方法：正丁醇萃取物上D101型大孔树脂，先用5倍量水洗脱后，再用10倍量90%的甲醇洗脱，回收甲醇，得粗提物。将粗提物溶于甲醇，与等量硅胶拌样，上样于硅胶柱，以甲醇-乙酸乙脂-水不同比例即3：3：2；4：3：2；5：3：2；6：3：2；7：3：2；8：3：2；9：3：2；10：3：2，进行梯度洗脱。薄层色谱跟踪，合并相似馏分。合并用比例为4：3：2；5：3：2；6：3：2；7：3：2的甲醇-乙酸乙脂-水洗脱的馏分，再经3次硅胶柱层析后再次合并相似馏分，回收洗脱剂，得淡棕色结晶28.3mg。
光谱检测数据：ESI-MS（m/z）：604[M+Na]+;1HNMR（500MHz，CD3OD）δ：7.33（1H，s，H-2'），7.30（1H，d，J=8.0Hz，H-6'），6.87（1H，d，J=8.0Hz，H-5'），6.47（1H，s，H-3），6.41（1H，s，H-8），4.99（1H，d，J=9.5Hz，H-1″），4.37（1H，J=5.5Hz，H-1'''）;13CNMR（125MHz，CD3OD）δ：166.7（C-2），104.2（C-3），184.4（C-4），159.2（C-5），109.3（C-6），165.9（C-7），95.2（C-8），163.1（C-9），105.4（C-10），123.3（C-1'），114.3（C-2'），147.1（C-3'），151.5（C-4'），117.6（C-5'），120.6（C-6'），73.4（C-1″），82.5（C-2″），74.3（C-3″），73.5（C-4″），82.9（C-5″），63.4（C-6″），107.4（C-1'''），72.2（C-2'''），80.8（C-3'''），69.1（C-4'''），67.2（C-5'''）。最后鉴定为：异荭草苷-2″-O-α-L-阿拉伯糖（isoorientin-2″-O-α-L-arabinopyranosyl），简称满天星异荭草苷，其分子式为C26O15H28，分子量为580.48。
二、满天星异荭草苷治疗免疫性肝损伤药效学实验
实验方案：
（1）实验动物模型的制备、分组及处理
90只雄性SD大鼠，（120±20g），SPF级，随机分为2组：造模组75只，正常组15只。造模组大鼠采用猪血清腹腔注射每只0.5ml，造成免疫性肝纤维化模型，正常对照组腹腔注射等量的生理盐水，每周2次，连续注射16周。分别于造模后12周和16周末，抽取肝纤维化大鼠及正常对照组大鼠，进行病理学检查以观察造模情况。病理检查证实造模成功后，将存活的肝纤维化大鼠71只随机分为5组：模型对照组、PDTC阳性对照组（PDTC组）、满天星异红草苷高剂量组（IOAH组）、满天星异红草苷中剂量组（IOAM组）、满天星异红草苷低剂量组（IOAL组）。具体分组如下：
正常对照组12只
模型对照组14只
PDTC阳性对照组（PDTC组）15只
满天星异红草苷低剂量组（IOAL组）14只
满天星异红草苷中剂量组（IOAM组）14只
满天星异红草苷高剂量组（IOAH组）14只
造模16周后，开始给药，PDTC组灌胃给予PDTC150mg/kg，IOA高、中、低剂量组分别灌胃给予IOA100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg。模型组及正常对照组则灌胃给予等量生理盐水，每天1次，每周称重1次，根据体重调整给药量，连续给药8周。另外，除正常组外，每只大鼠仍继续腹腔注射猪血清，每只0.5ml，每周2次。
第8周给药结束时，大鼠眼球取血，处死，快速取出肝脏，一部分-80℃保存，另一部分用10%福尔马林固定。
（2）检测指标
①肝组织病理学观察：常规病理检察；
②血清ALT，AST，ALP和GGT的活力；
③IL-1，IL-10，TNF-α，TGF-β1的检测；
④SOD和MDA的检测；
⑤HA，LN，Hyp，PⅢNP，Col-Ⅰ，Col-IV的检测；
⑥免疫组化检测肝组织NF-κBp50、TNF-α、MMP-9、TIMP-1和ICAM-1的表达；
⑦RT-PCR检测肝组织Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、NF-κBp65、IκB-α和TGF-β1mRNA的表达；
⑧Westernblot检测NF-κBp65、磷酸化NF-κBp65、NF-κBp50、IκB-α、磷酸化IκB-α、IKK-β和Col-Ⅰ蛋白的表达。
（3）实验结果：
1、肝组织病理检查情况
通过病理学检查显示，正常组大鼠肝小叶结构清晰且完整，肝细胞索以中央静脉为中心，向四周呈放射状排列，肝细胞未见变性、无炎细胞浸润,未见病理性改变,只有极少量细小的蓝色纤维。模型组大鼠汇管区炎性细胞、坏死细胞增多，肝小叶结构紊乱,细胞索排列紊乱，纤维间隔增厚，成纤维细胞大量增生，大量纤维生成，并可见假小叶形成。满天星异荭草苷组大鼠可观察到肝组织病理损伤比模型模型组明显减轻。
2、大鼠肝脏指数
模型组大鼠肝脏指数高于正常组大鼠，经药物干预后，IOAL、IOAM、IOAH均能显著降低升高的肝指数，（p＜0.01）。PDTC能降低升高的肝指数，但无显著性意义。结果见表1。
3、血清ALT，AST，ALP，GGT活性
与正常组相比较，模型组血清大鼠血清ALT、AST均高于正常组大鼠，经药物干预后，PDTC与IOAL、IOAM、IOAH血清中ALT、AST的含量均降低但无显著性意义；模型组大鼠ALB/GLB（A/G）值低于正常组大鼠，给予药物后，PDTC与IOAM、IOAH血清A/G值升高但无显著性意义。结果见表2。
4、血清LN、HA、Hyp含量
模型组大鼠血清LN、HA、Hyp均高于正常组大鼠，经药物干预后，PDTC与IOAH均能显著降低血清中LN、HA、Hyp的含量，其中IOAL、IOAM还能显著降低血清中HA、Hyp的含量（p＜0.05或p＜0.01）。结果见表3。
5、血清Col-Ⅰ、Col-Ⅳ、PⅢNP含量
与正常组相比，模型组大鼠血清Col-Ⅰ、Col-Ⅳ、PⅢNP含量均显著升高，经药物干预后，PDTC与IOAL、IOAM、IOAH均能显著降低血清中Col-Ⅰ、Col-Ⅳ、PⅢNP含量，（p＜0.05或p＜0.01）。结果见表4。
6、血清SOD和MDA含量
模型组大鼠SOD低于正常组大鼠，MDA则高于正常组大鼠，给予药物后，PDTC与IOAL、IOAM、IOAH均能升高SOD的含量，并降低MDA含量（p＜0.05或p＜0.01）。结果见表5。
7、肝组织中SOD和MDA活性
模型组大鼠SOD低于正常组大鼠，MDA则高于正常组大鼠，给予药物后，PDTC与IOAM、IOAH均能升高SOD的含量，并降低MDA含量，同时IOAL还能显著性降低MDA含量（p＜0.05或p＜0.01）。结果见表6。
8、肝组织TNF-α、TGF-β1、IL-1、IL-10含量
模型组大鼠肝组织TNF-α、IL-1、TGF-β1含量均高于正常组大鼠，IL-10含量则低于正常组大鼠，经药物干预后，PDTC与IOAL、IOAM、IOAH均能显著降低肝组织中TNF-α、IL-1、TGF-β1的含量，并提高肝组织中IL-10的含量（p＜0.05或p＜0.01）。结果见表7。
9、免疫组化法测定NF-κBp50、TNF-α、MMP-9、TIMP-1和ICAM-1蛋白
正常对照组大鼠肝细胞胞浆内较少表达NF-κBp50、TNF-α、MMP-9、TIMP-1和ICAM-1，模型组大鼠肝组织细胞胞浆中的NF-κBp50、TNF-α、TIMP-1和ICAM-1蛋白的表达均显著高于正常组，而模型组大鼠肝组织细胞胞浆中MMP-9蛋白的表达低于正常组，但无显著性差异。经药物治疗后，PDT与IOAH、IOAM、IOAL均显著下调肝组织细胞胞浆中NF-κBp50、TNF-α、TIMP-1和ICAM-1蛋白的表达（p＜0.01）。然而给药后，PDTC与IOAH、IOAM、IOAL则能上调肝组织细胞胞浆中MMP-9蛋白的表达（p＜0.01）。结果见表8。
10、RT-PCR检测肝组织Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、NF-κBp65、IκB-α和TGF-β1mRNA的表达
模型组大鼠肝组织Col-I、Col-Ⅲ、NF-κBp65和TGF-β1mRNA的表达高于正常组大鼠，IκB-αmRNA的表达低于正常组大鼠，经药物干预后，PDTC与IOAH、IOAM、IOAL能明显降低Col-I、Col-Ⅲ、NF-κBp65和TGF-β1mRNA的表达，升高IκB-αmRNA的表达（p<0.05）。结果见表9。
11、Westernblot检测肝脏的NF-κBp65、磷酸化NF-κBp65、NF-κBp50、IκB-α、磷酸化IκB-α、IKK-β、Col-Ⅰ蛋白的表达
Westernblot分析结果显示，模型组大鼠肝组织中NF-κBp65、P-NF-κBp65、NF-κBp50、P-IκB-α、IKK-β、Col-Ⅰ的相对表达量显著高于正常组（p＜0.01），经药物处理后PDTC与IOAH、IOAM、IOAL均能显著下调肝组织NF-κBp65、P-NF-κBp65、NF-κBp50、P-IκB-α、IKK-β、Col-Ⅰ的表达（p＜0.01）。此外，模型组大鼠肝组织中IκB-α的相对表达量显著高于正常组（p＜0.01），经药物处理后，IOAH、IOAM均能显著上调IκB-α的表达（p＜0.05，p＜0.01）。结果如表10、11。
Claims (4)
1.满天星异荭草苷在制备治疗免疫性肝纤维化药物中的应用，所述的满天星异荭草苷是按照以下方法制备而得的：
提取方法：干燥的满天星10kg粉碎后，用80L的75%乙醇回流提取3次，合并3次乙醇提取液，回收乙醇，得到乙醇提取物315.7g；乙醇提取物加入630ml蒸馏水摇匀成悬浮液，接着分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，萃取方法简述如下：首先，用630ml石油醚萃取，弃石油醚液；接着，用630ml乙酸乙酯萃取，弃乙酸乙酯液；最后，用630ml正丁醇萃取，回收正丁醇，得正丁醇萃取物177.6g；
纯化方法：正丁醇萃取物上D101型大孔树脂，先用5倍量水洗脱后，再用10倍量90%的甲醇洗脱，回收甲醇，得粗提物；将粗提物溶于甲醇，与等量硅胶拌样，上样于硅胶柱，以甲醇-乙酸乙脂-水不同比例即3：3：2；4：3：2；5：3：2；6：3：2；7：3：2；8：3：2；9：3：2；10：3：2，进行梯度洗脱；
薄层色谱跟踪，合并相似馏分；
合并用比例为4：3：2；5：3：2；6：3：2；7：3：2的甲醇-乙酸乙脂-水洗脱的馏分，再经3次硅胶柱层析后再次合并相似馏分，回收洗脱剂，得淡棕色结晶28.3mg。
2.所述的满天星异荭草苷应用于治疗免疫性肝脏炎症。
3.所述的满天星异荭草苷应用于治疗免疫性慢性肝损伤。
4.所述的满天星异荭草苷应用于治疗免疫性肝纤维化。
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