CN105726528A - 满天星异荭草苷在制备治疗化学性肝纤维化药物中的应用 - Google Patents
满天星异荭草苷在制备治疗化学性肝纤维化药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种中药活性成分满天星异荭草苷在制备治疗化学性肝纤维化药物中的应用研究。本发明首次对满天星异荭草苷治疗化学性肝纤维化进行了研究,实验表明,满天星异荭草苷可作用于化学性肝纤维化的多个环节或多个靶点,可有效的抑制脂质过氧化反应、减轻肝组织病理损伤、抑制胶原沉积、调控基质金属蛋白酶活性、阻断NF?κB信号转导通路,使肝损伤明显减轻,对防治肝损伤具有独特优势。满天星异荭草苷对四氯化碳引起的肝损伤具有明显抑制作用,是治疗化学性肝纤维化的一种非常有潜在价值的新药。
Description
技术领域
本发明涉及中药满天星提取物的用途,具体地说是以满天星异荭草苷为原料在制备治疗四氯化碳引起的化学性肝纤维化药物中的应用。
背景技术
肝纤维化(liver fibrosis)是机体对慢性肝损伤的一种修复反应,病因很多,包括病毒性、自身免疫性、药物或毒物、胆汁淤积以及代谢性疾病等,如不及时治疗,将导致肝硬化、肝功能衰竭甚至肝细胞癌(HCC)。肝纤维化的特征是细胞外基质(ECM)和胶原蛋白(以I型和III型为主)的过度沉积。现已知,过量的ECM沉积,改变了肝脏的正常结构,扰乱了器官的正常功能,导致肝脏的病理生理性损害。四氯化碳(CCl4)是选择性肝脏毒性药物,过氧化损伤是其产生肝毒性的重要机理,其作用机制主要是,CCl4进入肝脏后,引起肝小叶内中央静脉周围的细胞坏死,导致纤维增生,是国内外常用的肝纤维化模型。传统的观点认为肝纤维化是一种不可逆的疾病,然而,最近的研究表明,肝纤维化甚至是肝硬化也是具有可逆性的。因此,如何抑制肝纤维化,并找到一种安全有效的药物来逆转肝纤维化已经成为该领域的研究热点。
目前,临床对肝纤维化的治疗仍没有明确的方案和有效治疗药物。近些年来,国内外大量研究表明天然药物和中药在治疗肝纤维化方面显示出了可靠疗效和较少不良反应的特点。因此采用现代化技术从天然药物和中药中开发治疗肝纤维化的新药具有重要意义。
满天星(Gypsophila elegans Bieb),又名丝石竹、霞草等,是石竹科石头花属植物,是广西壮民族地区抗肝脏疾病习用草药,其主要活性成分之一满天星异荭草苷(isoorientin-2″-O-α-L-arabinopyranosyl,IOA)对CCl4诱导的肝损伤、炎症、肝纤维化的作用尚无报道。
发明内容
本发明的目的是从天然药物和中药中开发治疗肝纤维化的新药,挖掘草药满天星的新用途。
本发明是基于发明人的实验研究而完成的。研究分两大部分:
一、满天星异荭草苷的制备
提取方法:干燥的满天星10 kg粉碎后,用80L的75%乙醇回流提取3 次,合并3次乙醇提取液,回收乙醇,得到乙醇提取物315.7g。乙醇提取物加入630ml蒸馏水摇匀成悬浮液,接着分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取,萃取方法简述如下:首先,用630ml石油醚萃取,弃石油醚液;接着,用630ml乙酸乙酯萃取,弃乙酸乙酯液;最后,用630ml正丁醇萃取,回收正丁醇,得正丁醇萃取物177.6 g。
纯化方法:正丁醇萃取物上D101 型大孔树脂,先用5倍量水洗脱后,再用10倍量90% 的甲醇洗脱,回收甲醇,得粗提物。将粗提物溶于甲醇,与等量硅胶拌样,上样于硅胶柱,以甲醇-乙酸乙脂-水不同比例即3:3:2; 4:3:2; 5:3:2; 6:3:2;7:3:2;8:3:2;9:3:2;10:3:2,进行梯度洗脱。薄层色谱跟踪,合并相似馏分。合并用比例为4:3:2; 5:3:2;6:3:2;7:3:2的甲醇-乙酸乙脂-水洗脱的馏分,再经3次硅胶柱层析后再次合并相似馏分,回收洗脱剂,得淡棕色结晶28.3 mg。
二、满天星异荭草苷治疗CCl4诱导肝纤维化药效学实验
将SD雄性大鼠以CCl4诱导大鼠肝纤维化模型,观察满天星异荭草苷治疗化学性肝纤维化的作用。结果表明满天星异荭草苷能明显降低血清谷丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)的水平;肝组织白细胞介素-1(IL-1),人肿瘤坏死因子-α(TNF-α),转化生长因子-β1(TGF-β1),升高白细胞介素-10(IL-10)含量;降低肝组织及血清丙二醛(MDA)的水平,显著提高肝组织超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性,提示满天星异荭草苷具有抗脂质过氧化反应的作用;此外,满天星异荭草苷可明显降低血清透明质酸(HA),层粘连蛋白(LN)的含量,说明满天星异荭草苷具有抑制胶原沉积的作用。
H&E染色、VG染色及Masson染色病理检查结果显示,正常组大鼠肝小叶结构清晰且完整,以中央静脉为中心,向四周呈放射状排列,肝细胞未见变性或坏死。模型组大鼠肝细胞出现肿胀、气球样变,肝小叶被破坏,胞浆内出现大量大小不一的脂防空泡,胶原纤维增多,或肝局灶性坏死以及淋巴细胞浸润的现象。满天星异荭草苷组大鼠可观察到肝组织病理损伤比模型模型组明显减轻。
免疫组化法测定大鼠肝细胞核转录因子-κB p65(NF-κB p65)、TNF-α、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达,结果表明,与模型组比较,满天星异荭草苷可明显抑制NF-κB p65蛋白、MMP-9、TNF-α蛋白的表达。
RT-PCR法检测肝组织Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)和转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA的表达,结果表明,与模型组比较,满天星异荭草苷可明显抑制Col-Ⅰ、TGF-β1 mRNA的表达。
结论:满天星异荭草苷可应用于治疗四氯化碳引起的化学性慢性肝损伤;满天星异荭草苷可应用于治疗四氯化碳引起的肝脏炎症;满天星异荭草苷可应用于治疗四氯化碳引起的化学性肝纤维化。
总之,本发明首次对满天星异荭草苷治疗化学性肝纤维化进行了研究,实验表明,满天星异荭草苷可作用于化学性肝纤维化的多个环节或多个靶点,可有效的抑制脂质过氧化反应、减轻肝组织病理损伤、抑制胶原沉积、调控基质金属蛋白酶活性、阻断NF-κB信号转导通路,使肝损伤明显减轻,对防治肝损伤具有独特优势。满天星异荭草苷对CCl4引起的肝损伤具有明显抑制作用,是治疗化学性肝纤维化的一种非常有潜在价值的新药。
具体实施方式
一、满天星异荭草苷的制备
提取方法:干燥的满天星10 kg粉碎后,用80L的75%乙醇回流提取3 次,合并3次乙醇提取液,回收乙醇,得到乙醇提取物315.7g。乙醇提取物加入630ml蒸馏水摇匀成悬浮液,接着分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取,萃取方法简述如下:首先,用630ml石油醚萃取,弃石油醚液;接着,用630ml乙酸乙酯萃取,弃乙酸乙酯液;最后,用630ml正丁醇萃取,回收正丁醇,得正丁醇萃取物177.6 g。
纯化方法:正丁醇萃取物上D101 型大孔树脂,先用5倍量水洗脱后,再用10倍量90% 的甲醇洗脱,回收甲醇,得粗提物。将粗提物溶于甲醇,与等量硅胶拌样,上样于硅胶柱,以甲醇-乙酸乙脂-水不同比例即3:3:2; 4:3:2; 5:3:2; 6:3:2;7:3:2;8:3:2;9:3:2;10:3:2,进行梯度洗脱。薄层色谱跟踪,合并相似馏分。合并用比例为4:3:2; 5:3:2;6:3:2;7:3:2的甲醇-乙酸乙脂-水洗脱的馏分,再经3次硅胶柱层析后再次合并相似馏分,回收洗脱剂,得淡棕色结晶28.3 mg。
光谱检测数据:ESI-MS(m/z):604[M+Na]+; 1H NMR (500 MHz,CD3OD) δ: 7.33(1H,s,H-2'),7.30 (1H,d, J = 8.0 Hz,H-6'),6.87(1H,d,J = 8.0 Hz,H-5'),6.47 (1H,s,H-3),6.41(1H,s,H-8),4.99 (1H,d,J = 9.5 Hz,H-1″),4.37 (1H,J = 5.5 Hz,H-1'''); 13C NMR(125 MHz, CD3OD)δ: 166.7 (C-2),104.2 (C-3),184.4 (C-4),159.2(C-5),109.3 (C-6),165.9(C-7),95.2 (C-8),163.1(C-9),105.4 (C-10),123.3 (C -1'),114.3 (C-2'),147.1(C-3'),151.5 (C-4'),117.6 (C-5'),120.6 (C-6'),73.4 (C-1″),82.5 (C -2″),74.3 (C-3″),73.5 (C-4″),82.9 (C-5″),63.4 (C-6″),107.4 (C-1'''),72.2 (C-2'''),80.8 (C-3'''),69.1 (C-4'''),67.2 (C-5''')。最后鉴定为:异荭草苷-2″- O-α- L-阿拉伯糖(isoorientin-2″-O-α-L-arabinopyranosyl),简称满天星异荭草苷,其分子式为C26O15H28,分子量为580.48。
二、满天星异荭草苷治疗CCl4诱导肝纤维化药效学实验
实验方案:
(1)实验动物模型的制备、分组及处理
90只雄性SD大鼠,(200±20g),适应性饲养1w后,随机分为2组:I组75只,II组15只。I组大鼠采用50%四氯化碳(CCl4)油溶液灌胃造成肝纤维化模型[13]。方法是,将CCl4与花生油按1:1比例配成50% CCl4油溶液,I组按2ml/kg给予大鼠灌胃(i.g.)50% CCl4油溶液,每周2次,II组大鼠则灌胃等容量花生油。每周称重2次,调整CCl4给予量。造模第8w和第10w,取大鼠肝脏作病理切片以观察造模情况。经HE染色病理切片观察,确定第10w造模成功。造模结束时,I组大鼠共有7只死亡,3只用作病理切片以观察造模情况,剩余造模成功的大鼠65只。II组除3只用作病理切片对照观察造模情况外,无大鼠死亡。病理检查证实造模成功后,I组造模成功的大鼠(65只)随机分为5组:模型对照组、PDTC阳性对照组(PDTC组)、满天星异荭草苷高剂量组(IOAH组)、满天星异荭草苷中剂量组(IOAM组)、满天星异荭草苷低剂量组(IOAL组),每组13只。另外,II组设为正常对照组。具体分组如下:
A. 正常对照组 12只
B. 模型对照组 13只
C. PDTC阳性对照组(PDTC组) 13只
D. 满天星异荭草苷高剂量组(IOAH组) 13只
E. 满天星异荭草苷中剂量组(IOAM组) 13只
F. 满天星异荭草苷低剂量组(IOAL组) 13只
造模10w后,开始给药,PDTC组灌胃给予PDTC 150mg/kg,IOA高、中、低剂量组分别灌胃给予IOA 2g/kg、1g/kg、0.5g/kg,正常对照组和模型对照组则灌胃给予等量生理盐水,每天1次,每周称重1次,调整给药量,连续给药8w。另外,除正常对照组外,其余各组的大鼠每周仍继续给予50% CCl4油溶液2次。
第8周给药结束时,大鼠眼球取血,处死,快速取出肝脏,一部分 -80℃保存,另一部分用10% 福尔马林固定。
(2)检测指标
①肝组织病理学观察:常规病理检察;
②血清ALT,AST,ALP和GGT的活力;
③IL-1,IL-10,TNF-α ,TGF-β1的检测;
④SOD、GSH-Px和MDA的检测;
⑤HA,LN的检测;
⑥免疫组化检测肝组织NF-κB p65、TNF-α、MMP-9的表达;
⑦RT-PCR检测肝组织Col-Ⅰ和TGF-β1 mRNA的表达;
(3)实验结果:
1、肝组织病理检查情况
正常组大鼠肝小叶结构清晰且完整,肝细胞索以中央静脉为中心,向四周呈放射状排列,肝细胞未见变性、无炎细胞浸润, 未见病理性改变, 只有极少量细小的蓝色纤维。模型组大鼠汇管区炎性细胞、坏死细胞增多,肝小叶结构紊乱,细胞索排列紊乱,纤维间隔增厚,成纤维细胞大量增生,大量纤维生成,并可见假小叶形成。满天星异荭草苷组大鼠可观察到肝组织病理损伤比模型模型组明显减轻。
、血清ALT,AST,ALP ,GGT 活性
模型组大鼠血清ALT、AST均高于正常组老鼠,经药物干预后,PDTC组与IOAH、IOAM、IOAL组均能显著降低血清中ALT、AST的含量;模型组大鼠ALB/GLB(A/G)值低于正常组大鼠,给予药物后,PDTC组与IOAH组均能显著提高血清A/G值(p<0.05或p<0.01)。结果见表1。
3、血清LN、HA、MDA含量
模型组大鼠血清HA、LN、MDA均高于正常组大鼠,经药物干预后,PDTC组与IOAM、IOAH组均能显著降低血清中HA、LN、MDA的含量,其中IOAM、IOAL组还能显著降低血清中HA、MDA的含量(p<0.05或p<0.01)。结果见表2。
4、肝组织MDA、GSH-Px、SOD活性
模型组大鼠GSH-Px和SOD低于正常组大鼠,MDA则高于正常组大鼠,给予药物后,PDTC组与IOAH、IOAM组均能升高GSH-Px和SOD的含量,并降低MDA含量(p<0.05)。结果见表3。
、肝组织TNF-α、TGF-β1、IL-1、IL-10含量
模型组大鼠肝组织TNF-α、IL-1、TGF-β1含量均高于正常组大鼠,IL-10含量则低于正常组大鼠,经药物干预后,PDTC组与IOAH组均能显著降低肝组织中TNF-α、IL-1、TGF-β1的含量,并提高肝组织中IL-10的含量,其中,IOAM、IOAL组还能显著降低肝组织中IL-1的含量(p<0.05或p<0.01)。结果见表4。
、肝组织NF-κBp65、TNF-α、MMP-9的表达
正常对照组大鼠肝细胞胞浆内较少表达NF-κBp65、TNF-α和MMP-9,模型组大鼠肝组织细胞胞浆中的NF-κBp65、TNF-α和MMP-9的表达均显著高于正常组,用药后,PDTC组与IOAH、IOAM、IOAL组均能显著下调肝组织细胞胞浆中NF-κBp65、TNF-α和MMP-9的表达(p<0.01)。结果见表5。
7、肝组织Col-I和TGF-β1 mRNA的表达
模型组大鼠肝组织Col-I 和TGF-β1 mRNA的表达高于正常组大鼠,经药物干预后,PDTC与IOAH、IOAM、IOAL能明显降低Col-I 、TGF-β1 mRNA的表达(p<0.05)。结果见表6。
Claims (4)
1.满天星异荭草苷在制备治疗化学性肝纤维化药物中的应用,所述的满天星异荭草苷是按照以下方法制备而得的:
提取方法:干燥的满天星10 kg粉碎后,用80L的75%乙醇回流提取3 次,合并3次乙醇提取液,回收乙醇,得到乙醇提取物315.7g;乙醇提取物加入630ml蒸馏水摇匀成悬浮液,接着分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取,萃取方法简述如下:首先,用630ml石油醚萃取,弃石油醚液;接着,用630ml乙酸乙酯萃取,弃乙酸乙酯液;最后,用630ml正丁醇萃取,回收正丁醇,得正丁醇萃取物177.6 g;
纯化方法:正丁醇萃取物上D101 型大孔树脂,先用5倍量水洗脱后,再用10倍量90% 的甲醇洗脱,回收甲醇,得粗提物;将粗提物溶于甲醇,与等量硅胶拌样,上样于硅胶柱,以甲醇-乙酸乙脂-水不同比例即3:3:2; 4:3:2; 5:3:2; 6:3:2;7:3:2;8:3:2;9:3:2; 10:3:2,进行梯度洗脱;薄层色谱跟踪,合并相似馏分;合并用比例为4:3:2; 5:3:2;6:3:2;7:3:2的甲醇-乙酸乙脂-水洗脱的馏分,再经3次硅胶柱层析后再次合并相似馏分,回收洗脱剂,得淡棕色结晶28.3 mg。
2.所述的满天星异荭草苷是应用于治疗四氯化碳引起的化学性慢性肝损伤。
3.所述的满天星异荭草苷是应用于治疗四氯化碳引起的肝脏炎症。
4.所述的满天星异荭草苷是应用于治疗四氯化碳引起的化学性肝纤维化。
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Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160706 |
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |