CN105616414B

CN105616414B - 一种氧代哌嗪酰胺类化合物的新用途

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Publication number: CN105616414B
Application number: CN201410591542.0A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Xiangbei Welman Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Xiangbei Welman Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2014-10-28
Filing date: 2014-10-28
Publication date: 2019-03-05
Anticipated expiration: 2034-10-28
Also published as: CN105616414A

Abstract

本发明涉及氧代哌嗪酰胺类化合物在制备抑制PLK1活性的应用；所述氧代哌嗪酰胺类化合物选自式I化合物，其异构体、水合物或盐。本发明的氧代哌嗪酰胺类化合物在抑制PLK1活性方面，效果确切、毒副作用少、安全性好。与现有的抑制PLK1活性的化合物相比，本发明的氧代哌嗪酰胺类化合物由于是已知并被使用的化合物，原料易得，合成工艺成熟，杂质研究充分，质量控制成熟，因此，具有更加方便、易得等优点。

Description

一种氧代哌嗪酰胺类化合物的新用途

技术领域

本发明涉及一种氧代哌嗪酰胺类化合物的新用途，具体涉及该化合物抑制PLK1活性的新用途。

背景技术

式I所示的氧代哌嗪酰胺类化合物是一类已知的抗菌药物。其对多种革兰氏阴性菌均具有良好的抗菌作用，对许多厌氧菌也有抗菌作用。

一些抗菌药物长期作为抗肿瘤药物使用。例如丝裂霉素、阿霉素、表阿霉素、放线菌素D、博来霉素、平阳霉素、培洛霉素、柔红霉素等。CN1911236A还报道，四环素类抗菌药物(如强力霉素)除了抗菌以外，也具有抗肿瘤、抗炎症以及影响细胞存活等作用。

但是，除此之外的其他抗菌药物则未见报道有抗肿瘤的作用。

临床上，将抗菌药用于治疗癌症引起的感染是一种常用的做法。这是因为肿瘤的浸润导致人体免疫力的低下，以及抗癌药物的使用导致中性粒细胞减少，从而使得机体更容易受到细菌的感染，导致恶性肿瘤患者通常伴随着严重的细菌感染(梁新文,等,恶性肿瘤医院感染的临床分析,中国医院感染学杂志,2002,12(4),259-261)。具体的例子如：头孢哌酮与舒巴坦治疗肺癌并发阻塞性肺炎(药物流行病学杂志，2008年第17卷第4期，215-217)。

但是，在医药领域，抗菌药物与抗肿瘤药物又有着本质的区别。抗菌和抗癌分属不同的适应症。从作用对象来看，细菌具有细胞壁，属于外来致病生物；而肿瘤没有细胞壁，是机体自身产生的异常增生或病变，这决定了两种药物在作用机制方面也存在本质的区别。

式I所示的氧代哌嗪酰胺类化合物在临床上也用于抗感染治疗，包括恶性肿瘤患者的抗感染治疗，但它仍然发挥的是抗菌作用。而且它与以上的各种抗菌药物或抗肿瘤药物有所区别，其作用机制在于与细菌细胞膜上的PBPs蛋白结合，抑制细菌细胞壁的合成，促使细菌细胞凋亡。

Polo样激酶(Polo like kinase,PLK)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，而PLK1是Polo样激酶的一种亚型。其结构中具有N端和C端，通过使底物磷酸化而发挥其活性。现有研究表明，PLK1参与了细胞生长不同阶段的精密调控，是维持细胞周期正常运行的关键物质。例如：PLK1在细胞G2/M期转换过程中,可调节Cdc25、cyclin B、Wee1、Myt1等多种下游底物；PLK1在细胞中心体的成熟和分离过程中发挥着重要作用，影响ninein like protein(Nlp)和Kizuna等中心体相关蛋白的活性；PLK1作用于Mad3、Bub1、PICH等纺锤体结构监测点相关蛋白，保证细胞有丝分裂的正常进行。

通过抑制PLK1的活性，可以控制细胞的异常增殖，在治疗癌症、神经变性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病和免疫介导疾病等细胞增殖性疾病中均具有重要的意义。例如，Fan,Zheng et al.2005记载，通过显著抑制PLKl，能有效阻止肿瘤细胞的生长增殖。Lane and Nigg 1996记载，在蛋白水平抑制PLKl，可以达到细胞周期阻滞效应。LiuX,et al.Proc Natl Acad Sci 2003,100(10):5789–5794.记载，在体外，PLKl的消耗在癌细胞中强烈抑制细胞繁殖并降低癌细胞存活率，PLK1的敲除使得癌细胞被阻断在G2-M期，导致癌细胞凋亡。

现有技术中报道了一些抑制PLK1活性的药物，如：CN103435608A公开了一种吡啶并嘧啶类的PLK1抑制剂，CN103435594A公开了一种氨基喹唑啉类的PLK1抑制剂，CN103408546A公开了一种氨基嘌呤类的PLK1抑制剂，CN102174035A公开了一种芳香双酰肼类的PLK1抑制剂，CN101636399A公开了一种嘧啶并二氮杂卓类的PLK1抑制剂，CN101568539A公开了一种咪唑啉酮基氨基嘧啶类PLK1抑制剂，CN101541800A公开了一种蝶啶衍生物的PLK1抑制剂，但是这些药物均处于研发阶段，需要全新合成，原料不易得，原料药的质量控制也不成熟，另外，它们结构各异且没有明显的规律性，这导致难以通过现有化合物的结构预测出新的PLK1抑制剂。

通过对式I所示氧代哌嗪酰胺类化合物的研究，得到了一种有别于现有技术中的新用途。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种氧代哌嗪酰胺类化合物的新用途，目的之二在于为临床寻找一种抗癌药物的新选择。

本发明的一个技术方案是：氧代哌嗪酰胺类化合物在制备抑制PLK1活性的药物中的应用，所述氧代哌嗪酰胺类化合物选自式I化合物，其异构体、水合物或盐，

式I中，

R₁为C₁-C₆烷基；

R₂选自取代或未取代的C₁-C₆烷基，或，取代或未取代的苯基；

R₃为-CONH-R₄基团，其中，R₄选自式Ia或式Ib；

式Ia或Ib中，

Y为氧或硫；

R₅选自乙酰基、1-甲基-四唑基，或5-甲基-[1.3.4]噻二唑基；

R₆选自氢、甲氧基或-NH-CHO基团。

优选地，式I的R₁为乙基；R₂为羟乙基、苯基或羟基取代的苯基。

进一步优选，式I化合物选自以下式II～式VIII中的任一化合物：

所述药物中含有氧代哌嗪酰胺类化合物。

优选地，所述药物中还含有β-内酰胺酶抑制剂。

当所述药物中含有β-内酰胺酶抑制剂时：

优选地，所述药物中氧代哌嗪酰胺类化合物与β-内酰胺酶抑制剂的重量比为1：10～10：1；更优选的重量比为1：1～8：1；进一步优选的重量比为1：1，2：1，3：1，4：1，5：1，6：1，7：1或8：1。

优选地，所述β-内酰胺酶抑制剂为克拉维酸、舒巴坦，或者克拉维酸的异构体、水合物或盐，或者舒巴坦的异构体、水合物或盐。更优选地，所述β-内酰胺酶抑制剂为克拉维酸钾或舒巴坦钠。

进一步优选，所述药物中含有：式II化合物的钠盐和舒巴坦钠，式III化合物的钠盐和舒巴坦钠，式IV化合物的钠盐和舒巴坦钠，或者，式V化合物的钠盐和舒巴坦钠。

更进一步优选，所述药物中含有：重量比为1：1，2：1，4：1或8：1的式II化合物钠盐和舒巴坦钠，重量比为1：1，3：1，6：1或8：1的式III化合物钠盐和舒巴坦钠，重量比为2：1或10：1的式IV化合物钠盐和舒巴坦钠，或者，重量比为1：1，2：1，5：1或10：1的式V化合物钠盐和舒巴坦钠。

所述药物中，根据剂型的不同，可以不含辅料，也可以含有药学上适用的辅料。

例如：注射用冻干粉针剂中可以不含辅料，注射剂中可以含有氯化钠等等渗调节剂，片剂中可以含有制药领域常用的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂，等。所述填充剂可以选自淀粉、预胶化淀粉、糊精、葡萄糖、蔗糖、乳糖、乳糖醇、微晶纤维素、甘露醇、山梨醇或木糖醇；所述粘合剂可以选自羧甲基纤维素钠、羟丙甲基纤维素、乙基纤维素、聚维酮、淀粉浆、蔗糖、糖粉、胶浆、明胶、聚乙二醇；所述崩解剂可以选自交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠或淀粉；所述润滑剂可以选自硬脂酸镁、滑石粉或微粉硅胶。

说明：本发明中所说的比例均为重量比，且是指游离物或无水物的比例，不包括盐离子或结晶水。例如式III化合物的钠盐+舒巴坦钠(4：1)，是指按照式III化合物与舒巴坦计算，其重量比为4：1；又如式II化合物一水合物+舒巴坦钠(2：1)，是指按照式II化合物与舒巴坦计算，其重量比为2：1。

本发明中所说的抑制PLK1活性的药物，也可以称为PLK1抑制剂。

优选地，所述抑制PLK1活性的作用是治疗细胞增殖性疾病。

再优选地，所述细胞增殖性疾病选自癌症、自身免疫性疾病或炎性疾病。

进一步优选，所述细胞增殖性疾病选自前列腺癌、卵巢癌、泌尿生殖道癌、喉癌、白血病或囊性纤维化病。

本发明提供的氧代哌嗪酰胺类化合物的新用途具有以下优点：

1、本发明首次发现了现有的一类氧代哌嗪酰胺化合物具有抑制PLK1活性的作用，PLK1是Polo样激酶(Polo like kinase,PLK)的一种亚型激酶，其结构中具有N端和C端，通过使底物磷酸化而发挥调控细胞生长等方面的活性。PLK1抑制剂是一种可选择性地与PLK1激酶相结合从而阻碍PLK1激酶发挥活性的物质。

通过研究发现，式I的氧代哌嗪酰胺类化合物可以对PLK1激酶产生明显的抑制作用，但青霉素却没有类似的作用，其原因可能是2,3-二氧代-哌嗪甲酰胺结构与PLK1激酶的特异性结合导致了激酶的失活。这与式I氧代哌嗪酰胺类化合物的传统适应症和作用机制有着本质的区别。

2、发明人发现，氧代哌嗪酰胺类化合物通过抑制PLK1活性，可有效减少细胞的增殖,可用于治疗细胞增殖性疾病，如多种癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病等。扩大了现有药物的适应症，提供了临床用药的新选择。

3、发明人意外地发现，一些具有特定结构和立体构型的具体氧代哌嗪酰胺类化合物在150ng/ml的浓度内即可有效抑制PLK1活性，并可将肿瘤细胞增殖率控制在约60％或70％以下。

与单用氧代哌嗪酰胺类化合物相比，氧代哌嗪酰胺类化合物与β-内酰胺酶抑制剂进行组合显示出更好的效果，而在比例方面特别优选的组合则显示出更加优异的效果。

4、本发明的氧代哌嗪酰胺类化合物在抑制PLK1活性尤其是抗肿瘤方面，除了效果确切之外，还具有毒副作用少、安全性好等优点。

5、与现有的抑制PLK1活性的化合物相比，本发明的氧代哌嗪酰胺类化合物由于是已知并被使用的化合物，原料易得，合成工艺成熟，杂质研究充分，质量控制成熟，因此具有更加方便、易得等优点。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明涉及的氧代哌嗪酰胺类化合物(具有式I结构的化合物)属于已知化合物，可以通过商业途径或文献方法获得。例如，部分具体的氧代哌嗪酰胺类化合物的CAS号见表1：

表1：部分式I化合物的取代基和CAS号

R1

R2

R3

R4

R5

Y

R6

CAS号

备注

乙基

苯基

-CONH-R4

式Ia

/

氢

61477-96-1

式II化合物

乙基

对羟基苯基

-CONH-R4

式Ib

1-甲基-四唑基

硫

氢

62893-19-0

式III化合物

乙基

1-羟乙基

-CONH-R4

式Ib

1-甲基-四唑基

硫

甲氧基

76610-84-9

式IV化合物

乙基

对羟基苯基

-CONH-R4

式Ib

5-甲基-[1.3.4]噻二唑基

硫

氢

62939-46-2

式VI化合物

乙基

对羟基苯基

-CONH-R4

式Ib

乙酰基

氧

氢

62893-23-6

式VII化合物

乙基

对羟基苯基

-CONH-R4

式Ia

/

氢

65476-74-6

式VIII化合物

乙基

3,4-二羟基苯基

-CONH-R4

式Ia

/

-NH-CHO基团

98048-07-8

式V化合物

以下实施例1或2中的待测物、PLKl激酶、底物多肽、肿瘤细胞株、以及各试剂、材料、仪器均从商业途径购买，如Sigma公司、PerkinElmer公司、American Custom Chemicals公司、上海晶纯生化科技股份有限公司、中国科学院上海细胞生物研究所，等。

实施例1氧代哌嗪酰胺类化合物对PLK1激酶的抑制作用

1、待测物：本发明中式II～式VIII所示的化合物、阿莫西林、头孢呋辛、青霉素、舒巴坦、克拉维酸，它们的水合物和盐以及相关的组合物等。

2、试验方法：

1)制备各组待测物溶液：将DMSO溶于20nM的HEPES水溶液中，形成浓度20％的DMSO/HEPES溶液。将待测物进行分组(多个对照组、单独组、联合组)，分别取各组待测物，溶于20％的DMSO/HEPES中，分别得到各组待测物溶液，备用。分组情况以及得到的各组待测物溶液中待测物的最高浓度(对于联合组，是指组合物中式II～式VIII所示化合物的浓度；浓度均以化合物的游离物或无水物计，单位μg/ml)见表2。每组待测物溶液用20％的DMSO/HEPES溶液进行5倍浓度梯度的稀释，分别稀释为8个浓度梯度。

2)制备PLK1激酶液：取0.07653g 2-甘油磷酸二钠、0.025g Chaps和0.012g L-半胱氨酸，溶解于50ml 20mM的HEPES水溶液中，得到缓冲液I。将PLK1激酶用缓冲液I稀释，得到10nM的PLK1激酶液，备用。

3)制备PLK1底物多肽液：将133μl MgCl₂水溶液(1M)、1μl MnCl₂水溶液(1M)，以及9.867ml的步骤2)中的缓冲液I混合，得到缓冲液II。将底物多肽和ATP一起用缓冲液II稀释，得到含300nM底物多肽和10μM ATP的PLK1底物多肽液，备用。

4)反应：各组分别进行。方法是：将2μl步骤1)得到的待测物溶液、2μl步骤2)得到的PLK1激酶液在384孔白色测试板上混合。加入6μl步骤3)得到的PLK1底物多肽液，在室温下静置反应30分钟后，加入5μl 60mM的EDTA以终止反应。再加入5μl的4xDetection Mixture(购自PerkinElmer公司)，静置反应1小时后置于酶标仪(PerkinElmer公司)上读数(激发波长340nm，发射波长分别为615nm和665nm)。测定得到的数据使用GraphPad Prism软件进行评价。

3、试验结果的判断方法：

PLK1的抑制活性以50％的PLK1激酶被抑制时的待测物浓度(IC₅₀)表示，IC₅₀值越小则表示对PLK1激酶的抑制作用越强。IC₅₀值(ng/ml)归入以下5个范围：

A:IC₅₀≤25

B:25<IC₅₀≤50

C:50<IC₅₀≤150

D：150<IC₅₀≤250

E：IC₅₀>250

4、实验结果：表2列出了各组待测物的IC₅₀值级别(对于联合组，是指组合物中式II～式VIII所示化合物的IC₅₀值级别)。

表2各组待测物抑制PLK1活性的IC₅₀值

表2试验结果表明：与青霉素、阿莫西林、头孢呋辛、舒巴坦等不具有氧代哌嗪酰胺结构的抗生素相比，本发明的氧代哌嗪酰胺类化合物能有效抑制PLK1激酶活性。与单用氧代哌嗪酰胺类化合物相比，氧代哌嗪酰胺类化合物与β-内酰胺酶抑制剂的组合显示出更好的效果。

实施例2氧代哌嗪酰胺类化合物对肿瘤的抑制作用

下面以前列腺癌和卵巢癌为例，进一步说明本发明氧代哌嗪酰胺类化合物对细胞增殖性疾病，特别是肿瘤的治疗效果。

1、待测物处理：

待测物：本发明中式II～式VIII所示的化合物、阿莫西林、紫杉醇、舒巴坦，它们的盐和水合物以及相关的组合物等。

溶液配制：将待测物进行分组(多个对照组、单独组、联合组)，分别取各组中的待测物，先加入1.23ml蓖麻油，摇匀溶解，再加入1.23ml无水乙醇，摇匀溶解，分别制成各组待测物母液。分组情况以及得到的各组待测物母液中待测物的浓度(对于联合组，是指组合物中式II～式VIII所示化合物的浓度；浓度均以化合物的游离物或无水物计，单位为mg/ml)，具体见表3、4。

每次给药时取母液0.4ml，用0.9％NS稀释6倍，得到待测物稀释液。

2、肿瘤模型的建立：

实验动物：雌性BALB/cA裸小鼠，日龄35-40天，体重18-22g。分别建立前列腺癌模型和卵巢癌模型。

前列腺癌模型：采用人前列腺癌PC-3细胞株接种于裸小鼠皮下而建立。细胞接种量为3×10⁶，接种形成移植瘤后再在裸小鼠体内传3代后使用。

卵巢癌模型：采用人卵巢癌HO-8910细胞株接种于裸小鼠皮下而建立。细胞接种量为3×10⁶，接种形成移植瘤后再在裸小鼠体内传3代后使用。

具体方法：取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm³左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100～300mm³后，将动物进行随机分组，每组动物均为8只。除空白组外，各组情况与待测物分组情况相一致，具体见表3、4。前列腺癌模型动物与卵巢癌模型动物分别独立操作。

3、给药：

静脉给药，空白组给予蓖麻油，各对照组和各治疗组分别给予各组待测物稀释液。每周给药1次，共给药3周。给药剂量以每kg动物体重给予20ml的给药物质(20ml/kg)为依据，按照每只动物的体重进行调整。具体给药情况见表3、4。

4、数据收集和处理：

统计动物数量，称量动物体重，测量肿瘤直径，计算肿瘤体积，以相对肿瘤增殖率(RT)作为抗肿瘤活性的评价指标，RT值越小则抗肿瘤活性越强。并同时统计试验前后的动物存活率(RN)、动物体重变化率(RW)，作为评价安全性的指标，RN值高、RW值与空白组的值相比差别小，则说明安全性好。具体的计算公式为：

RT＝(T_治疗组/T_空白组)×100％。其中，

T＝V_t/V₀，V＝1/2×a×b²，

RN＝(N_t/N₀)×100％，

RW＝(W_t/W₀)×100％。

计算公式中各符号的意义如下：

a——肿瘤长度，b——肿瘤宽度，V——肿瘤体积，T——相对肿瘤体积，

V₀——治疗前(最初分组给药0天时)的肿瘤体积，

V_t——治疗后(21天后)的肿瘤体积，

T_治疗组——治疗组的相对肿瘤体积，

T_空白组——空白组的相对肿瘤体积，

N_t——治疗后(21天后)的动物数量，

N₀——治疗前(最初分组给药0天时)的动物数量，

W_t——治疗后(21天后)动物的体重，

W₀——治疗前(最初分组给药0天时)动物的体重。

5、实验结果：

5.1前列腺癌模型动物的试验结果见表3。

表3各组待测物对前列腺癌模型动物的影响

5.2卵巢癌模型动物的试验结果见表4。

表4各组待测物对卵巢癌模型动物的影响

表3、4试验结果表明：

与阿莫西林等不具有氧代哌嗪酰胺结构的抗生素相比，本发明的氧代哌嗪酰胺类化合物能有效抑制肿瘤细胞增殖(RT值小于60％或70％)。与单用氧代哌嗪酰胺类化合物相比，氧代哌嗪酰胺类化合物与β-内酰胺酶抑制剂的组合显示出更好的效果。

另外，本发明氧代哌嗪酰胺类化合物除效果确切外，还显示出较好的安全性(RN值高于紫杉醇，达到100％；各单独组和联合组的RW值与空白组相近，表明对体重影响小)。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，本领域技术人员可以对之作一些修改或改进。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明的内容。

Claims

1.氧代哌嗪酰胺类化合物在制备治疗癌症的药物中的应用，所述氧代哌嗪酰胺类化合物选自式II～式VIII中的任一化合物或其盐：

所述药物中含有所述氧代哌嗪酰胺类化合物，还含有β-内酰胺酶抑制剂；所述β-内酰胺酶抑制剂为舒巴坦，或者舒巴坦的盐；

所述癌症为前列腺癌或卵巢癌。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中含有氧代哌嗪酰胺类化合物和β-内酰胺酶抑制剂，二者的重量比为1：10～10：1。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述氧代哌嗪酰胺类化合物和β-内酰胺酶抑制剂的重量比为1：1～8：1。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述氧代哌嗪酰胺类化合物和β-内酰胺酶抑制剂重量比为1：1，2：1，3：1，4：1，5：1，6：1，7：1或8：1。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述β-内酰胺酶抑制剂为舒巴坦钠。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物中含有：式II化合物的钠盐和舒巴坦钠，式III化合物的钠盐和舒巴坦钠，式IV化合物的钠盐和舒巴坦钠，或者，式V化合物的钠盐和舒巴坦钠。