一种可促进血管形成与抗感染生物活性涂层及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医用多功能生物陶瓷涂层和纳米材料技术领域,具体涉及一种可促进血管形成与抗感染生物活性涂层及其制备方法和应用。
背景技术
钛及其合金具有耐蚀性好、化学稳定性强、比强度高、生物相容性优异等优点,被广泛用作人体硬组织修复与替换材料。据报道,钛及其合金优异的生物相容性和耐腐蚀性主要归因于其表面自然存在的一层氧化钛薄膜,但氧化钛属于生物惰性材料,不具备优异的生物活性和抗细菌感染的能力,植入体后不能与宿主骨形成化学结合,严重影响了植入效果,容易导致植入失败。研究表明:纳米材料相比于传统材料在促进骨细胞粘附、增殖和分化方面表现出明显优势;多孔材料,尤其是具有微米级孔径的材料也能显著促进细胞的粘附和增殖,且多孔材料在体内有利于新骨的内生长,增强新生骨和植入体之间的结合,加速患者康复。据此,研究者借助微弧氧化方法,在钛及其合金表面制备掺杂钙、磷元素的多孔状氧化钛涂层,研究结果显示此涂层能改善钛金属生物活性。近期研究表明通过微弧氧化法,可将人体所含微量元素锶和硅掺杂于多孔状氧化钛涂层中,但却另有研究表明此类元素可抑制骨细胞增殖,故综合掺杂后涂层的生物学性能还需进一步考证。为了提高多孔状氧化钛层抗菌性能,研究者通过微弧氧化法将锌、铜元素掺杂于其中,此法可增强涂层抗菌性能,但同时也会抑制成骨相关细胞的活性,影响其成骨功能。可见,通过微弧氧化法可以改善钛生物活性,提高其抗菌性,但是还需要进一步优化改良。
种植体植入体后,种植体周围新骨的形成,不仅与种植体生物活性和抗菌性能有关,而且与种植体周围血液供应也息息相关。因为种植体周围良好的血液供应既可以向损伤区域供应氧、各种营养物质,同时还可以将组织的代谢废物及时排除,这样有助于种植体周围新骨形成,甚为遗憾的是目前使钛及其合金表面具有促进血管形成能力的方法鲜有报道。钴元素在生物体微环境下可诱导局部缺氧环境的产生,继而促进缺氧诱导因子(HIF-1α)生成,产生一系列适应缺氧环境的变化,其中包括促进局部环境新生血管的生成。但是有研究者将其负载二氧化钛纳米管涂层却出现了细胞毒性,抑制细胞生长。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可促进血管形成与抗感染生物活性涂层及其制备方法和应用,该涂层同时具备高生物活性、成骨、抗感染和促进血管形成等多项功能。
为达到上述目的,本发明采用的技术方案为:
一种可促进血管形成与抗感染生物活性涂层,该涂层的主要成分为二氧化钛,并且在二氧化钛中掺杂有钙、磷、锶、钴、硅和氟元素,同时还掺杂有钠和/或钾元素;该涂层中各元素的质量分数为:钙3~18%、磷1~15.1%、锶0.5~7%、钴1.9~8.2%、硅1~9%、氟0.5~7.9%、钠和/或钾0.1~2.1%,余量为二氧化钛。
该涂层呈微米级多孔结构,孔径为2~4μm;该涂层表面呈纳米颗粒状,晶粒尺度为20~80nm;该涂层与基体的结合强度为38~55N。
所述的可促进血管形成与抗感染生物活性涂层的制备方法,其具体步骤为:
在电解液中,以钛或钛合金试样为阳极、不锈钢为阴极,采用脉冲电源对钛或钛合金试样进行微弧氧化处理,即在钛或钛合金试样的表层生成可促进血管形成与抗感染生物活性涂层;其中电解液是以水为溶剂,以钙盐、磷酸盐、锶盐、钴盐、硅酸盐和氟盐为溶质配制而成的,并且电解液中含有钠离子和/或钾离子。
所述的电解液中钙离子的浓度为0.02~0.50mol/L,磷酸根离子的浓度为0.02~0.30mol/L,锶离子的浓度为0.01~0.35mol/L,钴离子的浓度为0.02~0.70mol/L,硅酸根离子的浓度为0.03~0.50mol/L,氟离子的浓度为0.03~0.65mol/L。
所述的钙盐为氯化钙、醋酸钙和硝酸钙中的一种或几种任意比例的混合物;
磷酸盐为β-甘油磷酸钠和磷酸氢纳中的一种或两种任意比例的混合物;
锶盐为醋酸锶和硝酸锶中的一种或两种任意比例的混合物;
钴盐为醋酸钴和硝酸钴中的一种或两种任意比例的混合物;
硅酸盐为硅酸钠和硅酸钾中的一种或两种任意比例的混合物;
氟盐为氟化钠、氟化铵和氟化钾中的一种或几种任意比例的混合物。
进行微弧氧化处理时的具体参数条件为:脉冲电源的正压为250~420V、负压50~100V、频率为80~550Hz、占空比为15~75%,阴阳极板间距为10~20cm,电解液温度为4~15℃,处理时间为3~15min。
所述的可促进血管形成与抗感染生物活性涂层作为人工骨或牙种植体表面多功能涂层的应用。
所述的多功能涂层为具有生物活性、成骨功能、抗菌性能和促进血管形成功能的涂层。
相对于现有技术,本发明的有益效果为:
本发明提供的可促进血管形成与抗感染生物活性涂层,为掺杂有钙、磷、锶、钴、硅和氟元素并同时掺杂有钠和/或钾元素的二氧化钛涂层。该涂层与钛及钛合金基体结合紧密,在植入使用过程中不易剥落,能够与基体结合构建出具有良好机械和生物学性能的人体硬组织修复或替换器件。该涂层中钙、磷、锶和硅元素可显著促进造骨细胞黏附、增殖和分化,从而赋予涂层成骨性能;钴元素可诱导局部缺氧环境的产生,继而促进缺氧诱导因子生成,促进局部环境新生血管的生成,因此钴元素可使涂层具备促进血管生成的功能;此外,氟元素除了能提高骨细胞成骨功能之外,还能有效抑制细菌黏附和生长,并具有防止龋齿的功能,故氟元素使得涂层具备了抗菌的功能。综上所述,本发明提供的可促进血管形成与抗感染生物活性涂层具备良好的生物活性、生物相容性、成骨功能、促进血管形成和抗菌性等多重功能,能够作为人工骨或牙种植体表面的多功能涂层进行广泛应用。
本发明提供的可促进血管形成与抗感染生物活性涂层的制备方法,先配制好含有钙离子、磷酸根离子、锶离子、钴离子、硅离子和氟离子的电解液;然后以钛或钛合金为阳极,不锈钢为阴极,采用微弧氧化技术,一步法直接在钛或钛合金基体表面制备出可促进血管形成与抗感染生物活性涂层。该方法步骤简单、操作简便、重复性高、原料易得、价格低廉,适于工业化的大规模生产,具有很好的应用前景。而且本发明配制的用于微弧氧化处理的电解液成分简单、易于控制、不含易分解成分、工艺稳定,有利于涂层的大规模批量化生产。另外本发明提供的制备方法对基体材料的形状没有特殊要求,可适用于形状复杂的基体,有效扩大了本发明的使用范围。
附图说明
图1是实施例1制备的可促进血管形成与抗感染生物活性涂层表面形貌SEM图,其中a的放大倍数为5000倍,b的放大倍数为100000倍;
图2是实施例1制备的可促进血管形成与抗感染生物活性涂层的表面EDS能谱图;
图3是新西兰兔间充质干细胞在钛和实施例1制备的可促进血管形成与抗感染生物活性涂层的表面培养不同时间后的MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2)检测结果图;##表示相比于钛差异性p<0.01。
图4是革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌在钛和实施例1制备的可促进血管形成与抗感染生物活性涂层的表面培养24小时后的形貌图,其中a为钛,b为实施例1制得的涂层,放大倍数均为5000倍。
图5是革兰氏阴性菌大肠杆菌在钛和实施例1制备的可促进血管形成与抗感染生物活性涂层的表面培养24小时后的形貌图,其中a为钛,b为实施例1制得的涂层,放大倍数均为5000倍。
图6是新西兰兔间充质干细胞在钛和实施例1制备的可促进血管形成与抗感染生物活性涂层表面培养不同时间后,通过逆转录定量PCR检测相关成血管缺氧诱导因子(HIF-1α)和血管内皮细胞因子(VEGF)基因的表达情况;##表示相比于钛差异性p<0.01;其中a为HIF-1α,b为VEGF。
具体实施方式
本发明通过对微弧氧化电解液的调节与控制,获得钙、磷、锶、钴、硅、氟(氟元素具有增强骨细胞成骨、抗菌以及作为口腔材料时还能预防龋齿)和钠或钾元素掺杂多孔状氧化钛涂层,即本发明所述的可促进血管形成与抗感染生物活性涂层。该涂层同时具备高生物活性、成骨、抗感染和促进血管形成等多项功能。该涂层呈多孔状结构,孔径2~4μm,该涂层表面呈纳米粒状,尺度20~80nm,该涂层与基体结合紧密,结合强度38~55N;该涂层主要由二氧化钛构成,其中含钙、磷、锶、钴、硅和氟元素,并含有钠或钾元素,该涂层中钙元素的质量分数为3~18%、磷元素的质量分数为1~15.1%、锶元素的质量分数为0.5~7%、钴元素的质量分数为1.9~8.2%、硅元素的质量分数为1~9%、氟元素的质量分数为0.5~7.9%、钠和/或钾元素的质量分数为0.1~2.1%。
本发明提供的可促进血管形成与抗感染生物活性涂层的制备方法,包括以下步骤:在以去离子水为溶剂,由钙盐、磷酸盐、锶盐、钴盐、硅酸盐和氟盐组成的电解液中,以钛试样为阳极、不锈钢为阴极,采用脉冲电源在正压为250~420V、负压50~100V、频率为80~550Hz、占空比为15~75%以及阴阳极板间距为10~20cm的条件下对钛金属试样进行微弧氧化处理,维持电解液温度在4~15℃,处理时间3~15min,待反应结束后,即在金属试样的表层生成钙磷锶钴硅氟六元素掺杂多孔生物活性陶瓷层,即本发明的可促进血管形成与抗感染生物活性涂层;其中,电解液中钙离子的浓度为0.02~0.50mol/L,磷酸根离子的浓度为0.02~0.30mol/L,锶离子的浓度为0.01~0.35mol/L,钴离子的浓度为0.02~0.70mol/L;硅酸根离子的浓度为0.03~0.50mol/L;氟离子的浓度为0.03~0.65mol/L。所述的钙盐为氯化钙、醋酸钙、硝酸钙中的一种或多种;磷酸盐为β-甘油磷酸钠和磷酸氢纳中的一种或两种;锶盐为醋酸锶和硝酸锶中的一种或两种;钴盐为醋酸钴和硝酸钴的一种或两种;硅盐为硅酸钠和硅酸钾的一种或两种;氟盐是氟化钠、氟化铵和氟化钾中的一种或多种。
下面结合本发明较优的实施例和附图对本发明做进一步详细说明。
实施例1
在电解液(电解液中醋酸钙的浓度为0.2mol/L、β-甘油磷酸钠的浓度为0.1mol/L、醋酸锶的浓度为0.1mol/L、醋酸钴的浓度为0.4mol/L、硅酸钠的浓度为0.3mol/L、氟化钠的浓度为0.2mol/L)中,以钛片为阳极、不锈钢为阴极,采用脉冲电源,在正电压350V、负电压50V、频率80Hz、占空比15%、阴阳极板间距10cm、电解液温度10℃的条件下对钛片进行5min的微弧氧化处理,即在钛表面得到可促进血管形成与抗感染生物活性涂层。
实施例1制得的涂层表面SEM形貌如图1所示,从低倍形貌图(图1a)可知,该涂层呈宏观多孔状,孔径2~4μm;从高倍形貌图(图1b)可知该表面呈纳米粒状,晶粒直径为30~70nm。由图2的EDS谱线显示所得涂层中含有钛、氧、钙、磷、锶、硅、钴、氟和钠元素,其中钙、磷、锶、硅、钴、氟和钠元素的质量分数分别为8.2%、5.6%、2.5%、3.8%、4.6%、2.2%和0.4%。此外,该涂层与钛基体的结合强度为46.8N(划痕法)。
新西兰兔间充质干细胞在临床广泛使用的钛金属和实施例1所得涂层表面培养5h、24h、72h和168h后细胞MTT结果如图3所示。其中图3的实验方法为:将辐照灭菌的试件置于24孔细胞培养板内,取1月大的新西兰兔间充质干细胞以2×104个/ml、1ml/孔的密度接种于试件表面,细胞培养5、24、72、168小时后用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2)测定细胞活性,以显示其生长情况。从图3可以看出,所有培养时间点,细胞在实施例1所得涂层表面的吸光度值均明显高于钛金属,由此可见,相对于钛金属,实施例1所得涂层能显著增强间充质干细胞的粘附增殖。
革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌在钛金属和实施例1所得涂层表面培养24h后的表面形态分别如图4和图5所示。其中图4和图5的实验方法为:选用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌ATCC25923与革兰氏阴性菌大肠杆菌ATCC25922来考察样品的抗菌性,用接种环取适量的菌体用磷酸盐缓冲液将上述两种细菌分别配置成浓度为107和106个/ml的菌悬液;将辐照灭菌后的后样品置于24孔板中;随后,分别将体积为1ml的两种细菌悬液注入到放有实验样品的24孔板中,置于37℃的恒温培养箱中培养24h;用戊二醛固定,梯度酒精脱水并用真空干燥箱干燥,表面喷金后用场发射扫描电镜观察细菌形态。从图4和图5可以看出,在钛表面可观察到大量的细菌聚集,而在实施例1所得涂层表面仅有少量细菌,由此可见实施例1所得涂层能显著抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长,具有良好的抑菌作用。
间充质干细胞在钛金属和实施例1所得涂层表面培养7天后,其细胞HIF-1α和VEGF表达如图6所示。其中图6的实验方法为:(1)样品经辐照灭菌后,放在24孔板内,在每孔中加入1ml含8×104个细胞的培养基,培养7和14d;到达目标时间后,提取涂层表面细胞总RNA,使用分光光度计定量分析核酸浓度并调整使总RNA浓度均一化。(2)将RNA逆转录成cDNA。(3)使用Bio-RadiQ5Real-timePCR仪进行实时荧光定量反应,得到目标基因表达量。从图6可知,钛金属表面细胞的HIF-1α和VEGF相关成血管基因的表达没有明显差异性,而实施例1所得涂层表面细胞的HIF-1α和VEGF基因表达显著上调。说明了实施例1所得涂层对于细胞的HIF-1α和VEGF相关成血管基因的表达有明显的促进作用,植入体内过后可促进种植体周围血管形成,加快其与周围骨组织愈合。
实施例2
在电解液(电解液中醋酸钙的浓度为0.5mol/L、β-甘油磷酸钠的浓度为0.3mol/L、硝酸锶的浓度为0.3mol/L、硝酸钴的浓度为0.7mol/L、硅酸钠的浓度为0.5mol/L、氟化钾的浓度为0.5mol/L)中,以钛片为阳极、不锈钢为阴极,采用脉冲电源,在正电压350V、负电压50V、频率300Hz、占空比50%、阴阳极板间距20cm、电解液温度10℃的条件下对钛片进行5min的微弧氧化处理,即可在钛表面得到可促进血管形成与抗感染生物活性涂层。该涂层呈宏观多孔状,孔径2~3μm、表面纳米颗粒直径为30~70nm;涂层其中钙、磷、锶、硅、钴、氟、钾、钠元素的质量分数分别为10.5%、7.8%、4.3%、6.1%、7.5%、3.9%、0.1%和0.13%。此外,涂层与钛基体的结合强度为39.5N(划痕法)。
实施例3:
在电解液(电解液中醋酸钙的浓度为0.5mol/L、磷酸氢钠的浓度为0.3mol/L、硝酸锶的浓度为0.3mol/L、硝酸钴的浓度为0.7mol/L、硅酸钠的浓度为0.5mol/L、氟化钾的浓度为0.5mol/L)中,以钛片为阳极、不锈钢为阴极,采用脉冲电源,在正电压420V、负电压100V、频率300Hz、占空比50%、阴阳极板间距12cm、电解液温度4℃的条件下对钛片进行15min的微弧氧化处理,即可在钛表面得到可促进血管形成与抗感染生物活性涂层。该涂层呈宏观多孔状,孔径2~4μm、表面纳米颗粒直径为40~80nm;涂层其中钙、磷、锶、硅、钴、氟、钾、钠元素的质量分数分别为17.6%、15.1%、6.3%、7.5%、8.2%、7.9%、1.2%和0.8%。此外,涂层与钛基体的结合强度为38.5N(划痕法)。
实施例4:
在电解液(电解液中硝酸钙的浓度为0.2mol/L、β-甘油磷酸钠的浓度为0.1mol/L、硝酸锶的浓度为0.1mol/L、硝酸钴的浓度为0.4mol/L、硅酸钾的浓度为0.5mol/L、氟化钾的浓度为0.6mol/L)中,以钛片为阳极、不锈钢为阴极,采用脉冲电源,在正电压350V、负电压50V、频率100Hz、占空比20%、阴阳极板间距15cm、电解液温度10℃的条件下对钛片进行10min的微弧氧化处理,即可在钛表面得到可促进血管形成与抗感染生物活性涂层。该涂层呈宏观多孔状,孔径2~4μm、表面纳米颗粒直径为30~60nm;涂层其中钙、磷、锶、硅、钴、氟和钾元素的质量分数分别为9.6%、6.3%、3.5%、5.1%、6.5%、4.9%、2.1%。此外,涂层与钛基体的结合强度为50.5N(划痕法)。
实施例5:
在电解液(电解液中硝酸钙的浓度为0.02mol/L、β-甘油磷酸钠的浓度为0.02mol/L、硝酸锶的浓度为0.01mol/L、硝酸钴的浓度为0.05mol/L、硅酸钾的浓度为0.09mol/L、氟化钾的浓度为0.05mol/L)中,以钛片为阳极、不锈钢为阴极,采用脉冲电源,在正电压250V、负电压50V、频率400Hz、占空比20%、阴阳极板间距10cm、电解液温度5℃的条件下对钛片进行5min的微弧氧化处理,即可在钛表面得到可促进血管形成与抗感染生物活性涂层。该涂层呈宏观多孔状,孔径2~3μm、表面纳米颗粒直径为23~50nm;涂层其中钙、磷、锶、硅、钴、氟和钾元素的质量分数分别为3.4%、1.5%、0.7%、1.3%、2.1%、0.5%、0.8%。此外,涂层与钛基体的结合强度为54.6N(划痕法)。
实施例6:
在电解液(电解液中醋酸钙的浓度为0.03mol/L、硝酸钙的浓度为0.03mol/L、β-甘油磷酸钠的浓度为0.02mol/L、磷酸氢钠的浓度为0.02mol/L、硝酸锶的浓度为0.02mol/L、醋酸锶的浓度为0.02mol/L、硝酸钴的浓度为0.02mol/L、硅酸钾的浓度为0.09mol/L、氟化钾的浓度为0.05mol/L)中,以钛片为阳极、不锈钢为阴极,采用脉冲电源,在正电压300V、负电压100V、频率550Hz、占空比50%、阴阳极板间距10cm、电解液温度15℃的条件下对钛片进行10min的微弧氧化处理,即可在钛表面得到可促进血管形成与抗感染生物活性涂层。该涂层呈宏观多孔状,孔径2~4μm、表面纳米颗粒直径为25~55nm;涂层其中钙、磷、锶、硅、钴、氟和钾元素的质量分数分别为4.6%、2.3%、1.4%、1.1%、1.9%、0.6%、0.7%。此外,涂层与钛基体的结合强度为43.8N(划痕法)。
实施例7:
在电解液(电解液中氯化钙的浓度为0.03mol/L、β-甘油磷酸钠的浓度为0.02mol/L、醋酸锶的浓度为0.02mol/L、硝酸钴的浓度为0.02mol/L、醋酸钴的浓度为0.02mol/L、硅酸钠的浓度为0.09mol/L、硅酸钾的浓度为0.09mol/L、氟化钾的浓度为0.35mol/L、氟化钠的浓度为0.3mol/L)中,以钛合金片为阳极、不锈钢为阴极,采用脉冲电源,在正电压400V、负电压80V、频率300Hz、占空比75%、阴阳极板间距20cm、电解液温度10℃的条件下对钛合金片进行15min的微弧氧化处理,即可在钛合金表面得到可促进血管形成与抗感染生物活性涂层。该涂层呈宏观多孔状,孔径2~4μm、表面纳米颗粒直径为30~65nm;涂层其中钙、磷、锶、硅、钴、氟、钾和钠元素的质量分数分别为3.5%、1.9%、1.4%、3.1%、3.6%、3.3%、1.2%和1.1%。此外,涂层与钛基体的结合强度为40.6N(划痕法)。
实施例8:
在电解液(电解液中氯化钙的浓度为0.3mol/L、β-甘油磷酸钠的浓度为0.2mol/L、醋酸锶的浓度为0.35mol/L、硝酸钴的浓度为0.2mol/L、硅酸钠的浓度为0.03mol/L、氟化铵的浓度为0.03mol/L)中,以钛合金片为阳极、不锈钢为阴极,采用脉冲电源,在正电压380V、负电压70V、频率200Hz、占空比40%、阴阳极板间距18cm、电解液温度8℃的条件下对钛合金片进行3min的微弧氧化处理,即可在钛合金表面得到可促进血管形成与抗感染生物活性涂层。
实施例可以例举许多,限于篇幅,这里不一一列出,总之,在本发明提供的范围内,利用微弧氧化技术可以在钛及钛合金基体表面得到具有高结合强度和结构稳定性的可促进血管形成与抗感染生物活性涂层。
与现有的通过微弧氧化技术获得的氧化钛涂层相比:本发明提供的可促进血管形成与抗感染生物活性涂层具有高的结合强度,有助于其有效植入使用;该涂层呈微米级结构,孔径2~4μm,该涂层表面呈纳米颗粒状,晶粒尺度20~80nm;该涂层与基体结合紧密,结合强度为38~55N;该涂层主要由二氧化钛构成,其中含钙、磷、锶、钴、硅和氟元素,并含有钠和/或钾元素,该涂层中钙元素的质量分数为3~18%、磷元素的质量分数为1~15.1%、锶元素的质量分数为0.5~7%、钴元素的质量分数为1.9~8.2%、硅元素的质量分数为1~9%、氟元素的质量分数为0.5~7.9%、钠和/或钾元素的质量分数为0.1~2.1%。该涂层可显著促进间充质干细胞的成骨功能,可促进新骨形成,抑制细菌黏附和和生长,促进血管生成。从而使该涂层同时具备高生物活性、抗感染和促进血管形成等多项功能,可作为人工骨、髋关节或牙种植体及其他医用种植体表面的多功能涂层进行应用。